厦门免费医学论文发表-涡虫背腹边界调节前后轴的生长和图案

克洛伊·梅布伦，艾萨克·奥德伯格，迈克尔·加维尼奥，托马斯·库克，崔京勇，韩钟允，彼得·雷迪恩

 

抽象

再生可以涉及生长物中模式形成与预先存在组织的空间模式（例如沿体轴）的协调。涡虫成体轴图案是揭示这种图案整合机制的可靠背景。我们研究了在背腹侧 （DV） 正中平面处围绕动物外围的背腹边界 （DVB） 如何调节前后 （AP） 轴的生长和模式。我们定义了一个空间 DVB 基因表达图谱，其中包括编码信号传导、粘附和转录因子的基因。Wnt 抑制导致前位置信息诱导和异位头形成，这仅限于 DVB。DVB 可以移植，并且可以在异位位置通过实验诱导 DVB 身份。异位DVB能够在Wnt抑制后进行前位同一性诱导，从而能够在实验规定的位置产生具有异位头的动物。DVB 去除可阻断通常遵循 Wnt 抑制的前向化，并阻止头部再生过程中的前位置信息表达。Wnt 抑制后 DVB 的前位置信息诱导独立于前极形成发生，从而促进再生中的头部模式。我们的研究结果揭示了跨身体轴模式整合的分层模型，其中 DV 模式是核心，通过产生能够指导大 AP 轴区域形成的 DVB。这种机制使得在再生背景下能够协调正交位置信息。

 

介绍

许多生物体可以再生附肢或身体轴的重要部位[1,2]。在再生过程中，组织必须在体内的正确位置形成，并相对于剩余组织正确定向。这种再生属性对模式生物学提出了独特的挑战。因此，位置信息如何跨新的和预先存在的成体组织的轴进行整合是再生领域一个核心且研究不足的问题。

 

涡虫可以从大量损伤中再生，包括身体的小碎片[3]。涡虫身体平面图沿三个轴组织：前后 （AP）、背腹 （DV） 和内侧外侧 （ML）。位置信息是指影响细胞类型、器官和附件的区域身份和组织的因素[4]。跨身体轴的位置信息，例如在动物发育过程中，促进了身体计划的组织[5\u20128]。成年涡虫的位置信息包括称为位置控制基因 （PCG） 的基因产物。PCG沿着一个或多个身体轴组成型和区域表达，在抑制时要么具有异常的模式表型，要么通过同源性预测为涡虫模式通路的一部分[9]。大多数PCG主要在涡虫肌肉中显示出组成型区域表达[9]。

 

在发育过程中，大多数动物利用规范的Wnt信号来控制AP轴上的模式形成，而Bmp信号则用于控制DV轴上的模式[5\u20127]。涡虫AP轴主要由规范的Wnt信号[10]组成。后部表达的Wnt配体和前部表达的Wnt抑制剂系统建立了β-catenin-1信号传导活性的后后梯度，这是建立和维持区域组织身份所必需的[11\u201220]。β-catenin-1的RNAi在横截后导致头部代替尾部再生，并诱导未受伤动物异位头的形成[11\u201213]。两个FGFRL-Wnt模块和Src调节涡虫头部和躯干模式[21\u201223]。Bmp信号控制涡虫DV模式[10]。编码bmp4基因的Bmp配体的表达仅限于背肌，呈内侧到外侧梯度[9,24\u201226]。bmp4的RNAi或下游途径成分smad1导致未受伤动物的进行性腹侧化[25\u201227]。在正常再生过程中，体轴的主要区域在胚基（再生生长物）中以正确的方向产生，并与截肢碎片内预先存在的模式相对于正确的方向产生，这表明存在协调轴向再生的机制。

