免费医学论文发表-秀丽隐杆线虫SAS-1 确保中心粒完整性和睫状体功能，并与 SSNA-1 一起工作
凯沙夫·贾，亚历山大·沃格拉尔 ，科拉莉·布索，乔治斯·哈佐普洛斯，塔蒂亚娜·法维兹，皮埃尔·冈奇
发布时间：2025 年 10 月 22 日
抽象
中心粒是基于微管的细胞器，对信号传导、运动和分裂至关重要。微管结合蛋白 SAS-1 与人类纤毛病成分 C2CD3 同源，有助于秀丽隐杆线虫的中心粒完整性，但该功能如何发挥尚不完全清楚。在这里，通过生成无效等位基因并使用 U-Ex-STED 进行分析，我们确定 SAS-1 对于中心粒组装的开始是可有可无的，但对于卵子发生、精子发生和早期胚胎中的细胞器完整性至关重要。此外，我们发现 SAS-1 存在于感觉神经元的过渡区，并以部分冗余的方式对睫状体功能做出贡献。此外，我们研究了 SAS-1 与秀丽隐杆线虫干燥综合征核抗原 1 蛋白 SSNA-1 之间的关系，确定 SSNA-1 位于中心粒结构中的 SAS-1 C 末端旁边。此外，通过两种成分的无效等位基因的分子上位实验，我们揭示了SAS-1对于SSNA-1在卵子发生过程中定位到中心粒和纤毛发生过程中定位到过渡区至关重要。此外，使用异源人类细胞测定，我们确定 SAS-1 将 SSNA-1 募集到微管中。总体而言，我们的研究结果有助于阐明 SAS-1 如何与 SSNA-1 一起确保中心粒完整性，并揭示它有助于纤毛功能。
作者总结
我们的每个细胞内部都有称为中心粒的微小细胞器，它们有助于组织细胞分裂并形成纤毛的基部，纤毛是感知环境并做出反应的毛发状突起。虽然近年来对中心粒如何构建的了解有所增加，但对这些细胞器组装后如何保持其完整性的了解却较少。在这项研究中，我们使用蛔虫秀丽隐杆线虫来探索 SAS-1 中心粒完整性的功能，SAS-1 与一种与影响纤毛和大脑发育的遗传疾病相关的人类蛋白质有关。我们发现中心粒可以在缺乏 SAS-1 的秀丽隐杆线虫中形成，但它们在关键发育阶段失去结构完整性。此外，我们发现 SAS-1 有助于感觉纤毛的功能，并且 SAS-1 与另一种称为 SSNA-1 的人类相关蛋白质一起工作以增强中心粒稳定性。通过揭示 SAS-1 和 SSNA-1 如何保护中心粒完整性，我们的工作为保持正常细胞功能的机制提供了新的见解，并可能有助于解释类似过程中的缺陷如何导致人类疾病。
数字
图4图5图6图1图2图3图4图5图6图1图2图3
引文： Jha K、Woglar A、Busso C、Hatzopoulos GN、Favez T、Gönczy P （2025） 秀丽隐杆线虫 SAS-1 确保中心粒完整性和睫状体功能，并与 SSNA-1 一起工作。公共科学图书馆基因 21（10）： 电子邮箱：1011912。 https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912
编辑 器： Nathalie Pujol，法国国家科学研究中心
收到： 2025 年 6 月 9 日;接受： 2025 年 10 月 8 日;发表： 10月 22， 2025
版权所有： © 2025 Jha 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金： 这项工作得到了瑞士国家科学基金会的支持（赠款 # 310030_197749 给 PG，https://www.snf.ch/en）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。
介绍
中心粒是存在于真核生命树上的9倍径向对称微管细胞器（见[1,2]）。中心粒模板纤毛和鞭毛的轴突，并招募中心粒周围物质 （PCM） 形成中心体，中心体在动物细胞中充当微管组织中心 （MTOC）。由于这些基本作用，中心粒对于信号传导、运动和分裂至关重要。细胞对中心粒数量和结构保持严格控制，否则可能导致疾病（见[3,4]）。在大多数增殖细胞中，两个预先存在的中心粒在其附近各形成一个原中心粒。中心粒总体上非常稳定，但在某些情况下会发生程序性消除，包括在后生动物物种的卵子发生过程中（见[5,6]）。总体而言，尽管它们很重要，但调节中心粒完整性的机制仍不完全了解。
对秀丽隐杆线虫的系统分析确定了中心粒组装所需的一组进化保守的核心成分，包括SAS-7、SPD-2、ZYG-1、SAS-6、SAS-5和SAS-4（见[7,8]）。简而言之，中心粒组装始于激酶 ZYG-1 在 SAS-7 和 SPD-2 形成的平台上磷酸化 SAS-5。磷酸化的 SAS-5 然后与 SAS-6 结合，SAS-6 可以自组装成内管元件，被认为是微管结合蛋白 SAS-4 的支架募集，然后是中心微管的募集。秀丽隐杆线虫中心粒的尺寸仅为~150 nm x ~120 nm[9\u201211]，但使用超膨胀耦合STED超分辨率显微镜（U-Ex-STED）可以高精度地确定中心粒和PCM成分的分布[11]。
虽然秀丽隐杆线虫缺乏可运动的纤毛或鞭毛，但中心粒在60个感觉神经元的睫状轴突中接种，其中56个在动物的头部区域，4个在尾部区域[12,13]。在模板纤毛轴突形成后，中心粒退化，因此成熟纤毛中不存在[14,15]。相比之下，SPD-5和TBG-1（γ-微管蛋白）等PCM蛋白仍保留在睫状体基部，作为中心粒MTOC发挥作用[16,17]。SPD-5和TBG-1的远端是过渡区，它标志着纤毛本身的起点，包括一个位于轴突微管内部的中心圆柱体，以及连接轴突微管外部与睫状膜的Y型链[12,13]。
中心粒在秀丽隐杆线虫的其他生理环境中也被消除。因此，在胚胎发生过程中，中心粒在多个谱系中经历程序性消除，导致558个细胞中只有68个在第一个幼虫阶段（L1）保留中心粒[18,19]。此外，与其他后生动物一样（见[5,6]），中心粒在秀丽隐杆线虫卵子发生过程中被消除，精子为受精卵贡献了唯一的一对中心粒，从而确保了双极纺锤体组装和忠实的染色体分离[20,21]。相关光学电子显微镜（CLEM）分析显示，卵子发生中心粒的消除始于减数分裂前期，中心粒微管壁内的中心管元件丢失[21]。在果蝇中，去除激酶Polo，从而去除PCM对于触发卵子发生中心粒消除至关重要[22]，而在秀丽隐杆线虫中，相关的Polo样激酶和PCM不调节这一过程[21]。
