厦门免费医学论文发表投稿-G蛋白偶联受体HCAR3与选择性激动剂的复合结构揭示了配体识别和选择性的基础

方业，张志一，张冰浩，李欣宇，嘉熙邓，钱妙，佩若宁，云林池，耿晨，吴长松，钱王，徐乐之，凝杰公，[ ... ],杨度[ 查看全部 ]

 

介绍

羟羧酸受体（HCAR）由三种亚型组成：HCAR1、HCAR2和HCAR3，均属于A类G蛋白偶联受体（GPCR）家族[1,2]。HCARs在维持稳态和调节基本生物过程方面发挥关键作用，通过结合Gi蛋白，从而抑制腺苷酸环化酶活性并降低细胞质cAMP水平[3,4]。作为代谢中的关键调节因子，HCAR3在多种细胞类型中广泛表达，包括脂肪细胞、免疫细胞和肠道上皮细胞[5,6]。一般而言，HCAR3被其内源性3-羟基辛酸激活，已被证明会提高高密度脂蛋白和胆固醇水平，同时减少巨噬细胞泡沫细胞的形成，以缓解动脉粥样硬化[7–9]。此外，HCAR3还能调节葡萄糖代谢和脂肪酸的β氧化，因此被评估为治疗糖尿病和胰岛素抵抗的潜在靶点。除了代谢调控外，HCAR3的表达水平与结直肠癌和乳腺癌密切相关，因此HCAR3被认为是这两种癌症的潜在治疗靶点[10,11]。

 

HCAR2在HCAR家族中与HCAR3序列相似度最高，被认为是调节脂质异常的分子靶点，由内源性配体3-羟基丁酸激活[12,13]。HCAR3和HCAR2在脂质代谢和炎症中具有相似功能，通过促进ERK1/ERK2的磷酸化，这是抑制脂解的关键步骤。然而，朗格汉斯细胞和角质细胞中HCAR2的活化会触发血管扩张性前列腺素释放，导致皮肤冲洗[14,15]。与HCAR2相比，活化HCAR3能有效控制脂质水平，同时避免潮红的副作用，使其成为更有前景的血脂异常治疗靶点[16,17]。然而，HCAR3与HCAR2配体偏好的结构机制仍不明确。

 

Acifran是一种临床使用的药物，主要靶向HCAR2（EC）。50= 10−5.7M）和HCAR3（EC50= 10−4.7M），用于治疗高甘油三酯血症、2型糖尿病和代谢综合征[18,19]。acifran对HCAR2的亲和力高于HCAR3，强调了理解这一差异结构基础的必要性，为HCAR3选择性药物开发提供了见解。基于阿西法兰的化学结构，已开发出两种HCAR3选择性全激动剂IBC293和化合物6O（6O）[16,17]。IBC293和6O对HCAR3的亲和力至少高出100倍。另一种天然的HCAR3选择性化合物D-苯基乳酸（PLA）存在于发酵食品中，由人体肠道乳酸菌产生，其功能是促进人体单核细胞迁移，可能促进抗炎和免疫调节作用[20]。这些化学物质的发现为进一步探索HCAR3在脂质疾病治疗中的药理和治疗潜力提供了宝贵工具，同时避免了HCAR2活化带来的副作用。阐明这些HCAR3激动剂的结合方式和药理学特性，有助于高亲和力、低副作用药物的开发。最近，已报道了多种HCAR3与3-羟基辛酸、烟酸、5c化合物[21]、acifran[22]结合的冷EM结构，以及与配体GSK256073、Acipimox[2]、MK-1903和SCH900271结合的HCAR2的冷EM结构[23]。这些研究为HCAR3和HCAR2的配体识别和受体激活机制提供了宝贵见解。然而，HCAR3和HCAR2的结构特征和配体偏好需要更多数据支持，这有望加速高亲和力HCAR3选择性药物的开发。

 

本研究中，我们解析了与选择性激动剂6O、PLA和IBC293结合的人类HCAR3-Gi的冷冻EM结构，以及与非选择性激动剂acifran结合的人类HCAR3-Gi和HCAR2-Gi的结构。结合结构分析、分子动力学（MD）和诱变结果，这些结构揭示了HCAR3和HCAR2的配体识别和选择性机制。我们还分析了HCAR3与非活性HCAR2的活性机制。这些结构信息为HCAR3特异性激动剂的优化和设计提供了合理基础。

 

结果

HCAR3-Gi 配合物和 HCAR2-Gi 复合物的整体结构

为了获得稳定的HCAR3和HCAR2复合物，我们在Sf9昆虫细胞系中与Gαi1、Gβ1和Gγ2异三三聚体共表达受体。这些复合物随后用激动剂6O、PLA、IBC293和acifran进一步纯化，并用稳定抗体scFv16组装。通过低温电子显微信号数据收集和分析，获得了HCAR3和HCAR2-Gi1-scFv16配合物的五个电子密度图谱，分辨率分别为3.31 Å（6O-HCAR3）、3.05 Å（PLA-HCAR3）、3.26 Å（IBC293-HCAR3）、3.18 Å（acifran-HCAR3）和2.72 Å（acifran-HCAR2）（见图1A和S1–S5）。配体、直立囊、Gi蛋白界面及其他结构域的电子密度表现出高质量。基于清晰的密度图（图1B–1F）构建了精确的原子模型。映射到模型的FSC曲线表明模型贴合良好，提供了详细的原子信息以供相互作用分析（见S6图）。HCAR3和HCAR2结构表现出典型的七层跨膜螺旋拓扑，类似于其他A类GPCRs[24–27]，而胞外N端（0–16）、螺旋VIII（301–310）和胞内C端（311–387）则未出现在电子密度图谱中，显示其高度柔韧性。

 

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图1。 激动剂结合的HCAR3-Gi1和HCAR2-Gi1复合物的冷电磁结构。

 