 

bmp4是沿AP轴再生图案所必需的[28]。在涡虫图案的理论模型中提出了DV模式告知AP轴建立位置的可能性[29,30]，并得到以下观察结果的支持。前极是一簇特殊的肌肉细胞，在头部再生过程中组织模式[31\u201233]，形成于DV正中平面[34]。动物的这个区域，有时称为背腹边界 （DVB），由动物外侧边缘的表皮和表皮下基因表达区定义，背侧和腹侧相交处。该DVB位置由DV轴上的图案化过程设置，涉及背侧Bmp信号传导[25\u201227]。我们还注意到，β-catenin-1 RNAi后异位头部的形成仅发生在动物外侧边缘（体缘）[11\u201213]。DV 对抗可以促进其他生物体某些模式环境中的轴形成。例如，在果蝇中，翅膀假想盘中背侧和腹侧细胞之间的相互作用驱动了翅膀的生长[35,36]。在果蝇背侧和腹侧细胞之间创建异位边界的基因作可以导致翼叶异位生长的形成。伤口闭合期间的DV接触被提出可促进涡虫胚芽肿的形成[37,38]。整个动物界的不同生物体（例如那些能够进行全身再生的生物体）是否在成年阶段存在调节再生的 DVB，以及任何此类成年 DVB 在再生环境中的机制作用仍然没有得到很好的解决。因此，涡虫 DV 中平面上存在一个在再生中具有候选调节作用的区域，使涡虫成为研究成年 DVB 的再生作用和性质的有吸引力的场所。

 

在这项工作中，我们发现DVB对于低Wnt环境中涡虫头部的形成是充分且必要的。通过纵DVB的模式，可以诱导头部从动物的背侧长出，或者在Wnt-low环境中或朝前的伤口（AFW）处阻断来自动物外侧边缘的头部位置信息表达。我们的研究结果支持再生中跨身体轴模式整合的分层模型，横向 DV 正中平面协调大 AP 轴区域的生长和模式化。

 

结果

AP 和 DV 轴在很大程度上独立地维持稳态模式

涡虫成虫位置信息的维持对于组织更新和损伤后的再生很重要[10]。为了在稳态组织维持期间保持轴之间具有适当空间关系的位置信息，原则上，沿一个轴的位置信息可能需要来自另一个轴的输入。抑制β-catenin-1导致稳态前向化[11\u201213]（S1A图）。然而，DV不对称组织[12]以及背侧偏置（bmp4，nlg-8）和腹侧偏置（admp，nlg-7）PCG表达在β-catenin-1 RNAi后保持不变（图1A，S1B和S1C），表明在成人组织更新期间维持DV模式不需要Wnt信号传导。bmp4的抑制导致稳态腹侧化[25\u201227]（S1D图），已被提出通过抑制Wnt来整合DV和AP轴的图案化[39]。与Clark（2023）[39]的研究结果一致，我们发现wnt1细胞的结构域（后极）在bmp4 RNAi45天后扩展（图1B和S1E）。bmp4 RNAi动物的fz4-1表达结构域也同样延长。然而，wntP-2或ndl-3表达结构域没有明显变化（图1B）。由notum标记的前极被扩大，尽管程度小于后极（图1B，S1F和S1G）。 然而，如之前报道的那样，没有观察到前PCG表达结构域（sFRP-1、ndl-5）的显着变化（图1B和S1F）[39]。此外，bmp4 RNAi 后沿 AP 轴的 PCG 表达结构域的位置和相对顺序基本保持不变，这表明 Bmp 信号传导并不是维持广泛 AP 模式的严格必要条件，但可能限制了 AP 轴最后方模式结构域的范围。这些结果表明，轴整合可能主要在低Wnt环境中的再生或异位头形成期间完成，此后的模式在细胞更新期间由每个轴独立地基本稳定地维持。

 

再生中 DVB 中 PCG 表达的组织

在头部再生过程中，被notum转录物标记的前极细胞在DVB处形成病灶[34]。我们使用表达层粘连蛋白B的表皮细胞作为DVB的参考点，该层蛋白B标记了DV的外侧正中平面[38,40]。在截肢后96小时（hpa），该DVB位置位于肌肉背侧高bmp4结构域的腹侧，并且与肌肉中admp表达的已知位置一致[9,41,42]在外侧DV正中平面（图1C和S1H）。前 PCG sFRP-1、ndl-4 和 ndl-5 的表达以 DVB 为中心（图 1C 和 S1I），并在与 laminB DVB 位置并列的背侧和腹侧显示出峰值行为（图 1D 和 S1J）。被wnt1标记的成熟后极背偏[13,16,43]，但在尾部再生过程中在DVB附近以96 hpa的速度形成簇（图1C和S1I）。后部PCGswnt11-1和fz4-1的表达以层压BDVB为中心（图1C和S1I），并在DVB并列的背侧和腹侧显示出峰值行为（图1D和S1K），类似于前部PCG的情况。这些结果将涉及头尖和尾尖PCG表达的图案化过程与DVB的位置联系起来，并支持轴整合的潜在机制[34]，其中DVB是引导沿AP轴正确再生的关键标志。++