SAS-1在调节秀丽隐杆线虫卵发生中心粒消除中起重要作用[21]。SAS-1是一种含有C2结构域的蛋白质[23]，与人C2CD3同源，C2CD3是中心粒远端段组装所必需的成分，患者突变导致口腔-面部-手指（OFD）综合征，伴有严重的小头畸形和脑畸形[24\u201226]。SAS-1定位于秀丽隐杆线虫中心粒的中央管，N端位于中心微管旁边，C端位于中心更中心[11]。当在人体细胞中表达时，秀丽隐杆线虫SAS-1与微管结合并稳定微管[23]。重要的是，在秀丽隐杆线虫卵子发生过程中，SAS-1是第一个离开中心粒的已知蛋白质，随后有组织的中心粒微管丢失，其他中心粒蛋白被去除，包括SAS-4和SAS-6[21]。在功能等位基因sas-1（t1521）的减少中，中心粒在卵子发生过程中早熟消除[21]。此外，sas-1（t1476）或sas-1（t1521）突变精子促成受精卵的中心粒在受精后不久就失去完整性[23]。此外，使用这些突变等位基因损害母体sas-1功能也会导致中心粒不稳定，在这种情况下，在胚胎发生过程中[23]。sas-1 的无效等位基因是否会导致更严重的表型，也许是中心粒组装的完全失败，还有待确定。
在这里，我们生成并分析了 sas-1 的无效等位基因，从而确定该蛋白质对于中心粒组装是可有可无的，但对于细胞器的完整性至关重要。我们还报告说，SAS-1 定位于感觉纤毛的过渡区并有助于其功能。此外，我们研究了 SAS-1 与干燥综合征核抗原 1 蛋白 SSNA-1 的蠕虫同源物 SSNA-1 的关系，发现 SAS-1 对于将 SSNA-1 募集到秀丽隐杆线虫的中心粒和纤毛以及异源测定中的微管至关重要。我们的工作共同有助于了解 SAS-1 和 SSNA-1 如何工作以确保中心粒细胞器的完整性。
结果
SAS-1 的缺失会损害卵子发生过程中中心粒的完整性
先前对SAS-1的分析是在功能等位基因sas-1（t1476）和sas-1（t1521）减少的情况下进行的[21,23,27]。为了研究SAS-1完全丢失的后果，我们使用CRISPR / Cas9生成了一个无效等位基因（S1A图）。由此产生的 sas-1（is13） 突变体具有跨越 5'-UTR 和部分外显子 1 的缺失，该缺失去除了 ATG 起始密码子并产生蛋白质无效（S1B-S1D 图）。杂合sas-1（is13）/ hT2蠕虫在所有测试温度下产生~20%的sas-1（is13）纯合动物（S1E图）。然而，这种纯合动物产下的胚胎很少，这些胚胎都未能孵化，这表明sas-1发挥了基本功能。由于我们对分析种系特别感兴趣，因此我们考虑了来自杂合母体的母体贡献的 SAS-1 是否在 SAS-1（IS13） 纯合突变后代的种系中持续存在。为此，我们对源自tagRFP-T：：sas-1/sas-1（is13）杂合母体的sas-1（is13）纯合动物种系中的TagRFP-T：：SAS-1进行了实时成像，在雌性种系或年轻成人精子细胞中未发现可检测到的TagRFP-T：：SAS-1（S1F-S1H图）。
配备sas-1（is13）无效等位基因后，我们着手研究SAS-1丢失的后果，首先通过免疫荧光对年轻成人性腺有丝分裂区域的增殖生殖细胞核和相关中心粒进行研究（图1B-1D）。在对照蠕虫中，该区域的细胞核大小相似，每个细胞核都与以SAS-7和SAS-4为标志的中心粒相关（图1B和1E）。相比之下，sas-6（ok2554）无效突变动物在该区域的细胞核要少得多（图1F）[20]。此外，sas-6（ok2554）突变细胞核通常比正常细胞核大得多（图1E），并且几乎从未与SAS-7或SAS-4病灶相关（图1C;3.2%，N = 348），共同反映了染色体分离失败和缺乏中心粒组装。与sas-6（ok2554）突变体条件相比，我们发现大多数细胞核在sas-1（is13）无效突变体中大小相似（图1D和1E），并且通常与以SAS-7和SAS-4为标志的中心粒相关，如对照组（图1D和1F;79.2%，N = 645）。此外，我们发现，随着生殖细胞核通过卵子发生的进展，缺乏可检测中心粒的细胞核部分基本保持不变（S2A-S2C图）。此外，对照和sas-1（is13）突变动物的性腺有丝分裂区域的实时成像显示，与对照相比，SAS-4：：GFP水平没有变化（S2D-S2F图），而GFP：：SAS-7的水平较低（S2G-S2I图）。
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图1. SAS-1 丢失导致卵子发生过程中中心粒完整性受损。
一个。年轻成年雌雄同体的性腺示意图显示配子发生的连续阶段，具有早期有丝分裂区域，然后是减数分裂前期，然后是环区域和细胞化。成熟的卵母细胞穿过发生受精的精子。BD。表达GFP：：SAS-7的对照（B），sas-6（ok2554）（C）和sas-1（is13）（D）动物固定性腺早期有丝分裂区域的代表性免疫荧光图像，用针对SAS-4和GFP的抗体进行免疫染色。虚线突出了性腺的边缘。右侧的方形插图放大了 ~ 1.5 倍，而红色虚线圆圈则举例说明了 （E） 中报告的核面积测量区域。针对每张图像单独调整亮度和对比度。E.指定基因型有丝分裂区核面积的量化。细胞核数量：N = 98 – 对照，来自 5 个性腺;51 –SAS-6（OK2554），来自 6 个性腺;101 –SAS-1（IS13），来自 5 个性腺。学生双尾 t 检验，其中 P < 0.001 （***）。F.指定基因型的性腺有丝分裂区域的细胞核数量。性腺数量 = 9 –对照和 sas-6（ok2554）;10 –sas-1（is13）。学生双尾 t 检验，其中 P < 0.01 （**）。对照与sas-1（is13）的差异不显著（P = 0.68）。 G-I.对照有丝分裂区中心粒的代表性U-Ex-STED图像（G;N = 23）和sas-1（is13）突变体（H，I;N = 15），对SAS-4和α/β-微管蛋白进行免疫染色。箭头：原中心粒;箭头：变形且几乎看不见的中心粒。请注意，由于实时成像实验中的SAS-4：：GFP水平没有变化，U-Ex-STED可能导致脆弱的中心粒进一步崩解（参见S2D-S2F图）。比例尺针对膨胀系数 5 进行了校正。