（A）激动剂对HCAR的选择性示意。（男至女）在6O （B）、PLA （C）、IBC293 （D）、阿西法兰（E）和HCAR2-Gi1复合物存在下，HCAR3-Gi1复合物在含阿西法兰（F）存在下，低温电磁图谱和模型的动画表现。激动剂以棒状表示表示，对应的电子密度以灰色网格表示。地图和结构模型按亚基着色：淡紫色红色，6O-HCAR3;板岩蓝，PLA-HCAR3;中海绿色，IBC293-HCAR3;道奇蓝，ACIFRAN-HCAR3;浅色鲑鱼，acifran-HCAR2;浅灰色，Gαi;浅蓝色，Gβ;浅粉色，Gγ;粗木，scFv16;浅绿色，60;青色，解放军;卡其色，IBC293;李子、水红（HCAR3）;中等海蓝宝石，acifran（HCAR2）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.g001

 

HCAR3配体结合袋

与ECL1和ECL3一起，ECL2和N端紧密堆叠，几乎完全覆盖HCAR3中的直构结合囊，将囊袋与细胞外溶剂分离（S7A图）。这一特征在之前的HCAR2结构中也曾观察到[2,28]。四种激动剂适合正体结合囊，而激动剂则表现出明显的化学结构，唯独羧基部分保守（见图2A和S7B）。四种激动剂与HCAR3之间的保守相互作用包括保守羧基基团与Y284的极性相互作用7.43以及激动剂芳香基团与F107的π–π堆叠3.32，暗示F1073.32以及Y2847.43在激动剂识别和受体活性调控中的关键作用。观察到6O、PLA、acifran和R111羧基团间存在盐桥3.36.此外，S17945.52与6O、PLA和acifran形成氢键，而IBC293则缺乏与R111的相互作用3.36以及S17945.52，表明R1113.36以及S17945.52在HCAR3中，这些基因可能既不保守，也不是配体识别的必需。这一现象与之前强调保守R111的HCAR2文章不同3.36在配体识别与受体激活方面[28,29]。观察到疏水性残基之间存在广泛的疏水接触和范德华相互作用（V832.60，W9323.50，V1033.28， L1043.29分别是6O的噻吩基、PLA的苯基和水糖的苯基、异丙基和IBC293的芳香双环，从而促进配体更好地适入直立囊（见图2B和S8A–S8D）。额外的噻吩基团与L30相互作用1.35， L341.39， F2777.36，以及L2807.39使6O在口袋中更稳定地结合（S9A图）。通过单一突变验证了配体识别和受体激活中的关键作用，其中F1073.32A和Y2847.43突变体显著降低了HCAR3的激活，而突变体的细胞表达水平与野生型相当（见图2C和S9B–S9D）。此外，不同的配体相互作用氨基酸组成表明HCAR3对四个配体采用了不同的识别模式。

 

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图2。 活性HCAR3的正固结合囊，涵盖6O-、PLA-、IBC293-及acifran结合型。

 

（A）在6O、PLA、IBC293和acifran存在下，HCAR3结合囊的垂直横截面。（B）与6O（浅绿色）、PLA（青色）、IBC293（卡其色）和acifran（李子）在HCAR3中相互作用的关键残基。（C）针对HCAR3突变体的关键残基单点突变的cAMP检测浓度-响应曲线。数据以SEM±手段的形式呈现。实验以三份形式进行。该图的基础数据可在S1数据中找到。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.g002

 

不同激动剂中HCAR3的识别机制

为更好地理解6O、PLA、IBC293和acifran的亲和力和结合态差异，我们比对了四个配体结合的HCAR3结构。四种激动剂均位于HCAR3直立结合囊中（S10A图）。值得注意的是，在HCAR3直立结合囊中观察到两个疏水区，包括由TM2和TM3残基组成的区域1（R1）以及由TM1和TM7残基组成的区域2（R2）（图3A）。

 

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图3。 比较6O-、PLA-、IBC293-及acifran-HCAR3结构中R1和R2构象。

 

（A） R1（大圆）和R2（小圆）构象的表面表示。结构和激动剂的颜色不同。浅绿色和淡紫色，6O-HCAR3;青蓝色和板岩蓝，PLA-HCAR3;卡其色和中海绿色，IBC293-HCAR3;李子蓝和道奇蓝，ACIFRAN-HCAR3。（B，C）对6O和acifran-HCAR3结构之间R1和R2残基的详细比较。（D，E）IBC293和acifran-HCAR3结构间R1和R2残基的详细比较。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.g003

 

表面等离子体共振检测显示，高度亚型特异性的激动剂6O在这四个配体中具有最高的疗效（S11A–S11D，见图）。为解释为何6O结合的化合物HCAR3亲和力最高，我们比较了6O结合和acifran结合的HCAR3结构。阿奇法兰的苯基层同时与F107形成π–π相互作用3.32并浅插入R1。与acifran不同，60的中心吡嗪部分与F107相互作用3.32通过π–π堆叠，两个噻吩基团占据了疏水区R1和R2（见图3B、3C和S10B）。当聚焦R1时，6O的噻吩基层深度嵌入R1，导致V83的1.1–2.5 Å运动2.60，Y862.63，以及V1033.28以及W93的惊人5.4埃换挡23.50通过疏水相互作用（图3B）。这些残基的移动导致R1在6O-HCAR3结构中闭合（S10C图）。此外，另一个6O的噻吩基层与L30形成疏水性相互作用1.35， L341.39，以及L2807.39在R2中，导致排量为2.0–3.0 Å。与F277的5.4 Å下行一起7.36R2形成了沟槽状结构，紧密包裹噻吩基团，类似于R1（图3C和S10D）。总之，6O对HCAR3的高亲和力源于广泛的疏水相互作用以及完全占据直立结合囊的R1和R2，而acifran仅占据R1。

 

与其他三种激动剂的结合体式不同，IBC293在结合囊中采用了整体平面体式。与阿西法兰相比，IBC293的骨架由芳香双环（苯二甲唑）组成，具有相当的刚性。更强的刚性阻止了IBC293的羧基与R111形成盐桥3.36而Acifran则可以弯曲以促进其羧基与R111之间的极性相互作用3.36 (第10季E，见图）。一贯地，cAMP检测结果显示R1113.36突变几乎未干扰IBC293对HCAR3的激活，而突变几乎消除了acifran的结合（见图2C和S10F）。与阿奇法门不同，IBC293的苯二氮卓唑与F107 3形成π–π相互作用.R1 的 32 转，引发 F107 的旋转3.32 (图3D和S10B）。V832.60由于IBC293的异丙基部分，向外移动了5.7埃，形成了松散堆积的R1（见图3D和S10G）。此外，Y2847.43为更好地与R2中IBC293羧基相互作用，转移了4.0埃。2.3–2.7 Å的位移也出现在L34残基中1.39以及L2807.39，通过疏水相互作用实现（见图3E）。总之，IBC293因其独特的主链和与F107的相互作用而具有独特的结合姿态3.32.