 

异位头在 β-catenin-1 RNAi 后在 DVB 形成

在稳态组织更新过程中，异位头部在β-catenin-1 RNAi之后在动物外围形成，偶尔在涡虫咽部附近的头部除外[11\u201213]。β-连环蛋白-1RNAi导致前PCG sFRP-1和ndl-4横向异位灶性表达，以椎层B DVB为中心（图1E和S1L）。前 PCG 在某些区域与 DVB 并列的背侧和腹侧显示出峰值异位表达（S1L 图）。异位前PCG（sFRP-1，ndl-4）表达发生在DVB附近的多种肌肉亚型中[44,45]，包括纵向肌（沿AP轴定向的肌肉）、环形肌（沿ML轴定向的肌肉）和外侧DV肌（在体缘沿DV轴定向的肌肉）（图1F和S1M）。β-catenin-1 RNAi动物中的异位前PCG（sFRP-1，ndl-4）表达发生在表达DVB PCG admp的大部分（62.0%）肌肉细胞中[9,41,42]（图1G）。异位前PCG（sFRP-1，ndl-4）在DVB处与其他肌肉富集基因共表达，包括乳粘蛋白（dd_5463，如下所述）和netrin-1[46,47]（S1N图）。尽管前 PCG（sFRP-1，ndl-4）表达集中在 β-catenin-1 RNAi 之后的 DVB 病灶中，但在动物中也检测到表达前 PCG 的散粒细胞分散（不在病灶中）（S1A 图）。接下来，我们特异性地分析了 β-catenin-1 RNAi 动物中 DVB 处集中发生的前 PCG 表达。+

 

DVB 肌肉中基因表达的空间图谱，包括编码细胞表面和信号分子的基因

鉴于涡虫 DVB 在图案形成中的潜在意义，以及其分子决定因素知之甚少的事实，我们试图定义 DVB 肌肉基因表达的空间图谱。我们对动物的侧缘进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）以富集DVB细胞（S2A和S2B图）。DVB 的所有主要肌肉亚型都出现在我们的数据中（S2C 图）。先前文献中已知的体缘标志物（admp [41,42]、egf-6 [48]、wnt-5 [14,16]、unc5-B [46]、ephR-2 [25]、netrin-1 [46,47]、卵泡抑素 [49,50]、noggin-1 [25,41] 和 netrin-3 [44，47,51]）主要在DVB的纵向肌肉中显示表达（S2C图）。一些DVB标记物还在外侧DV肌（nk4）和/或环形肌（nkx1-1）中显示表达（S2C图），但来自环状肌的亚聚类数据没有按其DV起源位置来分离细胞（S2D图）。++

 