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接下来，我们报道了使用U-Ex-STED对性腺有丝分裂区域中心粒结构的高空间分辨率分析[11,28]。在对照中，两个成熟的中心粒通过SAS-4和微管的径向分布在横截面图中被识别（图1G）。此外，SAS-4在两个未成熟的原中心粒中的含量大大降低（图1G，箭头）[11]。在 sas-1（is13） 突变体中观察到两种类型的中心粒构型。在~40%的病例中，一个中心粒清晰可辨，而另一个中心粒看起来变形，几乎看不见（图1H，箭头）。在其余~60%的病例中，检测到单个中心粒（图1I）。在这两种构型中，完整的中心粒旁边都存在一个未成熟的原中心粒，以微弱的SAS-4信号为标志，如野生型（图1H和1I;箭头）[11]。此外，我们发现存在的中心粒比对照中的中心粒略窄（S3A和S3B图）。此外，跨有丝分裂、早期前期和晚期前期区域的U-Ex-STED分析确定，这些sas-1（is13）突变中心粒比野生型更窄，并且不会过早消除（S3A和S3B图）。我们推测，一起变形或缺失的中心粒是较旧的中心粒，是在较早的细胞周期中形成的（参见讨论）。
总体而言，这些观察结果表明，在没有 SAS-1 的情况下，中心粒可以在卵子发生过程中组装，但表现出受损的结构，包括直径稍窄和选择性损失。
SAS-1 对于中心粒组装是可有可无的，但对于胚胎和精子细胞中的细胞器完整性至关重要
我们试图进一步测试 SAS-1 是否可有可无地用于中心粒组装的开始。为此，我们进行了标记的交配实验，其中表达 TagRFP：：SAS-7 的野生型雄性与表达 SAS-4：：GFP 的 sas-1（is13） 突变雌雄同体交配（S3C–S3E 图）。如果SAS-1对于中心粒组装至关重要，则不应将SAS-4：：GFP募集到所得单细胞期胚胎中的中心粒中;此外，预计在两个细胞阶段的每个卵裂球中都会组装一个单极纺锤体，就像在缺乏母体zyg-1或sas-5功能的胚胎中一样[29\u201230]（S3C-S3E图）。然而，与这些预测相反，此类胚胎的延时显微镜确定，在单细胞阶段总是观察到SAS-4：：GFP的两个病灶（图2A，0分钟;N = 9），并且双极纺锤体组装总是发生在两细胞阶段的两个卵裂球中（图2A，9分钟）。有趣的是，此外，我们观察到，在双细胞阶段，每个卵裂球中存在的两个SAS-4：：GFP病灶中的一个最初表现出比另一个弱的信号（图2A，6分钟，插图3和4），并且通常在细胞周期结束时变得无法检测到（图2A，9分钟，插图3和4， N = 15/18 个中心粒）。我们推断，中心粒的初始存在一定足以招募PCM，因为双极纺锤体组装系统地发生在这种双细胞期胚胎的两个卵裂球中（图2A，9分钟;N = 9）。总体而言，这些发现表明，在完全没有 SAS-1 的情况下可以发生中心粒组装，但产生的中心粒不稳定，并且通常无法在随后的分裂中持续存在。
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图2. SAS-1 对于中心粒组装是可有可无的，但对于细胞器的完整性至关重要。
一个。表达 TagRFP-T：：SAS-7 的交配雄性与表达 SAS-4：：GFP 的 sas-1（is13） 突变雌雄同体的早期胚胎的实时成像快照（见 S3C–S3E 图）。TagRFP-T：：SAS-7 标记精子贡献的中心粒（插图 1 和 2），而 SAS-4：：GFP 标记受精后组装的所有中心粒。T = 0 对应于单细胞阶段的中期。插入 3 标记和 4 标记的退化中心粒，组装在精子贡献的中心粒旁边。DIC 图像是一个平面，而两个合并的荧光通道是选定 Z 平面的最大强度投影。BD。对照精子中心粒的代表性U-Ex-STED图像（B;N = 16）和sas-1（is13）突变体（C，D;N = 23），对SAS-4和α/β-微管蛋白进行免疫染色。在 sas-1（is13） 突变体中，观察到两种构型类型：（C） 两个中心粒都存在但加宽，以及 （D） 一个中心粒存在并加宽，而另一个中心粒破裂（箭头）。右上角的百分比表示每种类型的频率。请注意，精子中心粒的U-Ex-STED需要甲醇固定（与图1G-1I所示的雌性种系中的性腺中心粒不同），这会影响分辨率。此外，我们发现甲醇固定样品不会与膨胀凝胶线性膨胀;因此，本例中的比例尺尚未针对膨胀系数进行校正，并显示为黄色以突出这一事实。E.精子中心粒宽度的定量（未针对扩张因子进行校正），不包括中心粒片段，来自 （B-D）。N = 32 -对照，24 -sas-1（is13））。学生双尾 t 检验，其中 P < 0.001 （***）。F.G 和 H 中单细胞阶段胚胎的实时成像示意图（根据 BioRender.Gönczy， P. （2025） https://BioRender.com/s7jx4jh）。G，H。对照中亲核会议时实时成像的快照（G;N = 10）和sas-1（is13）突变体（H;N = 12）单细胞期胚胎。每分钟获取一次图像。DIC通道是单个平面，而SAS-4：：GFP通道是选定Z平面的最大强度投影。
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我们还分析了精子细胞中 SAS-1 完全丢失的影响。在之前的工作中，电子显微镜（EM）分析并未显示野生型和sas-1（t1476）精子中心粒之间存在明显差异，尽管突变精子中心粒随后在胚胎中迅速消除[23]。在这里，我们使用 U-Ex-STED 检查受精前成熟精子中心粒的分子结构。在对照中，SAS-4和微管都定位于两个精子中心粒（图2B）。相比之下，sas-1（is13） 突变精子中心粒表现出两种类型的配置，两者都不同于对照。在~43%的病例中，两个中心粒都是可检测到的，并且与对照组相比表现出更大的宽度（图2C）。在剩余的~57%中，存在一个中心粒并且比对照更宽，而另一个中心粒破裂（图2D，白色箭头）。通过类比生殖系有丝分裂区域的情况，我们提出破裂的中心粒是最古老的，因此可能在两次减数分裂期间承受了更大的机械应力（参见讨论）。
受精后sas-1（is13）突变精子中心粒的命运如何？为了解决这个问题，我们使用实时成像来监测以SAS-4：：GFP为标记的精子贡献的中心粒（图2F）。在对照中，两个精子贡献的中心粒在原核会议（N = 10）时总是可见的（图2G）。相比之下，我们发现SAS-4：：GFP病灶在sas-1（is13）突变胚胎（N = 12）的等效阶段从未存在，尽管有时可以在细胞周期的早期（N = 8/12）检测到微弱的病灶（图2H）。当使用 GFP：：SAS-7 监测精子中心粒时，也获得了类似的结果（S3F 和 S3G 图）。总之，这些观察结果表明，SAS-1 的丢失允许精子中心粒组装，但也损害了它们的完整性，可能导致它们在受精后在胚胎中迅速死亡。
胚胎发生过程中的 SAS-1 动力学