 

HCAR3与HCAR2配体选择性的机制

在前一节中，我们分析了HCAR3配体识别机制的差异及其对结合亲和力的影响。值得注意的是，IBC293、6O和PLA选择性结合于HCAR3，但不结合HCAR2，促使对其特异性分子基础进行进一步研究。

 

我们首先比对了结合于含有环状化学基体（烟酸、化合物5c、阿西法兰、IBC293、6O、PLA）的HCAR3结构，以总结HCAR3配体识别特征（图4A）[21]。比对结果揭示了参与配体结合的关键残基，包括F1073.32R1113.36，S17945.52，Y2847.43.烟酸、PLA、6O和acifran也采用了类似的结合态，其羧基与R111相互作用3.36以及Y2847.43.有趣的是，IBC293采用了“楔形”横向取向，插入R1，其羧基与R111缺乏极性相互作用3.36.然而，R1113.36与报告的HCAR2结构中的所有配体相互作用。因此，我们比较了acifran-HCAR2和acifran-HCAR3结构（~100倍亲和力差异，S11D和S12A见图），观察到配体-受体相互作用和疏水沟（R1）相似，而HCAR3的结合口袋更大（见图4B、S12B和S13）。在HCAR2，L83中2.60（V832.60在HCAR3中）和M1033.28（V1033.28）具有较大的侧链，并收缩了R1的体积（见S12C图）。W9323.50， N862.63（Y862.63）和W9123.48（第91季23.48）朝向acifran，使R1紧密包裹配体（S12D图）。此外，L1073.32（F1073.32）在HCAR2和HCAR3的配体识别中起到了关键作用。阿奇法兰的苯环因与F107的π–π共轭而发生了64.5°的旋转3.32在HCAR3中，这促进了Acifran苯基层在HCAR2中R1区域的更深插入（S12C见图）。同源突变实验验证了这些残基的重要性（S12E见图）。MD模拟还表明，acifran在HCAR2口袋中的稳定性高于HCAR3（见S12F图）。

 

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图4。 HCAR3与HCAR2配体选择性的结构基础。

 

（A）叠加的HCAR3激动剂烟酸（PDB：9JID）、化合物5c（PDB：8JEI）、acifran、IBC293、6O、PLA及配体相互作用残基。（B）HCAR2直构囊的表面表示，以及叠加的HCAR2和HCAR3直立囊。结构和激动剂颜色不同。中等海蓝宝石和浅鲑鱼，acifran-HCAR2;李子蓝和道奇蓝，acifran-HCAR3。蓝色，HCAR2表面;黄色，HCAR3表面。（C–E）HCAR2残基与6O、IBC293、PLA的潜在冲突。（F–H）HCAR2和HCAR3配体稳定性评估。RMSD值为原始（浅色）和平滑（10纳秒移动平均，深色）。红色虚线为三条复制轨迹的平均RMSD值。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.g004

 

HCAR2囊明显小于HCAR3，这很可能解释了此前报告IBC293、6O和PLA与HCAR3相较于HCAR2的亲和力差异为100至1000倍。在HCAR2中，N862.63与W91形成极地相互作用23.48，导致W9123.48在R1上起盖子作用，从而缩小R1尺寸并稳定TM2构象。额外的6O氮碳连接剂需要更柔软的TM2细胞外侧和松散填充的R1以适应，这可能导致与L83发生冲突2.60以及N862.63HCAR2的结合（见图4C）。由于IBC293的刚性，IBC293-HCAR3与无效-HCAR2之间的排列也观察到类似的碰撞（见图4D）。此外，R2被6O的噻吩基团占据，但在HCAR2的直立囊中缺失。这两种现象可能归因于HCAR2无法容纳大型6O（S14A图）。与L83的潜在冲突2.60也在PLA-HCAR3中观察到（图4E）。此外，6O、IBC293和PLA与F107形成π–π相互作用3.32在HCAR3中，而对应的L1073.32在HCAR2中缺乏，导致配体稳定性降低。同源突变实验进一步支持了83残基差异的重要性2.60, 862.63, 9123.48, 1073.32 (S14B–S14D，见图）。MD模拟显示，结合HCAR3与HCAR2时，6O（图4F）、IBC293（图4G）和PLA（图4H）的RMSD存在差异，表明这三种配体在HCAR3的正构囊中表现出比HCAR2更高的稳定性。

 

总之，残基107的相互作用3.32（F/L）与配体影响了其结合亲和力，而由残基形成的直立囊体积差异为832.60（V/L），862.63（Y/N），以及9123.48（S/W）对6O、IBC293、PLA对HCAR3的选择性有贡献，而非HCAR2。

 

HCAR3的激活机制

迄今为止，尚无无非活性HCAR3结构的报告。由于HCAR3和HCAR2序列同源性96%，非活性状态HCAR2结构（PDB编号：7ZL9）被用于分析HCAR3的激活机制[29]。

 

我们将6O-HCAR3、PLA-HCAR3和IBC293-HCAR3的结构与非活性状态的HCAR2结构进行对比分析（S15A图）。与非活性HCAR2相比，这些受激动剂结合的HCAR3结构在其跨膜螺旋中表现出明显的向外位移：TM7向外移动~6.8 Å（6O-HCAR3）、5.7 Å（PLA-HCAR3）和3.3 Å（IBC293-HCAR3）（S15B图）。值得注意的是，TM7位移形成了一个结构位，容纳Gi α5螺旋插入，从而促进HCAR3-Gi复合物的形成;而在非活性的HCAR2中缺失该位位则可能导致TM7与Gi α5螺旋间的空间碰撞（S15C图）。

 