来自纵向肌肉细胞的亚聚类 scRNA-seq 数据确定了四个总共的亚簇。已知在DVB表达的转录本富集在亚簇1中（图2A，S2E和S2F），表明该亚簇中富集表达的基因可以代表DVB表达的基因。32个基因在亚簇1中显著富集表达;其中 9 个基因先前被描述为在身体边缘表达，其中 23 个新的 DVB 基因。我们通过FISH评估了这32个基因的表达，并结合了laminB作为共同的空间参考标记。这产生了DVB肌肉中基因表达的空间图谱（图2B-2D，S2G和S2H）。先前鉴定的DVB标记物在背侧（admp，egf-6，wnt-5，unc5-B，ephR-2），腹侧（netrin-1，卵泡抑素），重叠（noggin-1）或背侧和腹侧（netrin-3）相对于层粘连B的DV轴结构域中表达（图2B—2D）。除了这些已知的DVB标记物外，还有9个其他基因（乳粘蛋白（dd_5463）、ephR-3（dd_27668，dd_39545）、肌钙蛋白-2（dd_7974）、frem-1（dd_5187）、netR、dd_30210、delta-3、coupTF-1（dd_33286）和zfp-4（dd_29263，dd_21349））也在DVB处相对于层蛋白B的特定结构域中表达（图2B—2D，S2I和S2J ).乳酸粘蛋白是一种分泌蛋白，可以结合阴离子磷脂[52]。肾上腺素受体介导肾上腺素的作用，肾上腺素是一类膜结合信号配体，可促进多种细胞反应，包括吸引、排斥和迁移[53]。FREM-1编码一种细胞外基质蛋白，有助于发育过程中的上皮间质完整性[54]。Netrin受体介导分泌的Netrins的引诱和驱避特性，引导细胞和轴突的发育迁移[55]。dd_30210编码一种没有特征PFAM结构域的新型蛋白质。delta-3 编码膜结合的 Notch 信号配体。Notch信号传导调节多种发育过程，包括细胞命运的决定[56]。COUP转录因子编码孤儿核受体，调节发育过程中的多种细胞过程[57]。ZFP-4编码一种新型锌指蛋白。使用我们的 scRNA-seq 数据，我们计算了 DVB 图谱中 18 个基因与 FISH 检测到的表达的所有成对比较的 Pearson 相关系数。在DVB的纵向肌肉细胞中，许多基因的表达显示出高度相关性（r > 0.5）（S2K图），表明单个肌肉细胞共表达DVB的多个标记物。有 14 个转录本富集在纵向肌肉亚簇 1（S2E 和 S2F 图）中的基因没有显示出明确的 DVB 限制性表达，要么是因为表达范围广，要么是未检测到。

 

 

 

综上所述，分子数据表明，DVB通常在解剖学上定义，可以被视为基因表达的复杂模式域，在肌肉中包括大量编码信号因子、细胞表面分子和转录调节因子的基因（图2D，S2G和S2H）。 因此，DVB 肌肉是涡虫身体计划中一个突出但知之甚少的模式元素。

 

异位 DVB 允许在 β-catenin-1 RNAi 后形成 AP 轴的前区域

为了确定DVB是否足以促进β-catenin-1 RNAi后AP轴前区域的形成，我们尝试产生具有异位DVB的动物。在杯状生长物中，移植具有反转DV极性的组织已被证明可以诱导异位DVB，由表皮表达的层粘连蛋白B标记[38,58]。相比之下，没有 DV 逆转的类似组织移植会导致没有形成 DVB 的组织整合。我们使用这种方法在动物的咽后区域产生异位DVB的生长物（图3A和S3A）。这些生长物包含DVB肌肉基因表达特征，包括编码分泌分子admp，内乳粘蛋白和frem-1的基因，表明表皮和下面的肌肉在生长物中都获得了异位DVB身份（图3B和S3B）。这些生长物具有移植位置典型的AP特征[38]（S3C图），并且缺乏前部身份（图3C）。在形成背侧到腹侧 （DV） 移植生长物后，我们启动了 β-catenin-1 RNAi。虽然头部结构通常局限于β-catenin-1 RNAi动物的外围，但DV移植生长物发育成杯状头状结构，其特征是动物中间存在眼睛（图3A）。这些生长物（背侧和腹侧生长物）在β-catenin-1 RNAi之后表达前PCG（sFRP-1，ndl-4）并含有视蛋白感光细胞（图3C和S3D）。相比之下，背背（D-D）移植动物只是治愈了伤口（n = 13/13），这些移植部位没有表达前PCG或按照β-catenin-1 RNAi转化为头部（图3A和3D）。+

 

为了补充使用移植产生异位 DVB，我们接下来移植了 DVB 区域本身。将动物边缘的一小块含 DVB 的后段移植到受体动物的中线，诱导受体形成背侧生长。这些生长物表达前部PCG（sFRP-1，ndl-4），并在β-catenin-1 RNAi之后含有视蛋白感光细胞（图3E），表明异位DVB能够在Wnt抑制后促进前部模式化。 +

 