我们着手研究胚胎发生过程中程序性中心粒消除过程中的SAS-1分布[19]。胚胎在受精后~350分钟（mpf）完成其增殖期[31]，此时孵化时存在的558个细胞中的大部分已经产生。在随后的形态发生阶段，胚胎依次采用特征性的豆形、逗号、1.5倍和2倍构型，并伴有广泛的谱系特异性中心粒消除[19]。我们对表达 TagRFP-T：：SAS-7 和 GFP：：SAS-1 的胚胎进行了晶格光片实时成像，从豆子阶段 （~360 mpf） 到 2 倍阶段 （~460 mpf）（图 3A 和 S1 电影），之后抽搐阻止了忠实的中心粒监测。我们发现，GFP：：SAS-1病灶的数量从豆类阶段的~550（±28）减少到2倍阶段的~474（±43）[图3B]，这个数字高于之前在这个阶段确定的GFP：：SAS-7的~220（±50）[19]。因此，一些似乎不带有TagRFP-T：：SAS-7的GFP：：SAS-1病灶存在于2倍阶段，特别是在胚胎前部，尽管这可能部分反映了TagRFP-T：：SAS-7的信号强度较弱（图3A，2倍阶段，插图）。此外，这些 GFP：：SAS-1 阳性病灶是否对应于真正的中心粒或仅对应于 SAS-1 蛋白的剩余焦点仍有待确定。
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图3. SAS-1 在胚胎发生程序性中心粒消除过程中离开中心粒。
A. 如图所示，在豆、逗号和 2 倍阶段表达 TagRFP-T：：SAS-7 和 GFP：：SAS-1 的胚胎的延时快照。上行和中行显示带有“火”LUT 的单个通道，下行显示两个通道的合并，插图突出显示胚胎前部的病灶。另请参阅 S1 电影。B. 量化从豆类阶段到 2 倍阶段的 TagRFP-T：：SAS-1 阳性病灶数量，抽搐前 10 分钟 （N = 9）。C. 表达 TagRFP-T：：SAS-1 和 GFP：：SAS-7 的 L1 幼虫的实时成像。前面在左边。箭头指向仅对动物前部和后部的 TagRFP-T：：SAS-1 呈强烈阳性的病灶。F. 定量 TagRFP-T：：SAS-1 和 GFP：：SAS-7 阳性病灶数量，或仅对两种融合蛋白中的一种（N = 6 L1 幼虫）呈阳性。
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无论如何，尽管两个标记物在2倍阶段存在这种差异，但到胚胎发生结束时，TagRFP-T：：SAS-1通常存在于L1幼虫中，在那些也含有GFP：：SAS-7病灶的细胞中，只有一些额外的病灶对两种融合蛋白中的一种呈阳性，通常在低信号强度下，提示假标记（图3C和3D).除了这种一般的共定位之外，我们还在动物的前部和后部观察到与GFP：：SAS-7不共定位的强烈双侧TagRFP-T：：SAS-1病灶（图3C，箭头）。根据它们的位置，这些额外的 TagRFP-T：：SAS-1 病灶似乎标记了前后感觉纤毛神经元的基部。
SAS-1 定位于感觉纤毛的过渡区
我们着手解决 SAS-1 是否真正定位在睫状基部，如果是，则与先前映射的蛋白质进行确切比较。L1幼虫的实时成像显示，TagRFP-T：：SAS-1与纤毛碱基蛋白SPD-5病灶之间存在一致的分离，其中TagRFP-T：：SAS-1病灶位于前纤毛中GFP：：SPD-5病灶的前方（图4A），后纤毛中GFP：：SPD-5病灶稍后方（图4B）。这些模式表明 SAS-1 并不定位在睫状体基部，而是定位在过渡区。因此，我们发现TagRFP-T：：SAS-1与过渡区蛋白MKSR-2共定位[32]，在前纤毛和后纤毛中（图4C和4D）。我们着手研究 SAS-1 是否存在于轴突微管的范围内，即中心圆柱体所在的位置，或者是否存在于轴突微管的外部，即 Y 连杆所在的位置。为此，我们将表达TagRFP-T：：SAS-1的L1-L2幼虫放入含有微管探针SPY650-微管蛋白的溶液中，推断这种小分子可以被感觉纤毛吸收。如图4E所示，我们发现情况确实如此。AiryScan成像表明，TagRFP-T：：SAS-1存在于SPY650-微管蛋白标记的轴突微管信号范围内（图4F），表明SAS-1位于过渡区的中央圆柱体中[33]。这种定位与SAS-1在中心微管壁内中央管的定位相呼应[11]。
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图4. SAS-1 是过渡区的组成部分，有助于纤毛功能。
公元 D.前路（amphid;A、C）和后部（phasmid;B，D）表达GFP：：SPD-5和TagRFP-T：：SAS-1（A，B）或GFP：：MKSR-2的L1幼虫的纤毛，表达TagRFP-T：：SAS-1（C，D）。插图放大了大约两倍。E.表达 TagRFP-T：：SAS-1 的 L1 幼虫后纤毛的实时 Airyscan 成像，轴突微管用 SPY650-微管蛋白染色。F.图4E中TagRFP-T：：SAS-1和SPY650-微管蛋白的信号强度沿虚线的线曲线。G-J.L4幼虫中纤毛的代表性图像，用SPY650-微管蛋白（绿色）标记轴突微管和TagRFP-T：：SPD-5（洋红色）标记对照（G）、nphp-4（tm925）（H）、Pdyf-7：:d egron（I）和Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925）染色（J）。K.图4G-4J中纤毛长度的量化。从 TagRFP-T：：SPD-5 病灶开始绘制分段线，并追踪 SPY650-微管蛋白信号以量化纤毛长度。纤毛定量：N = 29 -对照，来自 15 只动物;N = 23 -nphp-4（tm925），来自 14 只动物;N = 28 -Pdyf-7：:d egron，来自 14 只动物，N = 21 -Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925），来自 10 只动物。学生双尾 t 检验，与对照组 vs nphp-4（tm925） 相比均不显着：P = 0.24，Pdyf-7：:d egron：P = 0.76，Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925），P = 0.15。L.指示菌株的染料填充测定。如果所有四个定粒神经元都用 DiI 染色，则染料填充评分正常，否则有缺陷。该测定进行了两次。学生双尾t检验与对照组与nphp-4（tm925）的正常染料填充百分比进行比较：P = 0.22，Pdyf-7：:d egron：P = 0.69，Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925），P = 0.015（*）。米。指定基因型动物的趋化性指数。数据点来自八个实验。学生双尾 t 检验，其中 P < 0.05 （*）;P < 0.01 （**）;P < 0.001 （***）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.g004