进一步分析显示了额外的螺旋重排：在TM5中，胞外末端位移了~8.5 Å（6O-HCAR3）、6.7 Å（PLA-HCAR3）和3.4 Å（IBC293-HCAR3），而细胞内端分别移动了~5.3 Å、5.1 Å和6.0 Å（见图）。同样，TM6表现出~2.6 Å、0.7 Å和1.8 Å的细胞外位移，同时细胞内位移为~1.9、1.8和0.9 Å（见图16B）。这些协调的运动表明激动剂结合后存在整体构象重组。

 

为了研究活化信号从直立结合口袋向G蛋白偶联界面的变构传递，首次分析了位于配体结合口袋附近且含有“切换开关”残基的“CWxP”基序。有趣的是，F2446.48替换了W6.48在HCAR3和HCAR2中，这在δ分支GPCRs（包括HCAR家族）中很常见[30]。与非活性HCAR2、F244相比6.48采用中等排水量，配合C2436.47以及P2466.50取自“CWxP”主题（S16C图）。同样，“PIF”图案由P200组成5.50I1153.40和F2406.44，发生了由激动剂结合引起的中等残基移动（S16D见图）。值得注意的是，位于直立囊基部的“CWxP”和“PIF”基序发生了中等程度的构象变化，激活信号“放大”，并在位于G蛋白界面的“NPxxY”和“DRY”基序中诱导了更大规模的构象重排。在HCAR3和HCAR2中，D2907.49替换了N7.49在“NPxxY”主题中。根据序列比对，18%的A类GPCRs会出现这种替代。天冬氨酸与天冬氨酸的差异可能与下游蛋白质招募不同有关[31]。“NPxxY”基序中的另外两个残基，P2917.50以及Y2947.53，沿螺旋轴旋转，导致TM7细胞质端移动，以更好地适应G蛋白的耦合（S16E图）。此外，Y294 的较大旋转异位移7.53与R125产生的静电相互作用3.50从6O和PLA结合的HCAR3中的“干”基序，打破D124之间的离子锁3.49以及R1253.50该项目稳定了非活性HCAR2中的非活性构象[32]。有趣的是，Y294的位移7.53以及R1253.50在结合IBC293的HCAR3中无显著性（见S16F见图）。总体来看，与非活性HCAR2相比，关键基序在6O-、PLA-和IBC293结合的HCAR3和HCAR2中发生了类似的位移，基序密度表现良好（见图S17），表明HCAR3采用了典型的A类GPCR激活机制。这些构象变化打开了跨膜结构域（TMD）腔，使α5αi螺旋嵌入HCAR3的TMD核心。

 

讨论

HCAR3在脂肪细胞和免疫细胞中表达，是脂质代谢和免疫调控的潜在药物靶点。我们确定了HCAR3-Gi复合物的四种冷电显微结构，具有高度选择性的激动剂6O、PLA、IBC293和选择性较低的激动剂阿西法兰。冷离子电磁结构显示，HCAR3直立囊中两个疏水区R1和R2占据6O高亲和力结合的主要因素。我们还阐明了IBC293与其他HCAR3配体不同于HCAR3独特结合态的机制。此外，HCAR2无法识别HCAR3特异性激动剂化合物6O、PLA和IBC293的机制。F/L1073.32是最关键的残基决定了HCAR2与HCAR3之间的配体选择性，以及V/L832.60，Y/N862.63， S/W9123.48确定这两种受体之间的口袋大小差异（S18图）。

 

有趣的是，3.32位位的残基大多被报道在其他A类GPCR配体识别中起关键作用。大多数胺能受体都保守了D3.32与配体形成极性相互作用以稳定配体结合[33]。非极性残基3.32，例如，F3.32以及M3.32在前列腺素受体中，DP2和EP2分别参与疏水结合囊的形成及配体的疏水相互作用[34,35]。然而，很少有报道指出该残留物3.32同源受体家族的差异可能影响配体选择性。我们的结果显示，F/L1073.32在HCAR3/HCAR2中，具有配体识别和配体选择性双重功能，为特定位点如何影响A类GPCR配体结合提供了补充见解。

 

本研究报告了acifran与HCAR3-Gi和HCAR2-Gi复合物的亲和力差异。其基本机制依赖于直立体结合囊中R1区域的残基差异，尤其是影响配体-受体相互作用和残基的107（F/L）残基，影响口袋大小的83（L/V）、86（N/Y）、91（W/S）。铃木及其同事最近也报告了HCAR3和HCAR2结构与acifran结合[22]。我们强调了他们与我们的acifran-HCAR3-Gi复合物（PDB编号：8IHJ）之间的图谱比较。与选择性和配体阿西法兰相关的残基的电子密度在我们的图谱中更为清晰，便于确定苯环的取向（见S19A图）。此外，我们的图谱对ECL1和ECL2发夹区域的密度更为完整，使我们能够更好地定义侧链（见S19B和S19C图）。此外，还有86个残基2.63, 9123.48, 1033.28，以及17845.51我们特别阐明了83位点中acifran选择性与残基差异密切相关的结构机制2.60, 862.63, 9123.48, 1073.32. 我们的发现为铃木及其同事报告的结果提供了宝贵且前瞻性的补充。

 

总体而言，我们的研究为设计高亲和力、高选择性的HCAR3配体提供了见解，有助于开发低副作用、靶向HCAR3但不针对HCAR2的药物。

 

材料与方法

HCAR3-Gi1和HCAR2-Gi1复合物的克隆与纯化

pFastbac载体（Gibco）被用来构建表达全长人类HCAR3和HCAR2蛋白的质粒，这些质粒在N端被修饰为血凝素信号序列、FLAG表位、3C蛋白酶切割位点，并在C端标记为His Tag。此外，工程化了一种表现出显性负行为（DNGαi1）的Gαi1变体[36]，通过G203A和A326S突变区分，保留了与HCAR3和HCAR2相同的修饰，除了FLAG标签外。利用Bac-to-Bac杯状病毒表达系统，这些构造与Gβ1γ2结合，在Spodoptera frugiperda Sf9细胞（Invitrogen）中同时表达。在共表达方案中，Sf9细胞以4 × 10浓度悬浮培养6细胞/毫升，在10：10：1的比例中，从携带HCAR2或HCAR3、DNGαi1和Gβ1γ2基因的杆状病毒共感染。Sf9细胞在感染后48小时内通过离心法在4000克下收集10分钟，随后细胞沉淀保存在−80°C。

