厦门免费医学论文发表-在基因组还原植原体及其他依赖宿主的软体中的效应子创新
费德里科·G·米尔金，山姆·T·马格福德，维拉·托勒，马尔佐，萨斯基娅·A·霍根豪特
抽象
具有基因组还原的专性宿主相关细菌，如植原体，面临强烈的进化限制，包括对宿主的代谢依赖、有限的水平基因转移（HGT）机会以及频繁的种群瓶颈。尽管存在这些限制，植原体作为寄生虫传播的植物病原体，仍保留着多样化的分泌效应因子，这些因子控植物和昆虫宿主，促进感染和传播。这些效应因子可以抑制免疫并重新编程植物发育，通过泛素非依赖的关键转录因子降解，诱导如女巫扫帚花和叶状花朵等变化。然而，植原体如何在缺乏频繁遗传交换的情况下多样化并维持这些效应因子，仍不清楚。为此，我们分析了239个植原体基因组的效应组，识别出一组多样化的分泌蛋白，并将其命名为假定的植原体效应子（PhAMEs）。我们发现，针对宿主蛋白进化保守且结构受限表面的PhAME在植原体中广泛分布。这些效应器采用紧凑高效的折叠。它们通常作为具有双重相互作用面的分子支架，能够连接宿主蛋白或整合信号通路。这种支架式PhAME已经多次独立进化，提供了趋同进化的明确证据。尽管基因组还原和有限的HGT带来了严重的基因组限制，基因复制、界面变异、结构域融合和重复扩展仍帮助效应子的折叠和多样性。虽然植原体的整体效应蛋白组合在很大程度上是独一无二的，但一些PhAME结构域与其他软体和病原体的蛋白质有相似之处。我们的研究结果共同揭示了基因组还原细菌如何创新分子功能，并为植原体生物学、效应子进化及宿主-病原体动态提供了见解。它们还为蛋白质工程方法奠定了基础，旨在发现或设计具有生物技术潜力的新型生物分子。
作者简介
植原体是寄生于植物及其摄食汁液昆虫媒介中的微小细菌。感染植物常表现出显著的发育异常，如过度的枝条增生和花朵转变为叶状结构（叶状结构）。这些变化常导致不育，使植物资源转向促进细菌传播的方式。由于植原体依赖宿主，很少有机会从其他细菌获取新的致病基因，其致病因子可能通过其他方式多样化，进化出能够微调植物和昆虫媒介过程的特征，包括抑制免疫反应。为了探讨这种多样性的形成，我们分析了239个植原体基因组，识别出大量候选毒力因子，我们称之为植原体效应因子（PhAMEs），涵盖既有因素和许多此前未被认识的因素。通过预测和研究其结构，我们揭示了分子创新策略，并深入了解这些效应因子如何与宿主蛋白相互作用。对其他致病细菌蛋白（包括感染人类的蛋白）进行比较分析，揭示了既保守又具谱系特异性宿主控策略。我们的发现表明，即使是基因组还原率最高的细菌，也能进化出复杂的工具来控其多细胞宿主，为生物学和生物技术带来了新的视角。
数字
Fig 4图5图1图2图3图4图5图1图2图3
引文： Mirkin FG、Mugford ST、Thole V、Marzo M、Hogenhout SA（2025）基因组还原植原体及其他宿主依赖性软体中的效应子创新。PLoS Genet 21（11）： e1011946。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946
编辑 器： 弗兰克·O·艾尔沃德，弗吉尼亚理工大学：美国弗吉尼亚理工学院与州立大学
收到： 2025年7月30日; 接受： 2025年10月31日; 发表： 2025年11月13日
版权所有： © 2025 Mirkin 等人。本文为开放获取文章，依据知识共享署名许可协议发布，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是须注明原作者和来源。
数据可用性： 所有数据均作为主稿的一部分提供并上传，或作为补充数据的一部分，或更新到存储库中。AlphaFold预测的结构和成熟的PhAME序列已沉积在Zenodo（doi： https://doi.org/10.5281/zenodo.17379298）。补充信息（S1-S12表格）提供了更多数据。
资金： 本研究得到了英国研究与创新（UKRI）工程与物理科学研究理事会EP/X024415/1（通过欧洲研究理事会（ERC）授予SAH）（FGM、STM、SAH）、生物技术与生物科学研究理事会（BBSRC）BB/P012574（植物健康ISP）（SAH、STM、VT）、BBS/E/J/000PR9797（植物健康ISP）的支持– 易感性）（SAH、STM、VT）和BBS/E/JI/230001B（推进植物健康ISP——减轻对植物健康的生物威胁）（FGM、STM、MM、SAH），并得到了约翰·因尼斯中心（JIC）知识交流（KEC）创新基金（佛蒙特州）、约翰·因尼斯基金会（FGM、STM、VT、MM、SAH）和盖茨比慈善基金会（FGM，SAH）的额外支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决策或手稿准备中没有任何角色。
利益冲突： 我们已阅读该期刊的政策，本文作者有以下利益冲突：SAH获得产业资助，专注于植原体效应生物学。基于SAP05介导的泛素无关降解的两项专利已发表（国际发表编号：WO2022/129621和WO2024/256685）。FGM、STM、VT和SAH也已提交了与本手稿中所述工作的专利申请。
介绍
专性宿主相关细菌经常经历种群瓶颈，并经历了广泛的基因组减小[1,2]。它们受限的生活方式也限制了菌株间横向基因转移（HGT）的机会。许多特征明确的专性共生体已进化为互利共生。虽然它们仍依赖宿主来源的营养物质，但经常向宿主提供必需代谢产物，如氨基酸[3,4]。其他如沃尔巴奇亚则高度专精于控特定过程，包括繁殖、免疫和发育，以促进自身向下一代无脊椎动物宿主的传播[5,6]。有趣的是，一些具有高度还原基因组的专性细菌，如植原体和其他软体，拥有一系列称为效应因子的致病因子，能够以复杂的方式调节昆虫和不同植物宿主的多种过程[7–9]。这带来了一个进化悖论：基因组极少、屡遭瓶颈和有限基因交换机会的细菌，如何维持并进化出多样且可适应的效应子组合来调节宿主生理？
莫利库特目代表了极端的进化流线型。它们源自一个或多个革兰氏阳性梭状芽孢杆菌祖先[10]，失去了细胞壁，大多数缺乏主要代谢途径，导致细胞仅有单膜，完全依赖宿主提供的养分维持生存[11]。该类包括植原体，这是昆虫传播植物病原体的单系谱系，属于虫体科。与无胆浆体一起，植原体在莫利库特目中形成了一个早期分化的演化支[12]。一个独立的早期分化谱系包括支原体，它们是脊椎动物（包括人类）常见的病原体，以及主要定殖无脊椎动物并偶尔感染植物的螺旋体和内寄原体[13]。两个类群的深度分歧反映在密码子的使用上。螺旋形体、支原体及其亲属重新分配了UGA终止密码子以编码色氨酸，这是一种在无胆质体和植原体中不存在的适应，后者保留了典型的遗传密码[14]。
莫利库特族还包括一些能够在轴系培养中复制的最小细菌基因组[15–17]，尽管许多细菌，包括植原体，基本上仍无法培养。由于其专性宿主关系，mollicutes经常遭遇种群瓶颈，限制HGT的机会[18]。尽管如此，它们已进化出高度动态的可移动遗传元件，其中一些促进了跨远缘菌株间的HGT[19–22]。这种遗传迁移挑战了专性共生体和病原体基因组还原的传统观点，并提出了关于移动元素如何影响软体动物毒力和共生进化的关键问题。
植原体依赖植物和昆虫宿主进行传播[23,24]，是少数能够定殖植物细胞质的细菌之一，专门针对韧皮部筛细胞，同时侵入并定殖其昆虫媒介的各种组织[25]。尽管它们的基因组极为紧凑，范围在0.6到0.96 Mb之间，且缺乏许多保守的代谢基因[26–28]，但它们携带着一组多样的效应基因，这些基因通常存在于被称为潜在移动单元（PMU）的可移动遗传元件中[19,22,27]。这些细菌会在植物宿主中引发显著症状，包括枝条和叶片的增生（称为“女巫扫帚症状”）、叶状花的形成（萺花和叶状）以及幼体特征的保留，表现为延长的产叶营养发育阶段（幼态期）[29,30]。这些症状常使受感染植物更容易吸引昆虫媒介，促进植原体传播[31]。
植原体携带独特的致病因子和效应因子，这些因子会引发这些症状。在功能特征明确的效应子中，出现了劫持宿主细胞过程的主题，植原体效应器常常将调控不同过程的宿主蛋白结合起来。例如，紫菀黄菌株的女巫扫帚菌株（AY-WB）植原体（Ca.植物原体（Phytoplasma asteris）效应子，即分泌的AY-WB蛋白（SAPs）[32]，其中包括经过充分表征的SAP05，该SAP05作为分子支架，将26S蛋白酶体成分RPN10与SPLs和GATA的锌指结构域结合起来，导致这些转录因子的降解[30,33]。SAP05的作用会导致植株延迟老化和叶片及嫩芽过度增生，症状类似于植原体感染植物的“巫术扫帚”症状。SAP11效应子通过破坏TCP转录因子，促进叶形变化和额外茎的生长[34–36]，并影响植物防御[37–39]。
另一个例子是SAP54/叶同源（Phyl1），它结合MADS盒转录因子（MTF）和蛋白酶体穿梭因子RAD23，导致前者降解[34,40–42]。由于MTF在花朵发育中起着关键作用，这种破坏使花朵转变为叶状结构，表现型类似叶状和绿化，这些症状是植物中植物中植物存在植物植原体的诊断信号。值得注意的是，SAP54和SAP05均以泛素无关的方式诱导降解，绕过了传统的宿主调控机制[30,43]。植原体SAP效应子不仅重塑植物形态，还增强昆虫媒介的吸引力和繁殖力[34,41,44,45]，确保病原体的高效传播。
其他功能性特征的植原体效应因子包括天狗[46]、SWP12[47]、SRP1[48]、SJP39[49]和RY378[50]。此外，植物浆体的跨膜蛋白如AMP [51,52]、IMP [53] P38 [54] 和PM19_00185 [55]在植原体定殖宿主中发挥关键作用。
虽然已有多种植原体效应因子被鉴定，但它们的整体多样性和结构特征仍大多未知。为了研究植原体在极端基因组和进化限制下如何多样化其效应蛋白库，我们分析了239个植物原体基因组的效应组多样性，利用AlphaFold结构预测评估效应蛋白结构域组成、蛋白-蛋白质相互作用表面和结构基序的进化过程。我们发现植原体效应子通过特定蛋白质折叠的变异来多样化。例如，SAP05折叠存在于多个效应子中，结合面和重复次数存在差异。类似SAP54/Phyl1效应子的小型α螺旋结构也很常见，这与其稳定性和结合多样性相符。我们鉴定了一个新的效应子家族——蝎子，其特征是高度变化的串联β发夹，并发现植物原体、其他软体动物和细胞内病原体之间共享的保守折叠。这些发现揭示了效应子多样性的演化过程，并为蛋白质工程提供了相关见解。
结果
通过挖掘植原体基因组序列，识别出7,162个假定的植原体效应因子（PhAMEs）
为了探索植原体分泌蛋白（以下简称假定植原体效应子，PhAMEs）的结构和序列格局，我们开发了专门的生物信息学流程。该流程使得在239个现有植原体基因组中整合了成熟的植原体效应子鉴定方法[32]，随后基于AlphaFold v2.0（AF2）对选定代表性蛋白质的结构预测[56]，并基于序列和结构相似性构建了聚集的PhAME网络。我们将植原体基因组分为两组。一组24个代表性植原体（RePh）代表主要植原体16Sr组，基于完整/染色体水平组装的注释或90% CheckM完成度高的基因组完整性≥选定[57]（S1表）。另一组包含215个植原体，包括完全组装或部分基因组（S1表）。在由任何基因组编码的107,543个全长蛋白中，该流程根据两个标准识别出7,162个PhAMEs（2,205个不同的成熟序列）（占6.7%）：细菌（包括植原体）蛋白分泌的信号肽[32];以及成熟蛋白中缺乏跨膜结构域（图1A，S2表）。
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图1。 PhAMEs会聚集成结构相关的蛋白质簇。