我们着手测试 SAS-1 是否在感觉纤毛发挥作用。我们发现，过渡区的TagRFP-T：：SAS-1信号在幼虫阶段下降（S4A图），这表明在早期纤毛发生过程中将发挥假定的功能。为了从发育中的纤毛中去除SAS-1，鉴于sas-1（is13）突变胚胎无法发育，我们使用神经元特异性dyf-7启动子对ZIF-1介导的内源性SAS-1进行降解，该启动子在早期纤毛发生过程中表达（S4B图）[34\u201235]。我们发现，ZIF-1介导的SAS-1耗竭并没有降低睫状基部的TagRFP-T：：SPD-5水平（S4C、S4E和S4G图）。由于过渡区蛋白可以冗余作用[33,36,37]，我们还使用无效等位基因nphp-4（tm925）测试了SAS-1去除后的TagRFP-T：：SPD-5分布是否因Y连蛋白NPHP-4的缺失而复合[38,39]，但发现情况并非如此（S4C–S4G图).同样，轴突运动蛋白 CHE-11：：mKate2 的水平不会因单独的 SAS-1 耗竭而降低，也不会因 nphp-4（tm925） 突变体背景中的 SAS-1 去除而进一步降低（S4H-S4L 图）。此外，使用 SPY650-微管蛋白测量 L4 幼虫的纤毛长度并未显示单次或双次耗竭条件下的显着差异（图 4G-4K）。
为了开始评估睫状体功能，我们在 phasmid 神经元中进行了染料填充测定。我们发现，虽然单独去除SAS-1或单独去除nphp-4（tm925）没有效果，但在nphp-4（tm925）突变体背景中去除SAS-1会导致适度但显着的染料填充缺陷（图4L）。染料填充还可以测量枝晶长度，该长度在所有条件下都保持不变（S5A-S5E图）。我们还进行了化学感觉测定，以确定睫状体功能的这一方面是否在去除 SAS-1 时受到干扰。在这种测定中，将蠕虫放置在板的中心，该板的一侧含有一滴引诱剂异戊醇，另一侧含有一滴驱虫剂乙醇（S5F图）[40]。野生型动物向引诱剂移动，而化学感觉有缺陷的动物则无法这样做，这种偏好通过趋化性指数来量化。如图4M所示，我们发现ZIF-1介导的SAS-1从纤毛中单独耗竭不会导致可检测到的化学感觉缺陷，但显着增强了nphp-4（tm925）突变动物的化学感觉缺陷。综上所述，这些发现将 SAS-1 确立为一种过渡区蛋白，以部分冗余的方式促进秀丽隐杆线虫的正常纤毛功能。
SSNA-1 与 SAS-1 共定位在中心粒的中心管
由于母体SAS-1耗尽的胚胎[23]和缺乏干燥综合征核抗原1（SSNA-1）蛋白的胚胎[41]之间明显的表型相似性，我们着手研究这两种成分之间可能存在的关系。对照（图5A）和ssna-1（bs182）无效突变体（图5B）胚胎的实时成像证实了双细胞期ssna-1（bs182）胚胎中多极纺锤体的频繁出现（6/14）[41]。此外，我们产生了sas-1（t1476）ssna-1（bs182）双突变胚胎，并发现，与任何一个单突变体相比，精子贡献的GFP：：SAS-7病灶在原核会议上都没有被检测到（S6A-S6D图），就像在单个sas-1（is13）无效突变体中一样（见S3G图）。
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图5. SSNA-1 与 SAS-1 C 末端一起是中心管的一部分。
甲、乙。早期对照胚胎 DIC 实时成像的快照 （A;N = 8）和ssna-1（bs182）胚胎（B;N = 14）。时间以分钟：秒表示;每 30 秒采集一次图像。细胞名称以黄色显示;绿点表示主轴极，箭头表示三极主轴的极点。C.表达FLAG标记的SAS-1（如图所示，在N端或C端）和SSNA-1：：SPOT的动物减数分裂前期中心粒的代表性U-Ex-STED，与SAS-4一起免疫染色。比例尺归一化为膨胀系数 5。D.用SAS-4环径归一化的3XFLAG：：SAS-1（N = 31），SAS-1：：3XFLAG（N = 20）和SSNA-1：：SPOT（N = 40）分布的中心粒直径的定量。学生双尾 t 检验，其中 P < 0.001 （***）。E.使用针对 SAS-4 和 FLAG 以及 SPOT 的抗体对固定性腺进行代表性免疫染色。性腺的不同部分缝合在一起以进行可视化。减数分裂前期区域分为八个区域，从减数分裂核的细胞化（区域 8）向后走。编号区域表示在 G 和 H 中报告的定量已进行的位置。虚线方块 （i、ii、iii） 表示以 F. F 为单位放大的区域。从（E）跨减数分裂前期放大约三倍的插入。G.SAS-4、3XFLAG：：SAS-1 和 SSNA-1：：SPOT 在 （E） 所示的八个区域的归一化信号强度。对每个区域的背景减去信号强度进行平均，然后用区域 1 的平均强度进行归一化。每个区域的平均 ± SD（N = 6 个性腺，每个性腺每个区域有 15 – 25 个病灶）。对每个区域进行学生双尾 t 检验，比较 SAS-4 与 3XFLAG：：SAS-1（洋红色星）和 SSNA-1：：SPOT（绿星）的信号强度;磷< 0.01 （**）;P < 0.001 （***）。H.在（E）的最后四个区域（N = 6个性腺;分析的病灶总数：5区197个，6区133个，7区106个，8区74个）的指定组合中包括SAS-1，SSNA-1和SAS-4的病灶的定量。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.g005
据报道，SSNA-1与SAS-1共定位在中心粒微管壁内[41]。我们着手使用 U-Ex-STED 研究 SSNA-1 相对于 SAS-1 的定位。我们分析了减数分裂前期早期的中心粒，因为相对薄且分布良好的性腺组织可以提高空间分辨率，而由于组织厚度和光学限制，这在早期胚胎中很难实现。SAS-1的N端位于中心微管和SAS-4旁边（图5C），而C端则定位到更向内的中心管（图5D）[11]。在这些实验中使用SAS-4信号的直径作为标尺，我们发现SSNA-1：：SPOT定位在SAS-1的C端附近（图5D）。有趣的是，AlphaFold2多聚体预测[42]表明SAS-1通过其C端α螺旋（氨基酸546-570）与SSNA-1相互作用（S6E和S6F图），正如其他地方报道的那样[41]。总体而言，这些发现表明 SAS-1 和 SSNA-1 共同作用以维持中心粒完整性。