 

为了提取含有多种配体的HCAR3-DNGαi1-Gβ1γ2和HCAR2-DNGαi1-Gβ1γ2复合物，在纯化过程的不同阶段引入了特异性激动剂。HCAR3-DNGαi1-Gβ1γ2复合物被100微米酸法门酸酯（APEXBIO B6848）靶向，辅以6O（16微米）、IBC293（75微米）、100微米（Aladdin 7326-19-4）等激动剂。同样，HCAR2-DNGαi1-Gβ1γ2复合物也受到相同的acifran浓度影响。使用含有0.5 mM EDTA和10 mM Tris（pH 7.5）的缓冲液重新休眠并裂解细胞沉淀，并在4°C磁性搅拌一小时以促进配合物组装。随后，通过离心分离细胞膜，并重新悬浮于由20 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM NaCl、10%（w/v）甘油、10 mM MgCl组成的溶解缓冲液中2，5 mM CaCl2，1 mM MnCl2、100 μg/ml苯扎苘、0.2 μg/ml露己定、25 μU/ml阿帕拉酶（NEB）和100 μU/ml拉姆伽磷酸酶（NEB）。随后加入1%（w/v）n-十二烷基-β-D-麦芽苷（DDM）和0.1%（w/v）胆固醇半芽糖酸盐（CHS）的溶液，混合物在4°C下孵育2小时。

 

离心后获得的上清液在4°C下与Anti-Flag M1抗体亲和树脂（Sigma Cat# A4596）一起进行1小时的潜伏。洗涤时，使用由20 mM HEPES（pH 7.5）和100 mM NaCl组成的NH缓冲液，并加0.1% DDM、0.01% CHS和2 mM CaCl2，受雇了。洗涤后，采用渐进程序将M1树脂转化为含0.1%（w/v）LMNG的介质。随后加入10×CMC缓冲液，其中包括添加0.01% LMNG、0.001% CHS和2 mM CaCl的NH缓冲液2，用于对M1树脂进行温和的最终清洗。

 

经过洗涤和缓冲液交换过程后，通过含NH缓冲液、5 mM EDTA、0.00075% LMNG、0.00025%（w/v）乙二醇-二丝菌素（GDN）、0.0001% CHS和200 μg/ml的Flag肽的冲洗法，从M1树脂中提取了HCAR3-Gi1和HCAR2-Gi1复合物。

 

洗脱后的蛋白通过超滤管（默克Amicon Ultra-15ML）浓缩，随后将抗体片段scFv16加入复合物中。该混合物随后在冰上孵育至少2小时，保持1：1.5的比例[37]。为进一步纯化HCAR2-Gi1-scFv16和HCAR3-Gi1-scFv16复合物，采用了Superdex 200 Increase 10/300柱（GE Healthcare），此前已与10 × CMC缓冲液平衡。

 

低温网格制备与电磁数据收集

最初，一个100孔碳膜网格（金，300网，N1-C14nAu30-01）使用Tergeo等离子体清洗剂处理以确保其预放电。在完成准备后，HCAR3-Gi1-scFv16和HCAR2-Gi1-scFv16配合物被应用于网格。施用过程包括在10°C、100%湿度的环境下对网格进行3.5秒的吸墨，紧接着使用Vitrobot I型冷冻柱塞（Thermo Fisher Scientific）快速冷冻液态乙烷。

 

采集工作使用Titan Krios Gi3显微镜，电压为300 kV（Thermo Fisher Scientific FEI）。影片以105,000倍放大率录制×使用Gatan K3生物量子成像系统，像素大小设置为0.85 Å或0.83 Å。非弹性散射电子通过GIF量子能量滤波器（美国Gatan）滤除。数据采集涉及捕捉散焦范围在−1.1至−2.0 μm之间的胶片堆叠，利用20 eV狭缝宽度。每个样品在总曝光时间2.0秒内收集50帧，电子剂量率为每像素21.2个电子。单粒子数据的获取由SerialEM 3.7软件实现。

 

图像处理与三维重建

使用cryoSPARC v4.1.1分析了结合多种激动剂的HCAR3-Gi1-scFv16和HCAR2-Gi1-scFv16复合物的冷冻电磁数据集[38]。对于绑定为6O的HCAR3复合物，共进行了3,159个胶片堆叠的对比，用于运动校正和CTF（对比传递函数）估计。模板选择最终提取了2,572,904个颗粒，随后通过二维分类缩减至509,850个颗粒。随后的三维分类和从头三维模型生成进一步细化粒子计数，达到318,073个。处理序列包括均质精炼、非均匀精炼和局部精炼阶段，最终生成了一张地图。该地图的全球分辨率为3.31 Å，FSC为0.143。对于绑定PLA的HCAR3复合体，共有3,780个胶片堆栈进行了运动校正和CTF（对比传递函数）估计的对齐。模板选择共提取了3,100,214个颗粒，随后经过二维分类缩减至355,650个颗粒。随后的三维分类和从头三维模型生成进一步细化到257,140个。处理序列包括均质精炼、非均匀精炼和局部精炼阶段，最终生成了一张地图。该地图的全局分辨率为3.05埃，FSC为0.143。对于与IBC293绑定的HCAR3复合体，共进行了3,249个电影堆叠的对比，用于运动校正和CTF（对比传递函数）估计。模板选拔结果提取了2,498,842个颗粒，随后通过二维分类将这些颗粒缩减到505,659个颗粒。随后的三维分类和从头三维模型生成进一步细化到268,826个。处理序列包括均质精炼、非均匀精炼和局部精炼阶段，最终生成了一张地图。该地图的全球分辨率为3.26埃，FSC为0.143。对于与acifran绑定的HCAR3复合体，共有3,258个胶片堆进行了对齐，用于运动校正和CTF（对比传递函数）估计。模板选择最终提取了2,515,469个颗粒，随后通过二维分类缩减至411,277个颗粒。随后的三维分类和从头三维模型生成进一步细化到375,522个。处理序列包括均质精炼、非均匀精炼和局部精炼阶段，最终生成了一张地图。该地图的全局分辨率为3.18 Å，FSC为0.143。对于与acifran绑定的HCAR2复合体，共进行了3,542个电影堆叠的对比，用于运动校正和CTF（对比传递函数）估计。模板选择共提取了3,059,535个颗粒，经过二维分类后进一步缩减至841,066个颗粒。随后的三维分类和从头到尾的三维模型生成进一步细化了粒子计数，达到877,365个。处理序列包括均质精炼、非均匀精炼和局部精炼阶段，最终生成了一张地图。该地图的全球分辨率为2.72 Å，测定FSC为0.143。