（A）本研究中使用的生物信息学流程，用于植物浆体分泌蛋白的预测、结构建模、聚类和相似性分析。（i） 通过SignalP 3.0预测了24种代表性植原体（RePh）物种及另外215个基因组的分泌蛋白。具有预测信号肽且无跨膜结构域的蛋白质被归类为假定的植原体效应子（PhAMEs）。部分注释的蛋白质被剔除出分析。（ii） PhAMEs被基于序列的子簇使用MMseqs2聚类，序列重叠阈值为80%，序列同性最低为50%。（iii） 对所有由RePh基因组编码的PhAMEs，以及来自RePh未代表的三个亚簇蛋白进行了结构预测。对于缺乏平均pLDDT50≥代表的子簇，预测了另外三个结构。（iv）为了生成基于结构的簇，采用Foldseek簇算法（结构比对率80%，E值≤0.001）对亚簇代表（定义为每个子簇中平均pLDDT得分最高的蛋白，平均pLDDT得分≥50）进行聚类。每个属于同一序列基子簇的PhAME被分配到该代表的基于结构的簇。（v） 所有平均pLDDT ≥50的PhAME的结构相似性通过折叠寻测（E值≤0.001）评估，序列相似性则使用MMseqs2（E值≤0.01）评估。（B）相似性网络，显示PhAME之间的结构和序列关系。节点代表单个PhAME，节点颜色表示集群成员。边表示两两相似性：灰色仅表示序列相似性（MMseqs2，E值≤0.01），蓝色仅表示结构相似性（Foldseek，E值≤0.001），橙色表示序列和结构相似性。不连结的节点表示没有可检测到的序列或结构相似性，与其他PhAME无相似性。不表示不连通的单元素集。经过实验验证的效应子或效应子族用长虚线标记并命名。Ca. 的基因组。在撰写稿件期间测序和鉴定了奥里泽菌株HN2022，因此RY378未被纳入相似网络，但回顾性评估了RY378的簇成员身份。取而代之的是SCWL1中RY378样WBL31615.1的位置（序列同性为86.7%，查询覆盖率为RY378的99.3%）。结构相似性分析仅包含了两者均具预测结构的蛋白对。（C-J）AlphaFold预测的实验验证植原体效应子结构模型，颜色从N端的蓝色到C端的红色。标注了群聚成员和平均pLDDT（pLDDT）评分。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.g001
去除部分蛋白后（S3表）中PhAMEs的数量，每个植原体可识别出5至67个蛋白质（S1A图;S4表格）。尽管基因组组装质量可能部分解释效应子库大小的变异，但存在完全组装且效应子数量高低的基因组表明，这种变异很可能反映了真实的生物学差异（S1B 图）。
PhAMEs根据结构相似性被分组为556个簇
功能注释未能在大多数PhAME中识别出具有功能信息量的领域（S5表格）。因此，为了建立PhAME之间的同源关系，我们利用MMseqs2根据序列身份和比对覆盖率对其蛋白序列进行分组。这表明，7,162个PhAMEscan被划分为894个基于序列的子簇和单子簇（sC），其中最大的有308个成员（见图1A、S2A、S4表）。为实现结构分析，选定了1309个具有代表性的PhAMEs进行AF2预测，确保覆盖所有894个基于序列的子簇（图1A）。在基于序列的聚类和结构预测中，使用了成熟的蛋白质序列（不含信号肽）。结构预测质量采用平均预测局部距离差异检验（pLDDT）得分作为置信度量。结果显示大多数PhAMEs的预测具有高度信心，71.1%的pLDDT得分超过70（S3A图，S4表）。从RePh衍生的PhAME在不同基因组间显示出相似的置信度分数分布，表明其预测质量无明显偏差。在根据序列相似性分组的894个子簇中，598个（67.0%）至少包含一个预测结构的成员，其pLDDT≥平均得分为70（S5A图），表明整个植原体分泌组结构预测质量普遍较高。
为了进一步验证结构预测的准确性，我们进行了基于结构的比对，对现有实验确定的效应子结构与其对应的AF2模型进行了比对。已获得两种分泌的植原体效应子及其同源物的晶体结构：SAP05具有具有β片核心的特征性球状结构[33,58,59]，SAP54/Phyl1具有反平行的螺旋折叠[42,60,61]。实验确定的晶体结构与其对应的AF2模型之间的结构排列显示高度相似，SAP05的RMSD值为0.74 ÅAY-WBSAP54则为0.70 Å哎呀——/Phyl1（S4图），表明预测结构与实验结构之间存在强烈一致性。
基于序列的聚类存在无法识别低序列身份但共享相似折叠和结构域架构的PhAME之间的关系的风险。为此，我们还对具有代表性的PhAME结构模型进行了基于结构的聚类。对于每个包含平均pLDDT >50的成员的基于序列的子簇（sC），选择排名最高的模型作为其结构代表。这些代表者随后通过 Foldseek 进行全对全搜索[62]聚类，将 PhAME 归类为基于结构的聚类。两种聚类方法结合起来，将每个基于序列的子簇中的所有PhAME分配到与其代表簇相同的基于结构的簇（图1A），因为序列同性50%的蛋白质很可能具有相同的折叠[63]。这种整合聚类方法将最初894个基于序列的子簇/单簇简化为更紧凑的结构类簇集。在7,162个PhAME中，6,840个（95.5%）被归入556个结构基簇或被指定为结构单点（见图1A，S4表）。值得注意的是，71.4%的这些群组和单例中至少包含一名平均pLDDT 70分≥的PhAME（S5B图）。基于结构的簇包含1至34个不同的基于序列的子簇（S5C图），凸显了尽管序列保守性低，但结构相似性强的案例。此外，80.5%的簇中包含四个或以上成员的PhAMEs，显示24个RePh植原体整体捕捉了更广泛泛效应组中存在的大部分结构多样性（S5D图）。
PhAME的结构簇包括功能表征的效应子
接着我们思考PhAME簇是否包含已有功能描述的植原体效应因子（见图1B–J）。其中，SRP1 [48] 被发现为单例，而 SAP11 [34,36]、SAP54 [34]、SAP05 [30]、TENGU [46]、SJP39 [49] 和 SWP12 [47] 均属于包含结构和序列相关 PhAME 的更广泛簇（图 1B，S4 表格）这凸显了我们方法的稳健性。然而，一些先前鉴定的效应子同源物未被我们的管线识别，因此未出现在我们的PhAMEs集合中。例如，这些包括来自石灰女巫-扫帚病（WBDL;大约。金叶植原体）植原体。仔细观察后，我们发现这些可以分为三类：i）错误的起始密码子预测;ii）缺乏明显的起始密码子;或三）缺乏预测性的分泌信号，可能是由于现有分泌预测工具的假阴性[64]。尽管如此，鉴于我们的PhAME网络包含所有功能性特征的植原体效应子，我们的方法似乎捕捉到了植原体效应器的丰富多样性。
在准备这份手稿期间，来自加州的RY378研究显示，奥里泽植原体能诱导稻米分蘖，并预测将形成α/β水解酶折叠[50]。我们的分析支持这一观点，并将RY378与PhAME群C45（图1B，1J）联系起来。具有该折叠的蛋白质，如结核分枝杆菌Rv0183（PDB 6EIC），是已知参与宿主脂质代谢的毒力因子[65]。RY378是否具有酶活性或通过非催化机制发挥作用尚待确定。
PhAME结构网络揭示了具有共享域的互联簇
接着，我们评估了具有共同结构域的PhAMEs，包括使用Foldseek进行全对全结构比较[62]，并辅以MMseqs2的序列相似性搜索[66]。这需要去除序列间重叠的阈值百分比，以便识别共享单一结构域的蛋白对（仅代表一个或两个蛋白质的一部分）（图1A）。值得注意的是，若干星系团表现出高度的互联性（见图1B）。例如，SAP05效应子被归类于C41簇中，构成了一个连接的簇网络，这些簇共享一个SAP05样折叠，融合到其他结构域。其中一个例子是SAP49，属于C28簇（S6A图），我们发现它包含一个带有C端α螺旋的SAP05样折叠。同样，SAP54簇（C9）在结构上与具有α螺旋褶皱的其他簇成员相似，如簇C48中的成员（S6B图）。此外，我们还识别出一大群相互关联的簇，但迄今尚无功能特征的成员。这些子网络中的蛋白质共享独特的富β片结构域结构，通常伴随N端α螺旋扩展（S6C图），如具有C3和C46成员的PhAMEs。因此，我们的管线实现了植物质体泛效应组的结构剖析，基于序列和结构相似性对效应子进行分组。基于此，我们继续利用该数据集更好地理解植原体效应体间功能多样性的演化。
SAP05效应子在C41结构簇中聚集在一起
我们鉴定C41簇包含SAP05效应因子家族，包括先前鉴定的成员[30]和若干新预测的同源物（见S7A-B图）。SAP05AY-WB具有五条β股组成的球状紧致结构，形成内部三角形混合β片核心[33]。由三个环（L4、L5和L7）主导的表面结合GATA和SPL转录因子，而SAP05蛋白对面的表面由ß-片1和5、α螺旋1和2以及L2和3组成，则与蛋白酶体亚基RPN10的vWA结构域相互作用（图2A;[33]）。所有C41成员的AF2预测蛋白结构与SAP05的结构高度对齐AY-WB与这些蛋白一致，还能结合GATA和SPL转录因子以及RPN10[30,33]（S7C见图）。与构成蛋白质核心的结构相比，环表面表现出更高的序列变异性（S7D 图），这与之前的发现一致，即某些SAP05同源物仅具有特异性结合SPLs或GATAs，例如Ca. Phytoplasma mali的SAP05[30,33]。这些数据表明，我们基于AF2的结构预测和聚类方法与实验数据相匹配，从而验证了我们评估植物等原体效应子结构多样性的流程和方法。
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图2。 SAP05样蛋白表现出保守的核心折叠，表面暴露区域不同。
（A） SAP05的晶体结构AY-WB效应器[33]。与转录因子（TFs）相互作用的环区在青色中被突出显示，而与RPN10相互作用的富β片区域则以粉色显示。指示参与这些相互作用的二级结构元件。（B）具有SAP05样折叠的蛋白质结构相似网络。基于结构的集群编号（如C28、C41等）标注在节点旁，节点大小表示每个集群或单例内的PhAME数量。边表示簇成员间的结构相似性，由折叠寻度（E值≤0.001）确定。（C-G）AlphaFold v2.0（AF2）预测具有SAP05样折叠的部分蛋白质结构，并以每残基pLDDT值着色。每个蛋白质中都存在一个或多个SAP05样结构域。每个结构下方的文字显示簇数（上方）、蛋白质名称（中位）和平均AF2 pLDDT得分（下方）。（H） SAP05样结构域预测结构及其与SAP05晶体结构相似程度的叠加AY-WB，通过均方根偏差（RMSD）着色，使用ChimeraX的Matchmaker命令，揭示了一个保守的核心结构，带有可变的环区域。灰色表示RMSD>5。对于每个基于结构的簇和单例，使用平均pLDDT得分最高的模型进行叠加。SAP05样结构域通过序列无关多结构比对与FoldMason[117]定义，比对后加入额外残基以捕捉β5 β片的完整范围。（一）Ca膜结合E3泛素连接酶PM19_00185的预测结构。马里植原体，按pLDDT值着色。（J） 进化过程的示意概述，这些过程促成了具有SAP05样折叠的蛋白质的扩增和多样化。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.g002
SAP05的环状表面结构模仿了GATA转录因子DNA结合界面识别的主要DNA沟槽
GATA和SPL转录因子的锌指结构域介导DNA结合[67]。鉴于SAP05也与锌指结构域相互作用[30]，我们比较了结合SAP05的GATA锌指结构特征（S7E图）[58]与结合DNA的结构特征[68]（S7F见图）。这些比较显示，GATA转录因子利用同一表面与DNA和SAP05相互作用。值得注意的是，我们观察到SAP05环面在结构上类似于GATA转录因子识别的DNA大沟面（S7G-H图）。此外，参与DNA碱基识别的关键GATA残基还介导SAP05结合（S7H见图68）。因此，SAP05环表面似乎模仿了GATA转录因子靶向DNA的主要沟槽。