SAS-1 是 SSNA-1 募集到中心粒、纤毛和微管所必需的
鉴于它们在中心粒的紧密定位和潜在的关节功能，我们解决了 SSNA-1 在卵子发生过程中是否与 SAS-1 同时离开中心粒。如图5E-5H所示，我们发现SSNA-1在SAS-1之后，在SAS-4等其他中心粒成分之前离开中心粒，与其他人的观察结果一致[41]。接下来，我们研究了SAS-1和SSNA-1在卵子发生过程中的上位性关系。我们发现 TagRFP-T：：SAS-1 早熟地脱离了 ssna-1（bs182） 突变体的中心粒 （图 6A–6C）。此外，引人注目的是，sas-1（is13）突变体的中心粒中不存在SSNA-1：：SPOT（图6D）。SSNA-1 也位于感觉纤毛，可能位于 SAS-1 的过渡区（S7C 图）。我们发现纤毛中SAS-1和SSNA-1之间存在类似的关系，在没有SSNA-1的情况下，SAS-1水平降低（S7A和S7B图），而SSNA-1在神经元特异性SAS-1耗竭时无法定位（图6E）。总体而言，我们得出结论，SAS-1 对于 SSNA-1 在中心粒和睫状基部的定位至关重要，而 SSNA-1 则相互维持 SAS-1。
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图6. SAS-1 在中心粒和纤毛上招募 SSNA-1。
甲、乙。对照（A）和ssna-1（bs182）突变体（B）中表达GFP：：SAS-7和TagRFP-T：：SAS-1的蠕虫性腺的实时成像。虚线方块 （i、ii、iii） 表示右侧放大约 1.5 倍的区域。性腺从环区（g）向后分为七个区域。C.（A）和（B）所示区域的GFP：：SAS-7（绿色）和TagRFP-T：：：SAS-1（洋红色）的信号强度的量化。对每个区域的背景减去信号强度进行平均，然后用区域a的平均强度进行归一化。每个区域的平均±标准差;N = 7 -控制;9 个 -SSNA-1（BS182） 性腺，每个区域通常定量 5-10 个病灶。D.对照 （N = 6） 和 SAS-1（is13） 突变体 （N = 8） 性腺进行免疫染色，以 SAS-4、GFP 和 SSNA-1：：SPOT 染色。虚线方块表示性腺有丝分裂区域的区域在右侧放大了大约 1.5 倍。 E.对照L1幼虫（N = 10）以及Pdyf-7驱动的ZIF-1介导的纤毛神经元（N = 11）中SAS-1耗竭后的L1幼虫的代表性免疫荧光图像，对SSNA-1：：SPOT进行免疫染色。F-M.表达对照（F，无转染）、SAS-1-GFP（G）、SAS-1-P419S-GFP（H）、SAS-1-ΔC-GFP（I）、SSNA-1-Myc（J）、SAS-1-GFP和SSNA-1-Myc（K）、SAS-1-P419S-GFP和SSNA-1-Myc（L）、SAS-1-ΔC-GFP和SSNA-1-Myc（M）的免疫染色，GFP（洋红色），α-微管蛋白（黄色）和Myc（绿色）免疫染色。方框指示插入的位置，放大约 2 倍。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.g006
为了进一步阐明SAS-1和SSNA-1之间的关系，并阐明它们与微管的相互作用，我们在人U-2 OS细胞（以下简称U2OS）中表达蠕虫蛋白（图6F-6M）。与之前的工作[23]一致，我们观察到野生型SAS-1-GFP（图6G），而不是与sas-1（t1476）突变体相对应的SAS-1-P419S-GFP蛋白（图6H），定位于微管并诱导它们捆绑。相比之下，SSNA-1-Myc形成不与微管共定位的大细胞质聚集体（图6J）。重要的是，SAS-1-GFP共表达将SSNA-1-Myc募集到微管中（图6K），而当SSNA-1-Myc与SAS-1-P419S-GFP共表达时，没有观察到这种共定位（图6L）。因此，SSNA-1在微管上的定位取决于与该测定中功能性SAS-1的相互作用。我们进一步测试了缺乏 AlphaFold2 预测的小 C 端区域与 SSNA-1 相互作用的 SAS-1 变体（SAS-1ΔC，缺乏氨基酸 546-570）是否可以将 SSNA-1 募集到微管中。引人注目的是，尽管SAS-1ΔC定位于微管，类似于全长SAS-1（图6I），但它未能招募SSNA-1（图6M），进一步证明这个短的C端α-螺旋片段对于SAS-1和SSNA-1之间的相互作用至关重要。
讨论
中心粒细胞器在组装后保持完整性的机制才刚刚开始被理解。在这里，我们分析了 SAS-1 如何促进秀丽隐杆线虫的这一过程。通过产生无效等位基因和组织特异性去除，我们证明 SAS-1 对于中心粒的组装是可有可无的，但在卵子发生、精子发生和胚胎发生过程中保持其完整性是必需的。此外，我们发现 SAS-1 存在于感觉纤毛的过渡区并有助于纤毛功能。此外，我们的研究结果表明，SAS-1结合微管的能力能够将SSNA-1募集到中心粒和纤毛。
SAS-1 对于中心粒组装是可有可无的，但对于中心粒的完整性至关重要
中心粒是异常稳定的细胞器，对药物或低温诱导的微管解聚具有抵抗力。反映这种不寻常的稳定性，几种结构中心粒蛋白一旦掺入细胞器，最多表现出边际周转。因此，脊椎动物细胞的开创性实验表明，中心粒α/β-微管蛋白在整个细胞周期中没有表现出实质性的交换[43]。同样，在秀丽隐杆线虫中，在随后的胚胎中，在精子中心粒中的中心粒β-微管蛋白、SAS-6和SAS-4在随后的胚胎中的许多细胞周期中几乎没有交换[44]。那么是什么触发了这种稳定细胞器的程序性分解呢？