 

模型制作与改进

对于构建HCAR3-Gi1-scFv16和HCAR2-Gi1-scFv16复合模型，HCAR3和HCAR2模板来源于Alphafold（https://alphafold.ebi.ac.uk/），而Gi-scFv16部分则基于FPR2-Gi Cryo-EM结构（PDB ID： 6OMM）中的结构建模[39]。初步模型对接电子密度图使用UCSF Chimera完成，随后通过COOT进行详细手动调整和结构细化[40]。进一步利用Phenix进行了实空间细化[41]。Phenix套件还促进了对精细模型的统计分析。分子结构的可视化表示利用了如UCSF Chimera [42]、UCSF ChimeraX [43,44]和PyMOL （https://www.schrodinger.com/pymol）等软件工具生成。

 

cAMP测定

将HCAR3和HCAR2的全长变异，包括特定点突变，整合到pcDNA3.1载体中进行cAMP检测。cAMP水平使用Perkin Elmer的cAMP-Gi套件（型号TRF0263）进行定量，遵循制造商指南。HEK-293细胞（ATCC CRL-1573）被镀入24孔板中，每孔的汇聚率为70–90%。细胞被短暂转染野生型或突变HCAR3质粒（每孔500 ng，24孔格式），使用Lipofectamine 3000（Invitrogen）。36小时后，细胞用PBS冲洗后，使用包括500微米IBMX在内的刺激缓冲液处理，并在384孔板中培养30分钟，该板保持37°C，播种密度为每孔4000个细胞。随后在每口井中加入12微米福斯科林，并在相同温度下继续孵育45分钟。随后，每口井接收5微升cAMP Eu-隐秘物溶液和抗cAMP-d2溶液，混合物在室温下孵育1小时[45]。随后使用多模板读器（Perkin Elmer EnVision 2105）采集620/665纳米的荧光读数[46]。采集的数据使用GraphPad Prism 9.0版本进行分析，统计显著性设为p < 0.05。所有实验程序重复了三次以确保准确性。

 

流式细胞术分析

先在转染HEK-293细胞中，将野生型HCAR3、HCAR3突变体、野生型HCAR2和HCAR2突变体在室温下与5%（w/v）BSA一起孵育15分钟进行阻断。随后用抗旗抗体（Thermo Fisher Scientific）在4°C下潜伏一小时。随后用PBS冲洗三次，随后在4°C下暴露于Alexa-488结合二级抗体（Beyotime）一小时，避免光照暴露。使用BD Accuri C6 Plus流式细胞仪测量荧光强度，从而比较HCAR3突变体表面表达水平与野生型HCAR3的100%基准。数据的统计评估采用GraphPad Prism 9.0进行，采用单向方差分析，显著阈值设为p < 0.05。

 

表面等离子体共振测量

利用Biacore X100系统测定了激动剂对野生型HCAR3和HCAR2的亲和力，该系统运行缓冲液由2 mM HEPES（pH 7.4）、10 mM NaCl和5%（v/v）DMSO组成。胺-偶联法应用于纯化野生型HCAR2和HCAR3，在pH为5.0的CM5传感器芯片表面连接。在相互作用分析中，不同浓度的激动剂在运行缓冲液中制备，并流经芯片100秒以评估结合阶段。随后，运行缓冲液冲洗芯片，促进激动剂的50秒解离阶段。Biacore X100系统持续记录传感器图，随后分析以推断结合亲和力（K）D）的相互作用。

 

分子对接

使用薛定谔套件（2018.4版）进行分子对接，构建了PLA、6O和IBC-HCAR2复合物。HCAR2的晶体结构来自蛋白质数据库（PDB ID： 8IHI）[22]。蛋白质结构通过去除水分子、分配键序并添加氢原子来制备。配体结构通过使用LigPrep模块生成三维构象和电离态来制备。基于网格的对接通过Glide模块进行，基于晶体结构中的初始配体位置定义受体网格。采用了Glide XP（更高精度）进行精确姿态预测和评分。选取对接得分最佳的对接结果用于后续MD模拟。

 

分子动力学模拟

研究不同激动剂在HCAR2和HCAR3结合口袋中的稳定性。我们使用了MD模拟，针对PLA结合、6O结合、IBC结合、acifran结合的HCAR2和HCAR3模型，从本研究构建了激动剂结合的HCAR3复合物;结合acifran的HCAR2复合物由先前报道的结构构建（PDB ID： 8IHI）[22];通过分子对接构建了结合PLA、6O、IBC结合的HCAR2复合物。CHARMM-GUI 服务器中的膜构建模块[47]用于准备模拟输入。激动剂-蛋白质复合物嵌入由POPC分子组成的膜双层中，位置基于OPM数据库[48]。随后用TIP3P溶剂和0.15 M NaCl溶剂溶剂对该复合物进行溶剂处理。CHARMM36力场[49]用于蛋白质、脂质和离子。CHARMM一般力场（CGenFF）[50]用于激动剂。所有MD模拟均使用GROMACS-2019.4[51]。MD模拟使用由CHARMM-GUI服务器生成的.mdp文件中指定的默认设置进行。这些默认配置涵盖了使用最陡下降算法实现5000步能量最小化的参数、两个NVT和四个NPT平衡阶段，以及生产运行。在整个模拟过程中，范德华相互作用和短程静电相互作用均适用12 Å的截止距离。使用粒子网格Ewald算法计算了远程静电相互作用[52]。使用LINCS算法[53]来约束涉及氢原子的共价键。关于.mdp文件的详细信息可在S2表格中找到。对八个激动剂-受体系统各自进行了三次独立的 MD 模拟。轨迹以100 ps间隔记录，随后使用MDAnalysis文库进行分析[54]。均方偏差根（RMSD）计算使用全螺旋区域的Cα原子进行比对，利用激动剂的重原子进行RMSD评估。

 