SAP05类折叠作为PhAME的多元化平台
共识别出14个簇，它们在序列和结构上与C41簇中的SAP05成员相似（图2B）。这些簇包括具有SAP05样折叠结构域的蛋白质（图2C–F）。尽管这些SAP05样结构域结构相似度高，但序列保守性较低（S8A见图），这很可能解释了为何此前未被认定为SAP05同源物。在C41中，MDV3198312.1是基于序列的sC535亚簇的唯一代表，并在L4区域有独特的序列（S7B图），这一特征也反映在AF2介导的结构预测中（S7C图）。鉴于SAP05的L4在结合SPLs和GATAs的锌指结构域中起关键作用[33]，MDV3198312.1不太可能结合这些TF。
在与C41相关的簇中，C28是最大的，包含102个成员。它包括具有SAP05样结构域与C端α螺旋融合的PhAMEs，以AY-WB植原体中的SAP49为代表（S8C图）。这些簇中的SAP05样结构域表现出多种结构：它们融合到功能未知的结构域（S8D-E图）;以串联重复方式排列（S8E–F图）;或与可能内在无序的区域相关（S8G 图）。SAP05的比较AY-WB与其他簇中预测的SAP05样结构域结构的结构显示出β层内部核心高度保守，但在SAP05的SPL/GATA和vWA结合面表面结构高度分歧（图2H，S8 B-F图）。总体来看，这些发现表明SAP05样折叠通过改变相互作用界面，同时保持保守的结构核心，成为PhAME的多样化平台。此外，编码SAP05样折叠的基因在植原体基因组中扩展，并经常获得额外的结构域或内在无序区域（见图2J），可能促进与更广泛宿主靶点的相互作用。
为了识别更多含有SAP05样折叠的蛋白质，我们利用Foldseek对Ca的AlphaFold预测模型[69]进行了基于结构的搜索。植原体物种（NCBI分类编号：33926），包含16,731个预测结构，包括多个物种的完整蛋白质组（S6表）。搜索发现了许多具有SAP05样折叠的蛋白质，其中许多缺乏明显的信号肽（S6表）。其中之一是来自Ca的膜相关蛋白PM19_00185。植物原体马里（图2I）与多种植物泛素结合酶（UBC家族）相互作用，并被提出表现出E3泛素连接酶活性[55]。植物中PM19_00185的稳定表达增加了对非宿主病原体假单胞菌pv的易感性。tabaci [55]，支持其作为毒力因子的作用。ATP_00103来自Ca。马里植原体是另一种含有SAP05样结构域的蛋白质，并被注解为假定的端粒再解析酶[28]。令人好奇的是，该蛋白存在于Ca.马里植原体，其基因组在植原体中较为特殊，由一条线性染色体两侧环绕端粒样序列组成，这与大多数其他植原体物种通常呈圆形的基因组形成鲜明对比。总体而言，这表明SAP05样折叠具有高度多样性，其多样化使得新的毒力和其他功能得以实现。
SAP54/Phyl1 PhAMEs在C9结构簇中聚集在一起
SAP54/Phyl1样蛋白通过同时与转录因子的K结构域及蛋白酶体穿梭蛋白RAD23的泛素相关（UBA）结构域相互作用，促进植物MTF的降解。这种双重相互作用使RAD23得以招募，从而促进转录因子货物传递至26S蛋白酶体进行降解[41]。我们的管线识别出169个聚集在C9组内的SAP54/Phyl1样蛋白，包含已识别和未特征成员。对C9组蛋白的系统发育分析显示，有五个具有高引导值支持的分支群，与先前报告一致[70]（S9A见图）。C9组蛋白质的预测结构与OY-M和PnWB植原体中的SAP54/Phyl1（S4C-D， S9B见图）极为相似[42,60]。这些数据进一步增强了我们评估植原体效应子结构多样性的流程和方法。
SAP54/Phyl1的相对面与MADS盒转录因子及蛋白酶体梭蛋白RAD23相互作用
SAP54与MTFs和RAD23的相互作用已被实验证明[41,42,71]，但该相互作用复合物的结构基底尚未被解析。我们从'Ca'中模拟了SAP54/Phyl1的结构。植物原体 asteris 的 OY-M 与 A. thaliana SEP3（AtSEP3）和 AtRAD23C 结合，使用 AF-M（AlphaFold-Multimer V.2）。SAP54哎呀——选择 /Phyl1 是因为该结构已经过实验确定[42]。该模型正确识别了AtSEP3 K-结构域为AtSEP3-SAP54中的相互作用区域哎呀——/Phyl1 复合物，正如之前的实验所示 [41,43]。具体来说，涉及K域残基146–175的表面（见S10A图）与SAP54相互作用哎呀——/Phyl1 置信度较高（ipTM = 0.845），与实验数据一致 [43]。模型显示SAP54哎呀——/Phyl1通过由两个α螺旋形成的复合表面与SEP3 K-结构域的螺旋2相互作用，该表面包含带电和不带电的残基（见图3A，S10 A–C）。 与多聚体SEP3晶体结构（PDB： 4OX0）的结构比较显示，SAP54哎呀——/Phyl1 在 SEP3 多聚化中使用的同一界面结合 K 结构域（S10D–F，见图）。这一发现进一步证实了此前SAP54破坏MTFs多聚化[60]，以及对四聚化至关重要的SEP3残基突变阻止Phyl1结合[43]。
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图3。 SAP54的对面介导选择性结合到MADS盒转录因子的K结构域和蛋白酶体穿梭蛋白RAD23的UBA结构域。
（A） 预测SAP54的曲面表示哎呀——/Phyl1–AtSEP3 复合物，其库仑静电势映射到 SAP54哎呀——/Phyl1。表面的颜色从正电（蓝色）到负电荷（红色）。静电势是用 ChimeraX 计算的。（B） 顶部：A. thaliana RAD23C中泛素样域（UBL）和泛素相关（UBA）结构域位置的示意概述。下图：酵母二杂交（Y2H）检测结果显示SAP54AY-WB与RAD23C的UBA2域及其对应的变换控制相互作用。AD，GAL4激活结构域;BD，GAL4 DNA结合结构域;SD-LWH，选择性培养基，缺乏亮氨酸（L）、色氨酸（W）和组氨酸（H）;3-AT，3-氨基-1,2,4-三唑，一种HIS3酶的竞争抑制剂。EV，空矢量控制。双沉降（SC-LW）培养基上的生长证实了这两种结构的存在。（C） 预测SAP54的表面表示哎呀——/Phyl1–UBA2（AtRAD23C）复合物，其静电势映射到UBA2（AtRAD23C）（左）和SAP54哎呀——/Phyl1（右）。表面颜色如（A）所示。（D） AtSEP3–SAP54 的预测模型哎呀——/Phyl1–UBA2（RAD23C）三元结构，具有SEP3的K结构域和RAD23C的UBA2结构域结合SAP54的对立表面。模型通过叠加AtSEP3–SAP54的AlphaFold-多聚体预测复形得到哎呀——/Phyl1 和 SAP54哎呀——/Phyl1–UBA2（RAD23C）。（E）左侧：Y2H检测显示SAP54AY-WBK61E、K106E和I102F突变体无法与A. thaliana的RAD23C相互作用，而SAP54AY-WBN59Y减少了与MTF的互动。右图：Y2H检测显示SAP54AY-WBK110E突变体无法与A. thaliana的RAD23C相互作用，而SAP54AY-WBK110R保持残基的正电荷，仍与蛋白质体梭蛋白相互作用。编号基于全长/成熟蛋白。SD-LWHA，选择性培养基，缺乏亮氨酸（L）、色氨酸（W）、组氨酸（H）和腺嘌呤（A）。（F） N59、K61、K106、K110 和 I102 在 SAP54 结构（顶部）和线性序列（底部）的两个螺旋 A 和 B 中的位置AY-WB.基于Iwabuchi等，2019[42]展示了并分配SAP54螺旋的七残基序列重复序列（七肽）。位于七层A位的I102位于螺旋中心，而N59、K61、K106和K110分别位于c、e、e和b的位置，则暴露在螺旋外侧。SAP54的颜色从N端的蓝色到C端的红色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.g003
AF模型也自信地预测SAP54哎呀——/Phyl1与AtRAD23C的C端UBA（UBA2）结构域相互作用（全长RAD23的ipTM = 0.854;C端UBA结构域ipTM = 0.903）（S10G-I图），与本图（图3B）及先前报告一致。模型结构评估显示，RAD23C C端UBA结构域的负电表面（图3C）与SAP54的正电表面相互作用哎呀——/Phyl1。
鉴于已知RAD23 UBA结构域能结合泛素[72]，我们对预测的SAP54进行了叠加哎呀——/Phyl1模型和泛素结合到自噬受体NBR1（BRCA1基因1的邻近）UBA结构域，其晶体结构（PDB： 2MJ5;S10J 图）。结果显示Phyl1/SAP54哎呀——与UBA2的结合很可能与泛素的结合重叠（S10K图）。
The UBA2- SAP54哎呀——/Phyl1-AtRAD23C结构模型显示，SAP54的对面哎呀——/Phyl1与AtRAD23C的UBA结构域和AtSEP3的K结构域相互作用（见图3D），表明效应子相反方向的界面使其能够通过招募RAD23将MTF输送到蛋白酶体。这一机制类似于SAP05介导的SPL和GATA转录因子，通过招募26S蛋白酶体成分RPN10[33]，尽管SAP05结合的是vWA结构域，而非RPN10的泛素相互作用结构域。
结构模型验证显示，SAP54/Phyl1残基介导MADS-box和RAD23结合
为验证结构模型，我们将靶向突变引入SAP54AY-WB并利用酵母二杂交检测分析其与RAD23蛋白及MTF SEP3的相互作用（S7表）。SAP54AY-WB以及SAP54哎呀——共享84%的氨基酸序列同一性，且表现出高度的结构相似性（RMSD = 0.54 Å，覆盖67对修剪的原子）。
SAP54AY-WBK61E（螺旋A）、K106E和K110（螺旋B）突变体未与RAD23C相互作用，而它们与MTF的结合未受影响（见图3E，S11 A）。
相反，预测将破坏SAP54–SEP3界面的N59Y突变，消除了与MTFs的结合，同时保留了与RAD23C的相互作用（见图3E-F）。与这些结果一致的是，此前已鉴定的两种SAP54哎呀——参与MTF结合的/Phyl1残基[70]映射到与N59相同的表面（图3E-F）。N59Y突变对SOC1结合的影响不如SEP3和AP1深刻，表明SAP54残基的相互作用可能因特定转变因子靶点而异，这与SAP54/Phyl1同源物对MTF具有不同结合特异性[70]的结论一致。为进一步研究，我们生成了C9 SAP54/Phyl1同源物的多序列比对（S12A–B图）。参与结合RAD23C UBA结构域的K61、K106和K110残基在SAP54/Phyl1同源物中高度保守（S12A–B图）。相比之下，位于MTF相互作用面上的残基N59被发现为多态性（S12A–B图）。值得注意的是，Ca.植原体柑橘拥有两个SAP54/Phyl1同源物，其中一个携带天冬氨酸（N）残基，另一个（WEX20375.1）携带酪氨酸（Y），位于该位置（S12A图），表明某些植原体菌株拥有更多具有不同结合特异性的SAP54同源物。此外，在某些C类群成员中，该残基被带负电的氨基酸取代，进一步体现了多样化。
此外，SAP54中的I102F突变AY-WB消除了RAD23的结合，破坏了与AP1和SEP3的相互作用，这与I102在稳定A–B螺旋界面中的作用一致，该界面贡献于本质的正电表面（见图3E-F）。这凸显了结构完整性对效应子功能的关键重要性，与之前的研究结果一致[60]。