先前对两个功能减少等位基因sas-1（t1476）和sas-1（t1521）进行的分析表明，SAS-1是秀丽隐杆线虫中心粒完整性的关键[21,23]。然而，由于这些不是无效等位基因，这些早期发现留下了中心粒组装也需要 SAS-1 的可能性。为了解决这种可能性，我们生成了空等位基因 sas-1（is13）。我们发现sas-1（is13）突变体有丝分裂区的种系细胞核具有伴随的原中心粒，表明中心粒可以在没有SAS-1的情况下组装。对这些种系细胞核的分析进一步揭示了在没有 SAS-1 的情况下中心粒的命运（S8A 和 S8B 图）。因此，U-Ex-STED 发现每对中的第一个中心粒看起来完好无损，但稍窄，而第二个中心粒要么严重受损，要么无法检测到。我们提出第二个中心粒是每对中最古老的中心粒，已知它是有丝分裂过程中PCM募集的主要位点[11]。因此，这个较旧的中心粒可能会因有丝分裂过程中作用在纺锤体极上的力而受损。相比之下，原中心粒只有在有丝分裂结束时才成熟为成熟的中心粒[11]，这样它就不会受到损伤，并且在下一次有丝分裂之前保持相对完整（S8A和S8B图）。此外，我们假设那些无法检测到第二个中心粒的配置对应于在第二个中心粒之前形成至少一个细胞周期的中心粒，在那些仅受损的配置中（S8B图）。一旦生殖系细胞核进入减数分裂细胞周期，中心粒就不再受到有丝分裂力的影响，这可能解释了为什么这种特征模式一直存在，直到双普列烯开始程序性消除。
什么可以解释缺乏 SAS-1 的中心粒比野生型中心粒略窄的事实？有趣的是，我们观察到种系中 sas-1（is13） 突变中心粒中的 GFP：：SAS-7 减少。由于sas-7突变导致桨轮结构丧失和中心粒直径减小[9]，GFP：：SAS-7的降低可能解释了sas-1（is13）突变中心粒直径较窄的原因。研究定位在桨轮上的蛋白质，包括HYLS-1、SPD-5和PCMD-1[11]，在没有SAS-1的情况下是否也会受到同样的影响，这将是一件有趣的事情。
通过 U-Ex-STED 对精子中心粒的分析也与缺乏 SAS-1 兼容，导致中心粒完整性逐渐丧失。在这里，U-Ex-STED 发现每对中的第一个中心粒看起来完好无损，但稍大，而第二个中心粒要么破裂，要么看似正常。至于雌性生殖系，这些配置可以反映中心粒年龄（S8C和S8D图）。通过类比和扩展，我们提出破裂的中心粒对应于较旧的中心粒，该中心粒在第一次减数分裂开始时就存在，此后形成的中心粒完好无损，尽管比野生型大，也许反映了在第二次减数分裂期间拉伸它们的力量。无论如何，在没有 SAS-1 的情况下形成的所有精子中心粒都是脆弱的，因为它们开始招募 PCM 并参与随后受精卵的有丝分裂纺锤体组装，但在第一个细胞周期的过程中逐渐丢失。总之，这些发现表明 SAS-1 对于中心粒组装是可有可无的，但对于保持中心粒完整性至关重要。
总体而言，我们得出结论，SAS-1的功能与中心粒组装因子SAS-7、SPD-2、ZYG-1、SAS-4、SAS-5或SAS-6的功能不同，没有这些因子，中心粒就无法组装（见[7,8]）。相反，SAS-1 在确保中心粒完整性方面发挥了作用。在包括人类细胞在内的其他系统中已经鉴定出对中心粒完整性至关重要的成分，其中主要包括POC1A/POC1B和WDR90的内部支架起着重要作用[45,46]。微管双联体和三联体组装所需的δ微管蛋白和ε微管蛋白及其相互作用蛋白TEDC1和TEDC2对人体细胞的中心粒完整性也很重要[47\u201249]。当它们耗尽时，仅存在微管单线体，并且中心粒在有丝分裂过程中失去结构完整性。纤毛病蛋白HYLS1同样是双联体和三联体微管形成以及中心粒稳定性所必需的[50]。鉴于线虫中心粒含有9倍径向对称的微管单线体，而不是通常的双联体和三联体[51]，这种解释不太可能在秀丽隐杆线虫中成立，尽管冷冻电子断层扫描在胚胎中心粒中发现的B样延伸可能有助于稳定性[10]。无论如何，SAS-1 对中心粒完整性起着至关重要的作用，测试 SAS-1 同源物 C2CD3 是否以相关方式起作用将会很有趣。
感觉纤毛的 SAS-1 功能
我们发现了 SAS-1 在感觉纤毛过渡区的新定位。与秀丽隐杆线虫纤毛功能相关的其他成分所表现出的冗余性[33,36]相呼应，我们发现SAS-1与过渡区蛋白NPHP-4以部分冗余的方式贡献纤毛功能。鉴于SAS-1明显定位在轴突微管范围内，我们推测SAS-1可能是中央圆柱体的一部分，中央圆柱体也包括CCEP-290[33]。通过类比 SAS-1 在中心粒完整性的背景下如何运作，我们进一步推测它可能有助于在纤毛发生过程中维持睫状轴突。在人类细胞中，C2CD3及其上游调节因子Cep120是成熟中心粒形成和纤毛生成所必需的[52]。因此，在蠕虫和人类中，SAS-1/C2CD3 对于构建功能正常的感觉纤毛至关重要。
SAS-1 与 SSNA-1 的关系
尽管通过正向遗传学和基于RNAi的功能基因组方法，在秀丽隐杆线虫中鉴定出许多驻留在中心粒和PCM的蛋白质，以及其他方法[41]，但我们将SSNA-1确定为蠕虫中的一种新型中心粒成分。在哺乳动物系统中，SSNA1被描述为定位于中心粒、初级纤毛，这反映了蠕虫以及轴突分支位点的发现[53\u201256]。在体外，SSNA1自组装成头尾原纤维，据报道这些原纤维可以结合微管[57]。同样，秀丽隐杆线虫SSNA-1可以形成这种四聚体聚合物组装体[58]。此外，还发现人SSNA1与微管切断酶Spastin相互作用[53]。
就像SAS-1一样，SSNA-1有助于秀丽隐杆线虫的中心粒完整性，尽管从ssna-1（bs182）无效突变动物较温和的表型来看，程度较小[41;这项工作]。因此，虽然 SSNA-1 有助于 SAS-1 在中心粒处的募集或维持，但我们发现 SAS-1 对于 SSNA-1 在中心粒和纤毛处的存在至关重要。有趣的是，最近的研究表明，C2CD3 同样将 SSNA-1 募集到人类细胞中的中心粒，反映了相关秀丽隐杆线虫蛋白之间的关系（Jen-Hsuan Wei，个人通讯）。我们发现秀丽隐杆线虫 SSNA-1 在异源人类细胞测定中不与微管结合，而是在功能性 SAS-1 共表达时被招募到聚合物中。综上所述，这些发现表明 SAS-1 是一种微管结合蛋白，与 SSNA-1 一起形成秀丽隐杆线虫中心粒的中心管。此外，C2CD3 和 SSNA1 似乎在人类细胞中表现出相似的关系（Jen-Hsuan Wei，个人通讯）。鉴于SSNA1与人体细胞中的微管切断酶Spastin相互作用[53]，C2CD3/SAS-1与SSNA1/SSNA-1一起可能保护中心粒微管不被早熟切断。
结论
总之，我们对 SAS-1 的新型缺失和组织特异性耗竭等位基因的分析为控制中心粒细胞器的完整性机制提供了新的线索。
材料和方法
秀丽隐杆线虫菌株
蠕虫使用标准方案在接种大肠杆菌OP50作为食物来源的线虫生长培养基（NGM）平板上生长[59]。本研究中使用的菌株列在 S1 表中。动物通常在 20-22°C 下饲养，但温度敏感菌株除外，这些菌株在 16°C 下生长直至 L4 阶段，然后在成年成像前转移到 24°C。同步蠕虫种群是通过漂白妊娠蠕虫并让胚胎在 M9 最小培养基中孵化，或者让 20-30 只妊娠成虫将胚胎产在 NGM 板上 1-2 小时，然后取出成虫来获得的。