作为生成异位DVB的独立方法，我们利用了smad1 RNAi。smad1编码Bmp信号传导的下游介质，在涡虫DV模式化中起着重要作用[25]。抑制bmp4或smad1导致稳态腹侧化[25\u201227]，在动物的背侧表面出现异位层粘连B DVB细胞，在某些情况下呈有组织的条纹（图4A）。在让smad1 RNAi动物发展异位DVB后，我们用RNAi抑制β-catenin-1。这些smad1;β-catenin-1双RNAi动物表达前PCG（sFRP-1，ndl-4），并在异位DVB位点发育视蛋白感光细胞，表明头部图案化（图4A和S3E）。观察到的异位前PCG表达追踪了这些动物背侧异位DVB的可变和不规则模式（图4A）。SMAD1;β-catenin-1双RNAi动物最终形成从动物背表面出现的头部（图4B）。+

 

我们意识到可以使用 smad1 RNAi 在所需位置通过设计诱导头部形成。我们在启动 smad1 RNAi 三天后在咽前区域进行了背侧损伤，在显示异位层粘连蛋白 DVB 基因表达的损伤部位触发了生长形成。在随后的β-catenin-1抑制后，生长物转化为头状结构（图4C和4D）。总之，这些结果与涡虫 DVB 肌肉能够激活前 PCG 并支持在低 Wnt 环境中形成 AP 轴前区域的模型一致。通过将在指定位置生成异位DVB的方法与Wnt通路抑制相结合，可以控制头部位置和形状，以产生大量身体平面图。+

 

DVB 区域是促进低 Wnt 环境中前 PCG 表达所必需的

为了测试在β-catenin-1 RNAi的背景下是否需要DVB来启动头部形成，我们在RNAi之后造成了侧向或内部损伤（图5A和S4A）。β-catenin-1 RNAi后的前向化需要产生新的细胞[18,20]，组织的丢失会导致伤口部位的有丝分裂局部增加[59,60]。然而，仅去除β-catenin-1 RNAi动物外侧边缘的组织就足以可靠地诱导伤口的前部PCG表达（图5A）。在大多数情况下，去除组织的内部打孔器不会引起前 PCG 表达 （n = 51/59）（图 5A 和 S4B），这表明 DVB 的信号对于稳健地启动前部图案是必要的。

 

接下来，我们通过手术切除DVB（矢状旁截肢），并通过使用PD0325901（PD）抑制Erk信号传导来阻断其再生（图5B，S4C和S4D）。 Erk信号传导是促进伤口诱导的信号传导所必需的，最终导致再生反应[61]。然而，对于 β-catenin-1 RNAi 后异位头部形成伴随的稳态生长，不需要 Erk 信号传导（S4E 图）。DMSO处理的β-catenin-1 RNAi动物再生DVB，由laminB标记，并在再生侧的大病灶中表达前PCG（sFRP-1，ndl-4），而PD处理的β-catenin-1 RNAi动物没有再生DVB，并且在大多数情况下（n = 12/22）在这一侧检测到很少的前PCG表达（图5B）。在某些情况下（n = 9/22），尽管表皮DVB（层粘蛋白B）（S4F图）或肌肉DVB（内乳粘蛋白，frem-1）基因表达（S4G图）没有再生，但在PD处理的β-catenin-1 RNAi动物的受伤侧检测到前PCG（sFRP-1，ndl-4）表达。然而，这种表达没有形成指示头部形成的病灶或局部生长物（S4F图）。在没有 DVB 的情况下，前 PCG 表达可能会以低水平启动，并且 DVB 的作用是促进前 PCG 表达升高和持续，最终形成强病灶。重要的是，前 PCG 在 DMSO 和 PD 处理的动物的未受伤侧表达，它们可以形成病灶，表明在稳态周转期间通常不需要 Erk 信号传导来进行前向化（图 5B）。总之，这些结果表明，DVB 是 β-catenin-1 RNAi 后前牙花纹和头部形成的有力促进所必需的。

 