具有SAP54样折叠的蛋白质有助于植物浆效应子的多样性
我们识别出与SAP54及植物原体效应子结构相似网络中C9组其他成员在结构或序列上相关的簇（S13A图）。结构检查显示，这些簇由以α螺旋结构为主的蛋白质组成，包括预测的折叠，由一到四个螺旋组成（S13B-G见图）。例如，C48簇的成员预计将采用由两个反平行的螺旋线圈通过连接体连接的结构，类似于SAP54二聚体构型（S13G见图）。基于序列的分析一致表明，这些蛋白质是通过基因内串联部分复制产生的。值得注意的是，我们观察到C9和C48蛋白在植原体基因组中的分布存在互斥性，含有C9成员的蛋白缺乏C48成员，反之亦然，表明这些蛋白在功能上是冗余的或承担相似角色（S4表）。
为测试C48成员的功能相关性，我们检查了SPLL（MDV3139961.1）中的SAP54（C48代表）是否与RAD23蛋白相互作用。在酵母二杂交检测中，该蛋白特异性结合RAD23C和RAD23D，但不结合RAD23A或RAD23B，与其他SAP54同源物的结合谱相似（S13H见图）。这些发现支持C48成员作为功能效应子的作用，并强调串联复制如何促进以紧致α螺旋褶皱为特征的PhAME中效应子多样化和结构创新（S13I见图）。
PhAMEs中普遍采用的α螺旋架构
为了进一步探讨α螺旋PhAME的多样性，我们手动检查了AF预测的结构，并识别出若干由具有简单α螺旋结构蛋白组成的簇。值得注意的是，预测49.8%的PhAME簇主要由α螺旋褶皱组成（S14A–B图，S8表），呈现多种结构排列。这种普遍性凸显了α螺旋蛋白在植原体效应蛋白中的功能重要性和结构多样性。鉴于此类蛋白通常作为分子结合剂而非酶发挥作用，这表明蛋白质-蛋白质相互作用介质构成了植原体效应组的主要组成部分。
有趣的是，来自不同簇的PhAME常常采用反平行的螺旋卷褶皱。这些包括SAP68、SAP67、SAP66和SAP56，这些效应子在植物感染期间转录上调，并与SAP11共表达于多顺电子单元[32]。与SAP54类似，这些蛋白预计将形成带有向内疏水残基的两亲螺旋（S14C图）。然而，它们在表面电荷分布上存在差异（S14D 图），表明结合特异性存在差异。此前一致显示，SAP68、SAP67和SAP66在酵母二杂交试验中与SAP54相比，与不同的植物转录因子相互作用[73]，支持功能差异。这些发现表明植原体利用反平行的盘绕盘状基序作为多功能结合支架，使得通过相反表面与多样宿主靶点相互作用，这类似于SAP54的特性。
其他效应蛋白如SAP11、天狗样蛋白和SJP39也被预测为小型α螺旋蛋白，但采用不同的构象，表明宿主相互作用模式不同（见图1E、1F、1H）。例如，SAP11预计包含三个α螺旋，通过两个环连接（S15A图），并通过TCP的螺旋-环-螺旋二聚化结构域结合它们[35–37,73]。这种相互作用使TCPs不稳定，促进昆虫媒介繁殖，并引发如女巫扫帚和叶片形态改变等发育变化[37]。
SAP11样蛋白的二聚化模拟使TCP结合成为可能
为了进一步探究SAP11与TCP TF相互作用的结构基础，我们对SAP11进行了建模AY-WB–使用AlphaFold多重体的AtTCP10复形。模型得出的中间ipTM得分（0.705），与实验证据显示SAP11结合TCP二聚结构域（S15B图）一致。在模型中，SAP11AY-WB螺旋被发现与 AtTCP10 的螺旋-环-螺旋区域相互作用，这些环可实现螺旋的定位。预测的SAP11–TCP界面暴露出疏水性斑块（S15C，见图），其形似TCP蛋白的二聚化表面（S15D–E，见图;PDB：7VP1;[74]）。SAP11–AtTCP10模型与AtTCP10同源二聚体（PDB： 7VP1）的结构比较进一步表明，SAP11可能通过模拟该疏水表面来干扰TCP同源二聚体的形成（S15F见图）。这支持了一种模型，SAP11利用守恒的二聚化接口与TCP TF家族成员广泛交互。
在效应子网络中，SAP11样蛋白分布在C8、C85和C445簇中，分别包含180个、6个和1个成员（S16A图，S4表），与先前识别的SAP11类群匹配，具有对TB1、CIN和CYC TCP亚家族成员的独特结合特异性[73]。通过系统发育分析，利用额外的SAP11同源物恢复了这些演练，并额外发现了三个具有高引导支持的演化支（88、98和100;S16B，见图）。结构建模表明，SAP11样蛋白始终采用由三螺旋和两环组成的结构（S16C图），多重序列比对显示SAP11同源物预测的TCP结合界面处保守的疏水残基（S16B，S16D图）。这些特征支持SAP11样蛋白作为二聚化模拟者的模型，使其能够与广泛但特定的TCP TFs子集相互作用。
“蝎子”PhAME通过序列组成和β发夹重复次数多样化
除了聚集在具有SAP05样和α螺旋结构域的PhAME外，我们还发现了具有新结构的结构。这些包括相互连接的PhAME簇，具有独特的 β 层结构，通常具有 N 端α螺旋尾部（图4A，S6C 图），我们称之为“蝎子”。其中，C3和C46是成员最多的两个簇，分别包含284个和22个PhAMEs（见图4A，S4表）。功能注释显示，许多蝎子包含部分重叠、未表征的DUF2963域，这些域映射到β层域（S5表）。结构分析表明该结构域由多个β发夹重复组成。为更好地表征它们，我们采用了基于结构和序列的串联重复预测工具[75,76]，随后进行了额外分析（见材料和方法）。我们发现每个重复序列约有26个残基，某些位置显示出高度的序列守恒性（见图4B）。我们将重复作品命名为Scorpion，采用β发夹（hp）图案。使用HMMER v3.4对已识别的PhAME进行剖面搜索，发现多个蝎子β-hp基序重复序列数量不一，范围从1到24个不等（见图4C，S9表）。所有预测DUF2963域的PhAME均具有蝎子β发夹图案，符合我们AF2管线中其在不同结构类别中的分组。值得注意的是，其他具有β发夹的PhAME，包括属于C3和C46簇的，未发现蝎子β-hp重复序列（图4I-J），表明序列发散度较高或结构趋同。此外，某些植原体物种，如AY-WB植原体，编码六个重复数不同的蝎子PHAMEs（图4D-F），表明功能多样化。有趣的是，其中三种蛋白质编码在质粒中，另外三种编码在质粒样元素附近的染色体区域[27]，这表明这些蛋白可能是由（部分）质粒整合进染色体的过程演变而来。总体而言，我们发现了一类新型PhAMEs，它们进化出重复数量和序列的变化，促进了效应子的多样化（图4G）。
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图4。 β发夹状重复序列有助于具有蝎子折叠的PhAME多样性。
(A）具有β折叠的PhAME结构相似网络。基于结构的集群标注在节点旁，节点大小表示每个集群或单例内的PhAME数量。边表示簇成员间的结构相似性，由折叠寻度（E值≤0.001）确定。（B） TOP：蝎子β发夹图案的残留物保护水平。图谱是用Weblogo3生成的，二级结构分布在顶部。底部：β发夹结构的预测结构，残基守恒映射。序列守恒率采用AL2CO [118]中实现的基于熵的方法计算，并在ChimeraX中可视化。（C） 显示代表蝎子PhAMEs的簇中β发夹基序重复数的图表。图下方显示了各簇中植物原体分类单元及植原体系统发育中的三个主要分支的相对PhAME数量（S1A图）。（D-F）PhAMEs中分泌的AY-WB植原体蛋白（SAPs）具有预测蝎子状折叠的例子。串联重复单元以交替的蓝色和红色高亮显示。标注了每个模型的簇成员（如面板A、B）及平均pLDDT 分数。（G）导致蝎子折叠蛋白扩增和多样化的进化过程的示意概述。（H） 金黄色葡萄球菌（PDB： 7VFL）中SdgB糖基转移酶的晶体结构，其二聚化结构域与Scorpion PhAMEs的β发夹结构域相似，呈粉色。（I-J）具有β片结构但与（B）中β发夹基序无明显序列相似性的PhAMEs。标注了每个模型的簇成员（如面板A、B）及平均pLDDT 分数。对于（I-J），蛋白质的颜色从N端的蓝色到C端的红色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.g004
为了探索蝎子的潜在作用，我们利用Foldseek对PDB中实验确定的蛋白质结构进行了基于结构的搜索。有趣的是，蝎子β片结构域与链球菌和金黄色葡萄球菌糖基转移酶的多聚结构域相似，包括金黄色葡萄球菌的两种糖基转移酶SdgB（PDB： 7VFK）和SdgA（PDB： 7EC2）的二聚结构域[图4H]。这些结构结构的相似性表明蝎子也可能在植原体宿主中结合蛋白质和糖类。
莫利库特动物间宿主相互作用的保守策略
为研究PhAME与其他Mollicutes蛋白之间的结构相似性，我们使用Foldseek（E值≤0.001）对聚焦支原体门的AlphaFold数据库[78]进行了基于结构的筛选（NCBI分类编号：txid544448）。该数据集包含了至少1247个生物体的20万多个预测蛋白结构（S10表），涵盖了从自由生活生物到专性细胞内病原体等多种细菌生活方式。我们的分析鉴定了植原体PhAME与其他Mollicutes蛋白之间的共享折叠（图5A、S17、S11表）。PhAME相关蛋白的存在/缺失模式在许多情况下与物种的系统发育不符，表明存在普遍的基因丧失/增益和/或HGT。有趣的是，在植原体效应子中发现的若干折叠在其他莫利库特类中未见（S17图，S11表），表明该植原体具有不同的感染机制。
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图5。 植物原体PhAMEs及其他蛋白在莫利库特斯中保守。
（A）植原体PhAMEs表现出类似于其他Mollicutes类细菌中蛋白质的结构折叠。表格中白色圆圈的大小表示每种物种中与PhAMEs共享结构折叠的蛋白质数量，这些折叠存在于一种或多种植原体中。PhAME AF2模型通过Foldseek [107]（E值≤0.001）查询了由AlphaFold蛋白结构数据库[78]构建的结构数据库。基于蛋白质组预测的高水平完整性显示了六个RePh。仅纳入了两蛋白平均pLDDT得分均为50≥的匹配。展示部分PhAME簇。左图所示的最大似然系统发育树基于16S rRNA基因序列，使用RAxML程序和GTRGAMMA模型构建，经过MUSM多重序列比对[101]。节点支持评估为500次引导复制，引导值≥60%以紫色圆圈表示。枝长与核苷酸取代率成正比（参见尺度条）。枯叶芽孢杆菌被用作外群。NCBI分类识别码标注（txid）。树可视化是通过iTOL网络服务器进行的。热图是用TBtools-II生成的。代表已知属的莫利库特类群以颜色编码，物种通过注释表示其宿主关联或自由生活生活方式[119–134]。M. melaleucae和M. florum发现于植物表面，被认为是昆虫运输的产物。（b）实验确定了革兰氏阳性细菌李斯特菌（PDB： 4L3A）中InlK的结构，显示出类似免疫球蛋白的折叠，并带有额外的α螺旋（hIG样）。（C-G）其他具有hIG样折叠的毒力蛋白存在于软体物种中。标注了平均pLDDT（pLDDT）分数。（H）AY-WB植原体SAP20效应子的预测结构，该效应子属于基于结构的C43簇。标注了平均pLDDT（pLDDT）分数。（I–K）其他软体动物中选定具有C43样折叠的蛋白质。标示每个模型的平均pLDDT分数。由于AlphaFold蛋白结构数据库中pLDDT平均得分A0A221HZJ5较低，该结构模型被重新预测（详见材料与方法部分）。对于B-K，蛋白质的颜色从N端的蓝色到C端的红色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.g005