支持信息

对HCAR3-Gi1信号复合物的6O结合形式进行冷冻电磁数据处理。

 

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第一季 图。 对HCAR3-Gi1信号复合物的6O结合形式进行冷冻电磁数据处理。

（A）结合于化合物6O的HCAR3-Gi1复合物的尺寸排除色谱和SDS-PAGE。（B）复杂颗粒的代表性显微照片。（C）代表性的二维平均值。（D） 低温电磁图像处理的工作流程。（E）三维重建的金标准FSC曲线。（F） 复形的局部分辨率图。（G） 在6O-HCAR3-Gi1复合物最终三维重建中，在低温SPARC中计算的角度分布。（H） HCAR3的TM1–7和ECL2，以及Gαi1（αN和α5）α螺旋的代表性密度图和模型（等高线水平4.20 rmsd）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s001

 

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第二季 图。 对PLA结合形式的HCAR3-Gi1信号复合体进行冷冻电磁数据处理。

（A）结合PLA的HCAR3-Gi1复合物的尺寸排除色谱和SDS-PAGE。（B）复杂粒子的代表性显微照片。（C）代表性的二维平均值。（D） 低温电磁图像处理的工作流程。（E）三维重建的金标准FSC曲线。（F） 复形的局部分辨率图。（G）在PLA-HCAR3-Gi1复合物最终三维重建中，在冷冻SPARC中计算的角度分布。（H） HCAR3的TM1–7和ECL2，以及Gαi1（αN和α5）α螺旋的代表性密度图和模型（等高线5.60 rmsd）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s002

 

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第三季 图。 对IBC293结合形式的HCAR3-Gi1信号复合体进行冷冻电磁数据处理。

（A）结合IBC293的HCAR3-Gi1复合体的尺寸排除色谱和SDS-PAGE。（B）复杂粒子的代表性显微照片。（C）代表性的二维平均值。（D） 低温电磁图像处理的工作流程。（E）三维重建的金标准FSC曲线。（F） 复形的局部分辨率图。（G）用于IBC293-HCAR3-Gi1复合物最终三维重建，在cryoSPARC中计算的角度分布。（H） HCAR3的TM1–7和ECL2，以及Gαi1（αN和α5）α螺旋的代表性密度图和模型（等高线水平3.90 rmsd）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s003

 

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第四季，图。 对HCAR3-Gi1信号复合体的冷电磁数据处理，以acifran结合形式进行。

（A） 结合于acifran的HCAR3-Gi1复合物的尺寸排除色谱剖面和SDS-PAGE。（B） 复杂颗粒的代表性显微照片。（C） 代表性的二维平均值。（D） 低温电子显微成像处理的工作流程。（E）三维重建的金标准FSC曲线。（F） 复合物的局部分辨率图。（G） 用于Acifran-HCAR3-Gi1复合物最终三维重建时，在cryoSPARC中计算的角度分布。（H） HCAR3的TM1–7和ECL2，以及Gαi1（αN和α5）α螺旋的代表性密度图和模型（等高线4.70 rmsd）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s004

 

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S5 图。 HCAR2-Gi1信号复合物以无菌门结合形式进行冷冻电磁数据处理。

（A）结合于acifran的HCAR2-Gi1复合物的尺寸排除色谱剖面和SDS-PAGE。（B）复杂颗粒的代表性显微照片。（C）具有代表性的二维平均值。（D）低温电子显微成像处理的工作流程。（E）三维重建的金标准FSC曲线。（F）复合物的局部分辨率图。（G）在cryoSPARC中计算的角分布，用于Acifran-HCAR2-Gi1复合物的最终三维重建。（H） HCAR2的TM1–7和ECL2，以及Gαi1（αN和α5）α螺旋的代表性密度图和模型（等高线4.30 rmsd）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s005

 

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S6 图。 映射到模型FSC曲线。

（A） 映射到6O-HCAR3复合物的FSC曲线模型。（B） 映射到模型的PLA-HCAR3复合体FSC曲线。（C） 映射到模型的IBC293-HCAR3复合物FSC曲线。（D） 映射到Acifran-HCAR3复合物的FSC曲线。（E） Acifran-HCAR2复合物的FSC曲线映射到模型。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s006

 

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第七季，图。 配体结合口袋的性质。

（A）在6O、PLA、IBC293和acifran存在下HCAR3结合口袋的横截面。N端、ECL1和ECL2分别以黄色、紫色和青色标记。（B）激动剂化学结构的二维呈现及与HCAR3残基的相互作用。粉色矩形中的残基：极性相互作用（氢键、盐桥）。黄色矩形中的残基：π–π相互作用。绿色矩形中的残基：疏水相互作用。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s007

 

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第8季，图。 关键残基的电子密度和参与配体结合的ECL2。

（A）6O-HCAR3复合体中配体相互作用残基和ECL2的密度（轮廓6O，4.20 rmsd）。（b）PLA-HCAR3复合体中配体相互作用残基和ECL2的密度（轮廓水平PLA 5.60 rmsd）。（C）IBC293-HCAR3复合体中配体相互作用残基及ECL2的密度（轮廓水平6O，3.90 rmsd）。（D）acifran-HCAR3复合体中配体相互作用残基及ECL2的密度（轮廓水平acifran 4.70 rmsd）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s008

 

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S9 图。 配体相互作用残基的诱变研究。

（A）与L30的额外疏水相互作用1.35， L341.39， F2777.36，以及L2807.39在6O结合的HCAR3结构中。（B）通过单点突变与6O相互作用的多个残基对Gi介导cAMP的影响。（C，D）野生型和单点突变体HCAR3（C）和HCAR2（D）的细胞表面表达水平。数据以SEM方法±呈现。实验以三倍形式进行。该图的基础数据可在S1数据中找到。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s009

 

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S10 图。 分析不同激动剂结合的HCAR3复合物中极性与疏水性相互作用。