为了进一步确定是否需要 DVB 来促进前牙模式，我们利用了头部再生的独立背景。前部PCG可在24-48 hpa的头部再生过程中表达[16,44]。肌肉 DVB 基因在头部母细胞边缘以模式方式表达 36 hpa，与伤口前 PCG 病灶的出现相似（S5A 图）。我们利用抑制 Bmp 信号传导来防止横截后 DVB 再生。DV模式化需要Bmp信号传导，通路抑制可以阻止DVB的再生[25\u201227]。短期bmp4 RNAi尾片段可以表达伤口诱导的基因并重新调整位置信息，尽管没有DVB再生或母细胞生长[28]。有趣的是，bmp4 RNAi被观察到会导致不对称的极点，横向位移[28]。我们生成了对照或 bmp4;smad1 RNAi 咽后片段。对照咽后片段在再生DVB（层粘连B）附近的AFW中线表达前PCG（sFRP-1，ndl-4）（图5C）。 相比之下，bmp4;smad1 RNAi 咽后片段没有在其伤口处再生 DVB，使片段仅具有 DVB 的侧向结构域（受伤前已存在）。前 PCG 在这些 bmp4 的 AFW 处表达;smad1 RNAi 片段，但在所有情况下，这种表达仅发生在靠近预先存在的完整 DVB 的侧侧片段边缘 （n = 26/26）（图 5C）。在某些情况下，前 PCG 仅在 DVB 片段的一侧（左侧 （n = 10/26） 或右侧 （n = 8/26）） 上表达。在其他病例中，观察到两个前 PCG 表达灶，一个靠近左侧 DVB，一个靠近右侧 DVB （n = 8/26）。

 

接下来，我们生成了 bmp4;smad1 RNAi 咽后片段，并去除了侧侧 DVB 的一侧。在大多数情况下，前 PCG 在 AFW 处表达（n = 31/34;n = 3/34，未检测到前 PCG）。值得注意的是，在这31只动物中，前PCG表达仅限于侧缘，仅靠近具有剩余DVB的一侧（n = 25/25，右侧DVB去除和n = 6/6，左侧DVB去除）（图5C）。这些结果表明，DVB 是再生中持续前 PCG 表达所必需的。为了评估这种可能性，我们生成了咽后 bmp4;smad1 RNAi 片段，这些片段也去除了外侧 DVB 的两侧。在大多数情况下，bmp4;没有任何DVB的smad1 RNAi片段在截肢后7天（dpa）含有很少（n = 7/15）或没有可检测到（n = 6/15）的前部PCG表达细胞（n = 3/15）具有可检测到的sFRP-1、ndl-4水平）。这些发现支持了再生中前 PCG 表达需要 DVB 的假设。

 

DVB在Wnt抑制后促进前位信息表达中具有前极非依赖性作用

涡虫前极在DVB处合并[34]，在头部再生过程中需要促进持续的前PCG表达[31\u201233]。影响DVB细胞分布的扰动也会改变前极形成的位置[34]，表明DVB在其定位中起着积极作用。

 

在头部再生中，前极形成和前PCG表达发生在相似的时间尺度上[16,34,44]。然而，在β-catenin-1 RNAi之后，在FISH明显发现前极转录物之前，在DVB中检测到前PCG（sFRP-1，ndl-4）表达（图6A）。通过 β-catenin-1 RNAi 的 7 天，在 9 只动物中检测到 37 个异位前 PCG 病灶。在RNAi的14天和21天时，分别检测到7只动物的33个病灶和8只动物的41个病灶。FoxD编码一种Forkhead家族转录因子，该转录因子在头部再生过程中在新母细胞亚群（干细胞）中表达，是新母细胞形成前极祖细胞所必需的[31,32]。成熟的前极细胞也表达FoxD[31,32]。直到β-catenin-1 RNAi开始后的第14天（7只动物的n = 10个病灶）到第21天（7只动物的n = 11个病灶）才可靠地检测到异位FoxD表达（图6A）。我们使用RNA探针验证了这些结果，该探针编码在前极表达的分泌的Wnt抑制剂[17,31]。伤口缺口表达需要β-连环蛋白-1[17]。然而，在β-catenin-1 RNAi之后，在前极仍可检测到notum转录本[19]（S6A图）。与FoxD结果一致，直到β-catenin-1 RNAi开始后第14天（6只动物的n = 1个焦点）到第21天（9只动物的n = 7个病灶）才检测到异位notum表达（图6A）。尽管转录本检测可能受到 FISH 敏感性的限制，但这一事件顺序表明，首先与头部形成相关的是 DVB 前 PCG 的表达，并且极点形成可能会跟随并促进头部形成过程中的模式解决。