值得注意的是，PhAMEs的结构同源物在其他软体病原体中也被发现，许多病原体预测了分泌或膜定位（S12表）。特别是属于PhAME簇C122、C310、C480和C485的蛋白质，与牛支原体、菌支原体、无脊椎相关螺旋体、虫形体和中质体的蛋白质共享结构域，但在自由生活的软体动物中较少被检测到，如无胆质体（图5A、S17、S11表）).更深入的结构分析显示，这些蛋白质共享一个保守的核心，由两到三片β片组成，部分包裹在一个α螺旋上，通常以串联重复序列排列或与其他结构域融合。与蛋白质数据库（PDB）中实验确定的蛋白质结构比较显示，其内部InlK的D3和D4结构域（PDB： 4L3A）与另一种病原李斯特菌单核细胞增生体（Listeria monocytogenes，图5B）相似，后者因其β层和α螺旋结构被归类为“免疫球蛋白样”结构域（hIg样），[79]。
在单核细胞增生中，InlK会招募宿主Major Vault蛋白以规避自噬[80]。在软体动物中，hIg样结构域也存在于多种已知或疑似的膜相关蛋白中，如AMP（图5C）、P38（图5D）和VmpA（图5E），以及螺旋体和支原体，如Spiroplasma citri的ScARP3d（图5F）和Mycoplasma agalactiae的P40（图5G）。这些蛋白与发病机制，尤其是宿主细胞附着有关。例如，P38、P40和P89是带有保守的支原体粘附蛋白（MAM）的粘附蛋白，MAM对宿主相互作用至关重要[54]。我们的结构分析显示，MAM映射到hIg样结构域（S18A图），表明其直接参与宿主蛋白结合。这与已知实验数据一致，因为VmpA含有四个串联hIg样折叠，促进植原体与宿主细胞的粘附，可能通过与富含亮氨酸的重复蛋白相互作用，并通过网格蛋白介导的胞吞促进昆虫细胞进入[81,82]。植原体抗菌肽蛋白在其C末端具有跨膜结构域，这与其在植原体细胞外部的定位一致[83,84]。同样，含有两个hIg重复序列的植原体AMP蛋白与昆虫细胞内的肌动蛋白和ATP合酶亚基相互作用，并在植物寄生体传递过程中决定昆虫载体的特异性[52,85]，说明保守的结构模块如何多样化以介导与不同宿主成分的相互作用。
有趣的是，植原体中的IMP蛋白采用了不同的结构（PDB： 8J8Y），更像是含有镧状棒的结构域蛋白1，而非hIg样基序[86]（S18B Fig），并且能结合植物肌动蛋白[53,87]，证明了在植原体中肌动蛋白结合具有独立的进化起源。
PhAMEs与其他软体动物共享的另一折叠出现在C43簇中（图5A）。该组蛋白，如AY-WB的SAP20和SAP43，采用β夹层状折叠，无需额外结构域（图5H）。在其他软体动物中，这种折叠出现在预测的昆虫感染细菌细胞外蛋白中，这些蛋白质与肽酶C39融合（见图5I）、RIP样rRNA N-糖苷酶结构域（见图5J）和hIg样结构域（见图5K）。此类结构域也存在于螺旋体[88]及其他病原体[89]的效应子中，表明它们与宿主相互作用有关。值得注意的是，SAP20和SAP43在植原体定殖植物中比定殖昆虫的植物上调得更强[34]，表明植原体C43折叠的PhAME很可能调节植物过程。相比之下，编码同源蛋白的螺旋原体物种仅限于无脊椎动物宿主，唯独S. citri例外，后者同样是昆虫媒介植物病原体。
讨论
我们系统地分析了239个植原体基因组的效应子多样性，利用序列和预测结构关系，探讨这些效应子在基因组减少和宿主依赖生活方式限制下的进化过程。我们发现植原体效应子主要通过有限保守蛋白折叠内的结构变异实现多样化。特别是SAP05折叠在多个效应子间反复出现，体现了结合表面和重复结构的差异。常见致密α螺旋结构，可能反映了其结构稳定性和功能适应性。此外，我们还鉴定了一个此前未被鉴定的效应器家族——蝎子族，其特征为α螺旋和串联β发夹图案。最后，我们发现了不仅在植原体之间，也与螺体及其他细胞内软体效应体共享的保守折叠。这些发现共同强调了专性细胞内病原体效应组如何产生功能和结构多样性。
我们利用计算建模预测PhAME的结构，并基于结构和序列相似性进行聚类。值得注意的是，80.5%包含四个或以上PhAME的结构簇中至少包含24个代表性植原体（RePh组）中的一个成员，这些植原体涵盖了植原体系统发育的三大主要分支，且拥有完整的基因组测序。我们的数据集还准确复现了两个已知的效应子结构，并结合了可用的晶体结构，验证了我们流程中的蛋白质结构预测。此外，这些簇还包括了先前具有已知分子功能的效应子代表。最后，我们的分析揭示了与既有蛋白质折叠的相似性，以及植原体PhAME中存在新的结构结构，展示了结构系统发育学方法的强大[90]。综合来看，这些发现表明我们的方法成功捕捉了更广泛的植原体泛效应组内大部分结构多样性。
虽然部分PhAME结构域与其他软体中的蛋白质有相似之处，但植原体的整体效应蛋白组合在很大程度上是独一无二的。例如，对聚集的AlphaFold蛋白结构数据库（AFDB50）进行Foldseec搜索（E值≤0.001），该数据库包含生命树中超过5230万个预测蛋白质结构[62]，未发现表现出SAP05样折叠的PhAMEs结构同源物。这凸显了植原体效应子在结构层面的独特性。尽管基因组减少且HGT能力有限，植原体似乎通过多种机制实现效应因子多样化，包括基因内结构域复制、与无关序列的结构域融合、蛋白质-蛋白质相互作用表面的序列变异以及重复单元的扩增。这些策略可能在符合其细胞内生活方式的基因组和进化限制下实现功能多样化。
具有已知功能的多种植物浆效应因子趋同进化出一种共同策略：针对植物TFs的进化受限域，并通过招募26S蛋白酶体机制促进其降解。通过利用TF家族内保守且受约束的相互作用表面，这些效应子实现了广泛而特异的靶向。例如，SAP05 模仿双链 DNA 结合多重转变体的 DNA 结合域，而 SAP54 和 SAP11 则模仿转变形体多聚结构域。这些结构拟态策略使植原体效应子能够不稳定多个常常功能多余的宿主蛋白，增强其影响力，尽管其效应蛋白数量有限。
SAP05效应子是DNA拟育蛋白类别[91]中一个引人注目的新成员，该类结构类似核酸，能够劫持核酸结合蛋白。其他病原体效应因子，如Ralstonia PopP2和Pseudomonas AvrRps4，也针对WRKY转录物的保守DNA结合表面[92,93]。然而，PopP2并未促进降解，反而会乙酰化关键赖氨酸残基，阻断DNA结合，从而阻断转录活性[94]。虽然直接抑制DNA结合可能足以抑制TF功能，但植物TF家族内部的广泛冗余性可能促使植原体采用降解策略，确保以更少效应分子实现更完整的抑制。一贯地，表达SAP05和无法结合SAP05的RPN10突变版本（38GA39>HS）的植物不会出现女巫扫帚症状。这支持了仅阻断TF的DNA结合面不足以实现SAP05活性的结论[30]。SAP05蛋白揭示了还原基因组病原体如何利用巧妙的分子拟态技术劫持宿主细胞机制。
类似SAP05的折叠作为一个核心多元化平台出现。它具有保守的核心和可变交互环，允许伙伴特异性多样化，正如SAP05和PM19_00185观察到的那样。我们此前表明，SAP05环表面的突变会破坏TFs的相互作用，但不会干扰蛋白酶体泛素受体RPN10的相互作用[33]。在结合不同变形体的同源物之间进行的环交换实验（如SPL与GATA）证实了环的组成决定了靶点特异性[33]。在此，我们鉴定出更多具有发散环和不同伴侣的SAP05样蛋白，表明这些环是自然进化的。这为能够通过保持蛋白酶体结合同时改变靶向特异性，选择性地降解SAP05变异体提供了机会。
我们的结构分析显示，采用反平行螺旋结构的SAP54[42]具有两个截然相反方向的结合面：一个用于MTFs，另一个用于RAD23的C端泛素结合结构域。其他参与与MTF结合的残基位于与N59相同的表面[70]，而与RAD23结合的残基则位于相反表面。这些双界面使SAP54能够作为分子支架，连接MADS盒状变形体与RAD23（26S蛋白酶体的组成部分），从而介导其靶向且无依赖泛素的降解[30,43]。这种二分结合机制与SAP05相似，SAP05也通过直接蛋白酶体结合招募宿主TF进行降解。重要的是，我们证明SAP54可以被工程化以减少双因子结合，同时保留RAD23相互作用，为合成SAP05样系统提供选择性、无全素性蛋白质降解的潜在途径[33]。综合来看，这些发现凸显了一种保守的植原体效应器策略，通过结构介导的双重相互作用劫持宿主蛋白酶体机制。
尽管SAP11和SAP54采用α螺旋折叠，但它们在宿主蛋白靶向策略上有不同的作用。SAP11通过柔性螺旋和环与TCP的折叠二聚结构域相互作用，而SAP54采用刚性、疏水稳定结构，具有两个空间分离的表面，同时作用于MADS-box TFs和RAD23。这些机制展示了植物质效应子进化中的更广泛策略：通过模拟保守的蛋白质-蛋白质相互作用界面，以激活扩展的宿主蛋白家族的多个成员。具有简单α螺旋折叠的PhAMEs的丰富性，凸显了模块化、蛋白质结合的α螺旋效应子在植原体工具箱中的核心作用。
我们鉴定出一种新型效应子家族，命名为“蝎子”，其特征为N端螺旋线圈和C端β发夹重复序列阵列。这些蛋白质结构多样，重复次数和序列存在差异。具有不同重复配置的多个蝎子蛋白常常共存于同一植原体中，表明功能多样化。β发夹重复序列与靶点结合、亚细胞定位和结构稳定性相关[95]，它们类似于金黄色葡萄球菌SdgA/B等二聚酶中β片介导的相互作用域[77]。我们提出蝎子作为分子结合体，具有重复结构调优的相互作用范围和特异性。值得注意的是，使用80%结构重叠作为聚类标准，可能将含有重复的蝎子分裂成多个簇。
我们发现植原体效应子主要通过有限保守褶皱内的结构变异实现多样化，这与其基因在PMU中的定位相符。这些元素类似于共轭转座子，携带IS3家族插入序列[22,27,96]，长度可达20 kb，较短的变体常富含假基因[27]。PMU在植原体系统发育中广泛分布，并促进基因组大小变异，基因复制已被证明能驱动效应子亚功能化，例如WBDL的SAP05a和SAP05b结合不同的转录因子家族[30]。植原体基因组中IS元素和假基因的丰度反映了其他经历严重种群瓶颈的细菌观察到的模式，在这些细菌中，选择效能降低促进了可移动元素和假基因的积累[1]。这些元素支持对竞争性宿主环境的适应，尤其是在HGT有限条件下。植物等离子体的分离结合选择压力，可能推动效应子多样化，当这些效应子带来适应性优势时，当HGT有机会时，它们更可能扩散到其他植物质体。HGT可在特定情况下发生，如支原体整合共联元件（ICE）所示[21]。在植原体中，PMUs在昆虫媒介定殖过程中能产生染色体外单位[22]，这表明多种菌株共感染时PMU交换的机制[97]。越来越多的证据支持植原体中效应子PMU存在HGT[98,99]。综合而言，这些发现凸显了PMU作为新型效应子出现、复制和多样化的动态储存库。
相比之下，编码蝎子样效应子的基因通常存在于质粒或质粒衍生的染色体区域，如Ca。星化植原体AY-WB [27]。由于质粒序列常被排除在基因组组装之外，目前对蝎子多样性的估计可能较为保守。有趣的是，在Ca.澳大利亚植原体中，PMU序列被整合进质粒[100]，质粒与PMU之间的重组可能解释了连接SAP05、Scorpion和α螺旋簇的混合PhAME结构。这表明通过PMU/质粒相互作用实现的基因组不稳定性可能促进进化创新。
总之，我们的研究显示，针对宿主蛋白进化保守且结构受限表面的效应子在植原体中非常普遍。这些效应器采用紧凑高效的折叠，具备支架功能，特点是具有双重相互作用面，能够连接宿主蛋白或整合宿主通路。值得注意的是，具有这种作用机制的PhAMEs曾多次独立进化——这是基因复制、界面变异、结构域融合和重复扩展驱动的趋同进化的结果。尽管受到基因组还原和水平基因转移有限的限制，这些机制仍促进了新型折叠和功能的出现。虽然少数效应折叠与其他莫利库特科共享，但大多数是植原体独有的，凸显了其独特的进化轨迹和精细的宿主控策略。总体而言，这些见解加深了我们对植原体生物学及病原体-宿主相互作用原理的理解，同时为发现和设计具有生物技术潜力的新型生物分子开辟了新途径。