（A） 根据受体区域排列的4个HCAR3复合物叠加。直立结合口袋以虚线圈突出显示。（B） 配体芳香基与F107之间的π–π相互作用3.32. （C）来自6O结合和无糖菌门结合结构的R1残基表面图。具有无糖菌门结合结构的R1显然比6O结合结构的R1更松散。（D）来自6O结合和无糖菌门结合结构的R2残基表面图。6O结合结构的R2形成了沟槽状表面。（E）IBC293与R111缺乏盐桥相互作用3.36而Acifran则具有。（F） 通过R111单点突变对IBC293诱导的HCAR3激活的影响3.36答。（G） IBC293结合和Acifran结合结构中R1残基的表面视图。该图的基础数据可在S1数据中找到。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s010

 

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第11季 图。 野生型HCAR3对配体的结合亲和力。

（A）野生型HCAR3对激动剂6O的结合亲和力。（B）野生型HCAR3对激动剂PLA的结合亲和力。（C）野生型HCAR3对激动剂IBC293的结合亲和力。（D）野生型HCAR3对激动剂阿西法兰的结合亲和力。结合亲和力通过表面等离子体共振分析确定。数据以SEM±手段的形式呈现。实验以三份形式进行。该图的基础数据可在S1数据中找到。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s011

 

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第12季 图。 Acifran识别和激活HCAR2与HCAR3的分子机制。

（A）野生型HCAR2对激动剂阿奇法门的结合亲和力。（b） HCAR2关键残基与阿西法门的相互作用及通过这些残基单点突变对HCAR2活化的影响。（C，D）对acifran-HCAR2和acifran-HCAR3结构间R1残基的详细比较。苯组Acifran在HCAR2中比HCAR3更适合R1。（E）Acifran诱导的cAMP抑制WT HCAR2及同源突变HCAR2、WT HCAR3和同源突变HCAR3。（F）HCAR2和HCAR3的Acifran稳定性评估。RMSD值为原始（浅色）和平滑（10纳秒移动平均线，深色）。红色虚线是三条复制轨迹的平均RMSD值。该图的基础数据可在S1数据中找到。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s012

 

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第13季，图。 关键残基的电子密度和参与Acifran与HCAR2结合的ECL2。

（A）HCAR2中与酸盐酸酐相互作用的极性和疏水残基的电子密度（轮廓能级4.30 rmsd）。（B）HCAR2中ECL2的电子密度（等高能级4.30 rmsd）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s013

 

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第14季 图。 HCAR3和HCAR2的口袋差。

（A）HCAR3和HCAR2直立骨囊的表面表示，以及叠加的HCAR2和HCAR3直立骨囊。结构和激动剂的颜色不同。中等海蓝宝石和浅鲑鱼，acifran-HCAR2;浅绿色和淡紫色，60-HCAR3。蓝色，HCAR2表面;黄色，HCAR3表面。（B–D）同源突变83对6O、IBC293、PLA诱导的HCAR3/HCAR2活化的影响2.60, 862.63, 9123.48，以及1073.32.数据以SEM±手段的形式呈现。实验以三份形式进行。该图的基础数据可在S1数据中找到。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s014

 

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S15 图。 配体结合的HCAR3复合物与非活性HCAR2结构的螺旋位移。

（a）结合6O-、PLA-、IBC293结合的HCAR3结构与非活性HCAR2结构（PDB：7ZL9）的比较。（B） 受体激活后TM7在6O-、PLA-、IBC293结合的HCAR3结构中位移，且HCAR2为非活性。（C）TM7与Gi的α5螺旋相互作用机制分析。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s015

 

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S16 图。 HCAR3的激活机制。

（A，B）拮据剂结合HCAR3中TM5和TM6的位移与非活性HCAR2相比（PDB： 7ZL9）。这些结构的颜色不同：灰色，非活性-HCAR2;淡紫色，6O-HCAR3;板岩蓝，PLA-HCAR3;中海绿色，IBC293-HCAR3;道奇蓝队，阿西法兰-HCAR3。（C–F）密钥C6.47F6.48xP6.50（常见GPCR中的CWxP图案）（C），P5.50我3.40F6.44 （D），D7.49P7.50xxY7.53（常见GPCR中的NPxxY主题）（E），和D3.49R3.50Y3.51 (F）基序在活化的HCAR2和HCAR3中表现出构象重排。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s016

 

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S17 图。 基序残基的电子密度。

（a） C 的密度6.47F6.48xP6.50（常见GPCR中的CWxP基序）基序残基。（b） P 的密度5.50我3.40F6.44个模样残留物。（c） D 的密度7.49P7.50xxY7.53个（常见GPCR中的NPxxY基序）基序残基。（d） D的密度3.49R3.50Y3.51个模特残留物。淡紫色，6O-HCAR3;板岩蓝，PLA-HCAR3;中等海绿色，IBC293-HCAR3（等高线6O，4.20海军，PLA海军5.60海军，IBC293,3.90海军）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s017

 

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S18 图。 HCAR3和HCAR2配体识别机制图及选择性。

本研究主要阐明激动剂6O、PLA和IBC293如何结合HCAR3的机制。6O是与HCAR3结合亲和力最高的配体。6O、PLA和IBC293对HCAR3的结合较强，但对HCAR2的结合较弱。关键机制在于HCAR3的结合口袋比HCAR2大。F/L1073.32， V/L832.60，Y/N862.63，以及S/W913.48是决定HCAR2与HCAR3配体选择性的最关键残基。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s018

 

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S19 图。 本文中报告结构与结构之间的电子密度图谱比较。

（A）来自Suzuki及其同事（PDB： 8IHJ）及我们合作的配体acifran电子密度与acifran选择性相关关键残基的比较。（B，C）铃木及其同事与我们对ECL1和ECL2发夹区域电子密度的比较。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s019

 

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S1表格。 冷冻电子显微镜数据收集、优化和验证统计。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s020

 

（PDF）

 

S2表格。 MD模拟参数设置。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s021

 

（PDF）

 

S1 原始图像。

未裁切的Coomassie染色SDS–PAGE凝胶，用于S1A、S2A、S3A、S4A和S5A图。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s022

 

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S1数据。

图2C、S9B、S9C、S9D、S10F、S11A、S11B、S11C、S11D、S12A、S12B、S12E、S14B、S14C和S14D的原始数据。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003480.s023

 

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确认

我们感谢香港中文大学深址高比尔卡低温电子显微镜中心提供的低温电子显微镜。我们感谢华尔谢尔计算生物学研究所（深圳市和龙岗区资助）为计算工作所做的贡献。

 

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