材料与方法
序列分析
从NCBI下载了莫利库特核苷酸和蛋白质序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。16S rRNA基因（≥完成度97%）通过MUSCLE [101]对应，配合默认参数。通过 RAxML 算法（GTRGAMMA 模型）[102]，在 Geneious Prime（v. 2024.07）中，使用 RAxML 算法和 100 或 500 引导，从比对的 16S 基因构建了最大似然系统发育树。不同植原体成熟SAP05、Phyl1/SAP54和SAP11的效应蛋白序列与MUSM比对，并在JIC高性能计算集群中用IQ-tree2软件[103]推断出最大似然系统发育树，数据为1000个自助链。
植物浆菌基因组完整性通过CheckM [57] v1.2.0测试，标记为莫利库特属。
植原体候选效应蛋白的数据挖掘
如同Bai等[32]所述，预测了植原体分泌组，但略有变化。简要地，从NCBI下载了植原体蛋白序列（S1表）。每个蛋白N端20–70氨基酸内的信号肽通过SignalP v3.0预测，参数如下：signalp -t gram + -f short -trunc 70 [104]，生物群设为革兰阳性。使用TMHMM 2.0评估了具有HMM评分和切割位点≥概率为0.50的蛋白质，具有以下参数的跨膜结构域[105]：tmhmm -short。去除预测信号肽后缺乏跨膜结构域的肽被鉴定为PhAMEs。
基于序列的子聚类
成熟的PhAME序列使用MMseqs2聚类算法[66]进行聚类，参数如下：--min-seq-id 0.5，--cov-mode 0，-c 0.8，--cluster-mode 1。
蛋白质结构预测
通过ColabFold with MMseqs2 BATCH笔记本，预测了来自24个植原体成熟PhAMEs的结构，以及来自未代表亚簇的3个代表，并预测了24个植原体。预测参数包括msa_mode：MMseqs2（统一研究+环境）、num_models：5、num_recycles：12和stop_at_score：100。对于每个蛋白质，选取五大生成模型中平均pLDDT得分最高的模型进行进一步分析，而平均pLDDT得分低于50的蛋白质则被排除在结构分析之外。在子簇缺乏平均pLDDT ≥50的结构模型时，从每个子簇中选取另外三个PhAME进行第二轮预测。
结构聚类与相似性搜索
对于每个包含平均pLDDT >50的成员的子簇，选出平均pLDDT得分最高的成员作为子群代表。随后，代表者使用Foldseek聚类算法[62]进行聚类，参数为-c 0.8、-e 0.001、--cov-mode 0和--cluster-mode 1。PhAME被分配到与其子群代表相同的簇。
蛋白质结构相似性使用Foldseek [107]评估，参数如下：foldseek easy-search -e inf --format-output “query， target， fident， alnlen， mismatch， gapopen， qstart， qend， tstart， tend， evalue， bits， alntmscore， qtmscore， ttmscore， lddt， lddtfull， prob”，针对氨基酸长超过12个的蛋白质，进行了预测的AlphaFold2模型，平均pLDDT ≥ 50。使用参数-e 0.1和-e 0.001分别进行了低阈值和高阈相似度搜索。蛋白质序列相似性使用MMseqs2[108]评估，参数为-e 0.01。网络可视化和分析在Cytoscape 3.10.2[109]中进行了。
针对非植物原体软体的结构基础相似性搜索，Foldseeek对平均pLDDT ≥50的预测结构进行了局部测试，该结构对应于Alphafold蛋白结构数据库[69]，使用与全盘搜索相同的参数。
结构相似性搜索针对实验确定的蛋白质进行了局部搜索，使用与上述参数相同的Foldseek，在PDB100 20240101[62]数据库中进行。
蝎子发夹（hp）重复识别
结合基于结构的重复识别工具RepeatDB-lite 1[75]和基于序列的预测工具HHrepID [76]，分析了含DUF2963蛋白的结构模型。为了确定重复次数，选择了两个工具都识别出的重复序列作为PSI-BLAST[110]对植物原样蛋白搜索的查询。搜索在五次迭代中以显著性阈值e = 0.005进行。由于这些序列的重复性，每次PSI-BLAST搜索后，只有具有多个命中点的蛋白质被保留。正命中结果被用来利用HMMER 3.4（http://hmmer.org）构建隐马尔可夫模型（HMM）。
线圈鉴定
使用Socket2服务器[111]评估线圈线圈结构模型，参数如下：Packing_Cutoff 8.5，Helix_Extension 0。TM比对分数使用Foldseec搜索算法与alntmscore计算
分子图形
通过 Chimera v.1.8 实现了蛋白质和配体的结构叠加和描绘。结构与 Chimera 软件中实现的 MatchMaker [112] 工具进行了结构比较 [113]。
视觉表现
热力图使用TBtools II [114]制作，图表使用R软件的ggplot2软件包（版本4.4.1）制作。系统发育树可视化使用iTOL网络服务器[135]。
函数和结构标注
功能注释使用interproscan-5.22.6[115]进行，默认参数如下
sap54突变体克隆
SAP54突变体由91个氨基酸长成熟肽序列组成，且不含N端分泌信号肽（33 AA），通过使用含有野生型和突变序列的引子及AY-WB模板SAP54进行定点PCR诱变增殖[1]。含有attB1和attB2重组位点的PCR片段分别在其5'端和3'端，使用BP Clonase II酶混合物（Invitrogen）克隆到供体载体pDONR221（Invitrogen），随后按照制造商指示用LR Clonase II（Invitrogen）导入目标载体pDEST32（Invitrogen）。所有构造序列包括替换突变均被验证。
RAD23C和RAD23D结构域的克隆
根据InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）的预测，使用AtRAD23C和AtRAD23D（MacLean等，[41]）扩增UBL和UBA结构域：RAD23C UBL结构域（aa 1–88）;RAD23C UBA1结构域（aa 182–242），RAD23C UBA2结构域（aa 353–419）。带有attB1和attB2重组位点两侧的PCR片段被用BP Clonase II（Invitrogen）克隆到pDONR221（Invitrogen），然后用LR Clonase II（Invitrogen）克隆到目标载体pDEST22（Invitrogen）。克隆结构域通过桑格测序得到了验证。
酵母二杂交测定
在ProQuest双杂交系统（Invitrogen）中，使用pDEST22（含GAL4活化结构域（AD）和Trp1营养选择标记基因）和pDEST32（含GAL4 DNA结合域（BD）和Leu2可选标记基因）进行检测，检测对象为MaV203菌株。将融合至AD的MADS-box TFsSOC1、SEP3、AP1和RAD23同源物C和D（pDEST22;MacLean等，2014，[41]）与成熟SAP54/sap54突变肽融合至BD（pDEST32）进行联合评估。酵母转化依据Gietz和Woods（2006）[116]进行了。在含有2%葡萄糖且不含Trp和Leu的合成定义培养基（SD）琼脂（FORMEDIUM）上，培养了与pDEST22和pDEST32衍生物共转化的酵母菌落。通过分析缺乏Trp、Leu和His（FORMEDIUM）中缺乏的SD琼脂生长，补充20 mM、25 mM、60 mM和75 mM 3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT，Sigma），或缺乏Trp、Leu、His和腺嘌呤的生长，以10mM 3-AT进行分析。对于每个酵母菌株，通过检测200微升酵母菌落悬浮液中的7微升分色（即一个酵母菌落在200微升无菌水中再悬浮）来检测四个独立菌落的相互作用。
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S1 图。 植原体含有不同数量的PhAMEs。
（A） 利用16S rRNA基因序列构建了最大似然系统发育树，其完整性≥为98%，与MUSCLE [101]对齐，并用GTRGAMMA模型和100次自助复制推断出RAxML。树表示是用iTOL完成的。属于16Sr IX组（鸽豆女巫扫帚组）的三个入植和两个未分类的植原体未被纳入树中。作为外组使用了Achoeplasma laidawii 16S rRNA基因。自助法值≥60%时用紫色圆圈表示。枝长与核苷酸替代率成正比，详见刻度条参考。系统发育树突出了三个植原体组，分别用不同的颜色表示，以及用罗马数字标示的独立16Sr组。“UP”表示16Sr组的未分类植原体。对于包含多个物种的分支，每个分支内的物种数量用三角形表示。三角形数包括具有98% 16S rRNA基因序列完整度<但已知16Sr组的植原体。每个物种的PhAMEs/基因组显示在系统发育树右侧，初始24个植原体的PhAME编号以红色表示，215个植原体中的PhAME编号以白色显示（见图1A）。对于紫菀紫苑紫苑，2006年Bai 等[32]报告的3种PhAMEs未被我们分析识别。（B）PhAMEs数量与蛋白质编码基因总数（左）和基因组大小（右）之间的正相关。点颜色表示CheckM分数，使用Mollicute标记集，这是基因组完整性的估计[57]。代表性植原体（RePh）的基因组以黑色标示。显示了皮尔逊相关系数（r）和p值（p）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s001
（TIF）
第二季 图。 大多数PhAME与代表性植原体（RePh）物种的效应子在序列上相似。
顶部：按序列基础子簇大小分组的PhAME数量。绿色条表示与RePh物种的PhAME聚集;黄色条表示没有的PhAMEs。横线以上百分比反映了各组在PhAME总集合中的比例。成熟长度<13个氨基酸的PhAME被归入“无RePh的亚簇/单子PhAMEs”类别。底部：按成员规模分组的子簇和单集群数量。鲑鱼区表示包含至少一个RePh衍生PhAME的亚簇;青色面积表示没有的。饼图下方的百分比表示各类别中子簇相对于总数的比例。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s002
（TIF）
第三季 图。 大多数PhAME结构的预测具有高置信度。
（A） AlphaFold v2.0-（AF2）预测模型中所有PhAMEs及仅RePh物种子集的pLDDT平均得分分布。箱形图表示四分位数范围（IQR），胡须表示整个范围（从最小到最大）。单个离群值以抖动点表示。（B）24种代表性植原体（RePh）物种中PhAMEs的平均pLDDT分数。图顶部标注了三大植原体类群及其对应的16Sr组。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s003
（TIF）
第四季，图。 AF2预测模型与SAP05和Phyl1/SAP54 PhAME的实验确定晶体结构相符。
实验确定的SAP05结构（来自（A）AY-WB和（B）OY-M植原体，以及SAP54（来自（C）OY-M和（D）PnWB植原体及其对应AlphaFold-2模型的结构比对。比对结构下方的RMSD分数由ChimeraX的Matchmaker指令计算。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s004
（TIF）
S5 图。 大多数PhAME被归类为结构相关的簇，并由高置信度结构模型支持。
（A） AlphaFold-2预测模型中子簇代表的平均pLDDT分数分布，每个代表是其子簇中平均pLDDT分数最高的序列。箱形图表示四分位数范围（IQR），胡须表示整个范围（从最小到最大）。（b）跨群组和单例的置信预测类别比例，按其最有信心预测类别中最高比例的成员排序。X轴标签表示包含至少一个成员的簇数量。对于每个序列不同的PhAME，仅表示置信度最高的模型。（C）基于结构的簇中基于序列相似度的子簇数量。每个群组成员的PhAME数量以颜色表示。单例未被纳入。（D） 顶部：按簇大小分组的结构基簇的PhAME数量。鲑鱼条代表与RePh物种的PhAME聚集，而深蓝色条代表不聚集的PhAMEs。柱以上百分比相对于聚集的PhAME总数计算得出。条内百分比与PhAMEs及分配的集群相关。底部：基于结构的簇或单例数量，按成员规模分组。蓝色区域表示包含至少一个RePh衍生PhAME的簇;橙色区域表示没有该区域的部分。饼图下方的百分比表示各类别中集群相对于总数的比例。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s005
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第六季 图。 具有结构相似性的不同簇中预测的PhAME结构。
（A）SAP05（左）的结构预测，属于C41簇，结构相关的SAP49（右）属于C41，均来自AY-WB植原体。（B）AY-WB植原体效应器SAP54（左）的结构预测，该效应体属于大型C9簇，包含众多结构相似效应子，并与其他相关簇如C48相关联。右图为来自甘薯小叶植原体的预测MD3178133结构，代表C48群。（C）预测的AY-WB植原体效应SAP25（C3簇，左）和结构相关SAP02（C46簇，右）。蛋白质的颜色从N端的蓝色到C端的红色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s006
（TIF）
S7图。 SAP05同源物结构保守。
（A） 采用最大似然法构建的RAxML系统发育树，包含第41簇成熟效应子序列，共1000次自助复制。纳入了Huang等人2021年报告但我们管道未能识别的同源物[30]。引导值≥70%以紫色圆圈表示。具有实验验证能介导SPL（绿色）、GATA（蓝色）或两种TF家族（橙色）降解能力的SAP05同源物[30]。分支长度与氨基酸替代率成正比，详见刻度条参考。树表示使用iTOL网络服务器完成[135]。（B） 肌肉[101]效应子的蛋白质序列排列，显示于系统发育树（面板A）。二级结构通过SAP05显示在排列上方AY-WB全长蛋白作为参考。SAP05的实验验证残基AY-WB参与与TF或RPN10相互作用的序列在比对共识序列下方（黑色字母）下标注。比对中的残基根据其化学性质进行着色。除一个聚集在sC535的SAP05同源子外，所有SAP05同源物均聚集于sC42亚群。重复序列被纳入一次。（C）顶部：将部分SAP05同源物预测结构叠加到SAP05晶体结构上AY-WB（PDB： 8PFC），在 ChimeraX 中使用 Matchmaker 命令执行。结构通过均方根偏差（RMSD）着色，蓝色表示高度相似，红色表示与 SAP05 的低相似度AY-WBRMSD为5 Å的区域以灰色表示>。下图：AF2预测的结构模型与SAP05同源物相同，并加入了MDV3198312.1。彩色轮廓表示经实验验证的介导SPL（绿色）、GATA（蓝色）或两种转录因子家族（橙色）降解的能力[30]。（D）映射到SAP05晶体结构的cC42亚簇（不含MDV3198312.1）中SAP05同源物残基的守恒水平。序列守恒性使用基于熵的方法AL2CO [118]计算，该方法在ChimeraX中实现并可视化。（E） 绑定SAP05的A. thaliana GATA18的正面（左）和上（右）视图哎呀——（PDB：8J48）。（F）智人GATA3（HsGATA3）与其目标DNA序列（GATA DNA BS）（PDB：4HCA）结合的正面（左）和上（右）视图。（G-H）重叠的GATA转录因子表面与SAP05和DNA相互作用。在ChimeraX （G）中使用Matchmaker指令，将A. thaliana的GATA18与SAP05（PDB： 8J48）和H. sapiens GATA3结合DNA（PDB： 4HCA）进行结构叠加。与SAP05和DNA相互作用的GATA表面特写图，其氨基酸残基与SAP05和DNA相互作用，表示为棒状和标记（H）。灰色球体表示Zn2+离子（E-H）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s007
（TIF）
第8季，图。 尽管序列同性较低，SAP05样蛋白具有高度的结构相似性。
（A）结构相关簇中具有SAP05样折叠的蛋白质在结构（左）和序列（右）相似度水平。序列身份值基于基于结构的比对利用Foldseek计算。对于每个序列不同的PhAME，仅表示置信度最高的模型。（B-G）图2C–F和2I所示的选定簇代表中预测SAP05样折叠的蛋白质部分。颜色表示结构相似度，基于RMSD与SAP05实验确定的结构AY-WB，使用 ChimeraX 中的 Matchmaker 命令。灰色区域表示RMSD>5埃。使用每个群体中平均pLDDT分数最高的代表性模型进行比对。SAP05样结构域通过FoldMason[117]通过序列无关的多结构比对定义，并加入了额外的残基以涵盖完整的β5 β页。全长蛋白的簇数和平均pLDDT标注在结构下方。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s008
（TIF）
S9 图。 SAP54/Phyl1系统发育学。
（A） 由C9簇SAP54/Phyl1效应子比对构建的最大似然系统发育树，见（A）1000次自助复制（IQ-TREE2，[103]）。70%≥自助股价值用紫色圆圈表示。枝长与氨基酸替代率成正比（参见尺度条）。该树是通过iTOL网络服务器[135]进行可视化的。岩渊等（2020）[70]识别的系统发育类群有颜色编码。（B）C9簇代表成员的晶体结构和AlphaFold-2模型，颜色从N端的蓝色到C端的红色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s009
（TIF）
S10 图。 SEP3–SAP54–RAD23复合物的结构基础预测。
（A） Phyl1/SAP54的AlphaFold-Multimer（AF-M）预测哎呀——–AtSEP3复合体。AF-M正确识别AtSEP3的146–175残基（蓝色高亮）参与与SAP54的相互作用，这与先前数据一致[43]。右图：最高置信模型的预测对齐误差（PAE）图，显示残基对之间估计的位置不确定性。蓝色表示低预测误差（高置信度），红色表示高误差（低置信度）。（B–C）预测SAP54的曲面表示哎呀——/Phyl1–AtSEP3 配合物，其库仑静电势映射到 （B） SAP54哎呀——/Phyl1 和 （C） AtSEP3。表面的颜色从正电（蓝色）到负电荷（红色）。静电势是用 ChimeraX 计算的。（D） AtSEP3 K域二聚体的晶体结构（PDB： 4OX0）。指示的螺旋1参与SEP3的二聚化，螺旋2参与SEP3的二聚化和四聚化。（E） 预测SAP54的结构叠加哎呀——/Phyl1–AtSEP3复合体与AtSEP3 K域二聚体，突出涉及MADS盒多聚化和SAP54结合的重叠界面。（F） AtSEP3 K 结构域，其中一个单体如 （B） 中着色。（G） 预测SAP54哎呀——/Phyl1–AtRAD23C复合物，使用AF-M生成。实验数据支持，RAD23C的C端UBA2结构域被正确预测介导该相互作用（见图3A;[43]）。（H） 最高置信度SAP54的PAE图哎呀——/Phyl1–UBA2（AtRAD23C）型号，颜色如（B）所示。（一）SAP54的结构叠加哎呀——/Phyl1–AtRAD23C复合体使用ChimeraX MatchMaker工具。（J） 人类NBR1与泛素（PDB： 2MJ5）复合物中UBA结构域的晶体结构。（K） 预测SAP54的结构叠加哎呀——/Phyl1–UBA2（AtRAD23C）复合物与UBA（NBR1）-泛素复合物，表明SAP54靶向UBA结构域中泛素相互作用的表面。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s010
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第11季 图。 与图3E相关的Y2H检测的酵母转化控制。
双沉降（SC-LW）培养基上的生长证实了这两种结构的存在。EV：空矢量;AD：GAL4活化结构域;BD：GAL4 DNA结合结构域。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s011
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第12季 图。 SAP54/Phyl1效应子共享与植物靶点相互作用的保守残基。
（A）肌肉[101]C9簇SAP54/Phyl1效应子的蛋白质序列比对。次级结构通过SAP54显示在对齐顶部AY-WB全长蛋白作为参考。它们对应的系统发育分支[70]（Phyl-A、Phyl-B、Phyl-C、Phyl-D）在右侧以黑色标示。检测其在SAP54结合剂相互作用中的作用（见图3）的残基在比对下方标注三角形（蓝色：RAD23相互作用;绿色：TF相互作用）。I102残基对维持SAP54/Phyl1结构至关重要，用黄色三角形表示。（B）SAP54的预测结构AY-WB从N端的蓝色变为红色，C端（上端）残基守恒（中间）和库仑静电势（下端）为红色，后者映射到蛋白质表面。序列守恒率通过基于熵的方法计算，采用AL2CO[118]，静电势则用ChimeraX库仑指令计算。标注了影响SAP54与其结合剂相互作用的残基。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s012
（TIF）
第13季，图。 基因内串联重复有助于α螺旋褶皱的多样化。
（A） 结构相似于SAP54蛋白的PhAME簇（C9簇）。节点大小反映了集群内PhAME的数量。边表示簇间的成对相似性：灰色边表示序列相似性（MMseqs2，E值≤0.01），橙色边表示结构和序列相似性（Foldseek E值≤0.001，MMseqs2E值≤0.01）。（B-G，I）预测的选定PhAMEs的AF2结构，成员归属（E）所示簇。显示了群聚成员和平均pLDDT结构置信度评分。蛋白质的颜色从N端的蓝色到C端的红色。（H）甘薯小叶植原体（SPLL）的C48簇SAP54样蛋白也与A. thaliana的RAD23蛋白相互作用。酵母二杂交（Y2H）检测显示SAP54的相互作用AY-WB以及“SAP54”SPLL（大声疾驰）与A. thaliana RAD23蛋白一起。右图：用Y2H检测SAP54相互作用AY-WB以及A. thaliana RAD23。EV，空矢量控制。AD，GAL4-激活结构域。BD，GAL4-DNA结合域。SD-LWH，三重脱出培养基，不含亮氨酸、色氨酸和组氨酸;3-AT，3-氨基-1,2,4-三唑，一种HIS3酶的竞争抑制剂。双沉降（–LW）培养基上的生长证实了这两种构造的存在。（J） 进化过程的示意概述，这些过程导致具有SAP54样折叠的蛋白质扩增和多样化。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s013
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第14季 图。 PhAME由简单的α螺旋折叠组成，有助于植原体全效应组的多样性。
（A） 饼图，显示簇（左）和PhAMEs（右）具有小α螺旋折叠的比例。单例被排除在分析之外。（B）PhAME结构相似网络，展示簇间关系，使用比图1B更宽松的阈值（Foldseek，E值≤ 0.1）生成，以探讨更发散折叠间的相似性。节点大小与每个集群中PhAME数量成正比。预测采用螺旋结构的簇以三角形表示，而带有其他褶皱的簇则以圆表示。在该放松阈值下识别出的单一结构相似性以红色标示。不连通节点代表没有可检测到结构相似性的簇。（C）由反平行螺旋α螺旋组成的精选AY-WB植原体效应子，属于不同的结构簇。所有效应子都共享与Socket2预测的螺旋线圈区域，黑色显示，疏水面由白氨酸、纈氨酸和异亮氨酸残基（橙色显示）形成，朝向蛋白质内部。标注了每个模型的群聚成员（如面板B）及平均pLDDTT得分。（D） 参与宿主目标结合特异性的反平行线圈α螺旋效应器的静电表面电位在面板C中不同。表面颜色从正电（蓝色）到负电（红色）不等。SAP54的正电表面被突出显示，参与与RAD23C的相互作用。静电势通过 ChimeraX 库仑指令计算。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s014
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S15 图。 SAP11效应子参与结合植物TCP转录因子的预测结构特征。
（A） SAP11的AF2预测结构AY-WB结构显示三条α螺旋（α）和两个环（L），颜色从N端的蓝色到C端的红色。标注了平均pLDDT（pLDDT）得分。（b） SAP11的AF-多聚体预测结构AY-WB-ATTC10综合体。模型预测转录因子的TCP结构域介导与SAP11的相互作用AY-WB，而SAP11则是AY-WB核定位信号（NLS）和C端区域不预测会对结合有贡献，这与实验数据一致[35–37]。最高置信模型的预测比对误差（PAE）图，展示了残基对之间估计的位置不确定性。蓝色表示预测误差低（高置信度），红色表示预测误差高（置信度低）。（C）由两个环α2及α1和α3部分组成的口袋形成一个脂溶区，结合TCP二聚化中涉及的TCP结构域的盘绕线圈结构——该TCP二聚化结构域被珍贵地证明是结合SAP11蛋白特异性所必需[36]。表面颜色从亲水性（深青色）到疏水性（金色）。脂溶性潜能通过 ChimeraX mlp 命令计算。（D–E）通过实验确定了参与 TCP10 二聚化的 TCP10 结构域螺旋圈区域的二聚体结构（PDB： 7VPI）。在 （E） 中，一个单体表面表现上映射了亲脂电位。显示了 DNA 结合区。（F） AtTCP10 同源二聚体与 SAP11–AtTCP10 异源二聚体的结构叠加显示，AtTCP10 的螺旋环-螺旋基序在结合效应子时呈现与其他转录因子相互作用时类似的折叠。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s015
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S16 图。 介导与TCP转录因子盘绕线圈二聚化结构域结合的区域在SAP11同源物间保持保守。
（A） MUSCLE [101] 效应子在面板A中显示的蛋白质序列排列。二级结构元件基于其在SAP11中的相对位置，映射在比对上方AY-WB结构。 簇成员（C8、C85、C445）在右侧标示。残基根据疏水性着色[136]。对于序列相同的效应子，使用单一代表体进行比对和进一步分析。（B）基于1000个引导复制，使用最大似然法构建的RAxML系统发育树，使用成熟SAP11和SAP11样效应子序列，从C8、C85和C445簇中构建。引导值≥70%以紫色圆圈表示。白色文字表示具有确认TCP TF结合的同源物[73]，黑色文字表示尚未评估的同源物。结合Cyc/TB1、CIN或Class I TCP转录因子的能力，根据Correa Marrero等，2023[73]所示。根据Correa Marrero等，2023年描述的系统发育分支以颜色编码。枝长表示氨基酸取代率（见比例条）。树状可视化使用iTOL网络服务器[135]完成。（C）对选定SAP11相关簇及亚簇成员的结构预测，显示其保守结构类似于SAP11AY-WB. 标示每个模型的簇成员关系和平均pLDDT分数。蛋白质颜色从N端的蓝色到C端的红色。（D）SAP11的序列守恒（上方）和亲水性（下方）AY-WB映射到其分子表面。预测介导TCP结合的疏水界面表现出高度的序列保守性。在ChimeraX中，基于AL2CO熵的评分和mlp命令计算了序列守恒和分子脂溶性潜能。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s016
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S17 图。 植原体PhAMEs及其他蛋白在莫利库特斯中保守——从图5延伸至包括植原体特异的折叠。
植原体PhAMEs表现出类似于其他莫利库特类细菌中蛋白质的结构折叠。表格中白色圆圈的大小表示每种物种中与PhAMEs共享结构折叠的蛋白质数量，这些折叠存在于一种或多种植原体中。PhAME AF2模型通过AlphaFold蛋白结构数据库[78]构建的结构数据库进行查询，该数据库仅限于Mycoplasmatota门（NCBI分类编号：txid544448）的蛋白质，使用Foldseek[107]（E值≤0.001）。基于蛋白质组预测的高水平完整性显示了六个RePh。仅纳入了两蛋白平均pLDDT得分均为50≥的匹配。左图所示的最大似然系统发育树基于16S rRNA基因序列，使用RAxML程序和GTRGAMMA模型构建，经过MUSM多重序列比对[101]。节点支持评估为500次引导复制，引导值≥60%以紫色圆圈表示。枝长与核苷酸取代率成正比（参见尺度条）。枯叶芽孢杆菌被用作外群。树可视化是通过iTOL网络服务器[135]进行的。热图是用TBtools-II生成的。代表已知属的莫利库特类群以颜色编码，物种通过注释表示其宿主关联或自由生活生活方式[119–134]。M. melaleucae和M. florum发现于植物表面，被认为是昆虫运输的产物。NCBI分类识别码标注（txid）。已识别的植原体效应子具有簇状成员。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s017
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S18 图。 hIG样结构域包含Mollicute粘附蛋白基序（MAMs）。
（A）位于毒力蛋白P38、P89和P40的hIG样结构域（红色显示）内的MAMs。（B）在实验确定的Ca结构中未检测到MAM。马里植原体IMP蛋白（PDB：8J8Y）。IMP的颜色从N端的蓝色到C端的红色。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s018
（TIF）
S1表格。 本研究中使用的植原体基因组组装质量。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s019
（XLSX）
S2表格。 假定的植原体效应因子（PhAMEs）预测。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s020
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S3表格。 植物原体蛋白被注释为部分。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s021
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第四季表格。 基于结构的簇和序列的亚簇对假定的植物质效应因子（PhAMEs）分布。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s022
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S5表格。 PhAME中的InterPro签名。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s023
（XLSX）
S6表格。 来自AlphaFold数据库的植物浆AlphaFold-2结构模型（NCBI分类编号：txid33926）表现出SAP05样褶皱。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s024
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S7表格。 SAP54 突变体见图3E及补充图11。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s025
（XLSX）
S8表格。 具有简单α螺旋折叠的PhAMEs。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s026
（XLSX）
S9表格。 PhAME中蝎子发夹图案的数量。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s027
（XLSX）
S10表格。 AlphaFold数据库中莫利库特AlphaFold-2结构模型列表（NCBI分类ID：txid544448）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s028
（XLSX）
S11表格。 来自AlphaFold数据库的Mollicute AlphaFold-2结构模型（NCBI分类编号：txid544448）显示出与PhAMEs的褶皱相似性。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s029
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S12表格。 分泌型和跨膜型mollicute，其折叠与PhAMEs相似。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011946.s030
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确认
我们感谢JIC信息学平台和诺里奇生物科学研究所研究计算部安装的软件，感谢Hogenhout实验室成员，以及Pip J. Mountjoy的批判性阅读和反馈，以及ChatGPT提升文本和代码的清晰度。
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