细胞培养
U2OS细胞在37°C下用5%CO2在补充有 GlutaMAX（ThermoFisher Scientific）和 10% 胎牛血清的 DMEM 中。对于U2OS：：SAS-1-GFP和U2OS：：SAS-1（P419S）-GFP稳定细胞系[23]，培养基中补充有1μg/mL嘌呤霉素。为了产生U2OS：：SAS-1（ΔC）-GFP稳定细胞系，通过PCR扩增全长sas-1质粒[23]，产生缺乏SAS-1氨基酸546-570的缺失变体[23]，引物省略了该区域。通过LR克隆酶反应对所得线性化质粒进行测序并转移到pEBTet-GFP目标载体中。将该构建体转染到 U2OS 细胞中，然后选择 1 μg/mL 嘌呤霉素两周。对于瞬时表达实验，使用 BP 克隆酶反应 （ThermoFisher Scientific） 将与 Myc 标签融合的全长 ssna-1 cDNA 克隆到 pDONR221 载体中。接下来，使用 LR 克隆酶反应将 ssna-1 转移到 pEBTet 目标载体中，其中 ssna-1 处于多西环素诱导的 CMV 启动子的控制下。将细胞接种在 6 孔板的盖玻片上，并在转染前让其生长至 ~60–70% 汇合度，按照制造商的方案使用 Lipofectamine 3000 （ThermoFisher Scientific） 使用 2 μg 克隆的 ssna-1-Myc 质粒进行转染。转染后，将细胞孵育 4-6 小时，然后用含有 1 μg/mL 多西环素 （Merck） 的新鲜培养基替换培养基。然后让细胞表达转染的构建体48小时，然后用预冷甲醇在-20°C下固定7分钟，然后用PBS洗涤3次和免疫染色。
性腺和精子扩散
性腺扩散的进行方式与[11]类似。简而言之，将 1000-2000 名年轻成年雌雄同体的性腺在 30 μL PBS（20% 在 H2O）与左旋咪唑（1mg / mL）。将 10 μL 该溶液置于干净的 22 x 40 mm 盖玻片和 50 μL 铺展缓冲液 [32 μL 固定溶液（4% w/v 多聚甲醛和 3.2% w/v 蔗糖 H2O）、6 μL Lipsol 溶液 [1% v/v Lipsol in H2O] 和 2 μL Sarcosyl 溶液（1% w/v 的 Sarcosyl 在 H2O）] 被添加。盖玻片在室温下干燥 1 小时，在 37°C 下再干燥 3 小时。 此后，盖玻片要么储存在 -80°C 下，要么进一步处理以进行免疫染色或膨胀显微镜检查。对于精子扩散，将~1000个雌雄同体或雄性洗涤并重悬于100μL 1x核纯化缓冲液（10mM HEPES，40mM NaCl，90mM KCl，2mM EDTA，0.5mM EGTA，0.2mM DTT，0.5mM亚精胺，0.1%Triton-X）。然后用紧密的杵将蠕虫均质化20次，每次冲程旋转90°，然后将30μL该悬浮液旋转到8mm圆形盖玻片上（10,000g，持续5分钟）。取出盖玻片，用预冷甲醇在-20°C下固定5分钟，用PBST进一步洗涤，并进一步处理以进行膨胀显微镜检查。
Gonad and sperm expansion for U-Ex-STED
基于[11]进行与STED耦合的超微结构扩展显微镜检查。简而言之，将含有扩散性腺的干燥盖玻片在-20°C下用预冷的甲醇进一步固定20分钟，然后用PBS-T洗涤3次10分钟（对于扩散精子核跳过此步骤）。然后将盖玻片在室温下在丙烯酰胺/甲醛溶液（PBS溶液中为1%/0.7%）中孵育过夜。第二天，用PBS洗涤盖玻片3次5分钟。对于凝胶化步骤，将 22 x 40 mm 盖玻片与 ~250 μL（8 mm 盖玻片为 20 μL）单体溶液（19% （wt/wt） 丙烯酸钠、10% （wt/wt） 丙烯酰胺、0.05% （wt/wt） BIS PBS 孵育），补充有 0.5% 四甲基乙二胺 （TEMED） 和 0.5% 过硫酸铵 （APS） 在避光的潮湿室中孵育 1 小时。然后将所得凝胶与变性缓冲液（200 mM SDS、200 mM NaCl 和 50 mM Tris （pH 9））在 70°C 下孵育 1 小时。 变性后，用蒸馏水洗涤凝胶五次，每次洗涤20分钟，然后在蒸馏水中孵育过夜。膨胀系数是通过用尺子测量膨胀凝胶的尺寸并将其与盖玻片的尺寸进行比较来计算的。为了进行免疫染色，首先将凝胶在室温下在封闭缓冲液（10 mM HEPES（pH 7.4）、3% BSA、0.1% TWEEN 20、0.05% 叠氮化钠）中孵育 1 小时。然后将它们与在室温下在封闭缓冲液中稀释的一抗一起孵育过夜。第二天，用封闭缓冲液洗涤 3 次 10 分钟后，将凝胶与二抗和 0.7 μg/mL Hoechst 33258 在 37°C 下孵育 3 小时。 孵育后，凝胶在蒸馏水中通过三次10分钟的孵育重新扩增。最后，将凝胶安装在两个涂有聚-D-赖氨酸（2 mg/mL 水溶液）的 22 x 60 mm 盖玻片之间。使用 VaLaP（凡士林、羊毛脂和石蜡的 1：1：1 混合物）密封封片凝胶。
免疫染色
L1幼虫免疫染色使用[27]中描述的方案的修改版本进行。将 6 μL 年龄同步幼虫在水中悬浮液放在聚 D-赖氨酸（2 mg/mL 水溶液）涂层磨砂载玻片上（Marienfeld，1000200）。将 18 x 18 毫米的盖玻片轻轻放在幼虫上，并用吸墨纸去除多余的水分。将载玻片迅速放置在预冷的金属块上，并在干冰上保存至少 10 分钟。此后，使用手术刀或剃须刀片轻弹盖玻片，并将载玻片浸入-20°C的预冷甲醇中2分钟进行固定。然后在PBST中洗涤载玻片3次以去除微量甲醇，然后在PBST中的2%BSA中封闭30分钟。封闭缓冲液中的一抗在室温下孵育 1-2 小时或在 4°C 下孵育过夜。 然后将载玻片在PBST中洗涤3次，每次10分钟。将PBST中的二抗在室温下孵育45 min，然后洗涤并在PBST中进行0.7 μg/L Hoechst 33258染色。载玻片洗涤两次，然后装入 4% 正丙基没食子酸酯、90% 甘油、1x PBS 和用无色指甲油密封的盖玻片中。
根据[21]对整个解剖的性腺进行免疫染色。在精子缓冲液（50 mM HEPES [pH 7.0]，50 mM NaCl，25 mM KCl，5 mM CaCl2， 1 mM MgSO4，50 mM葡萄糖，1 mg / mL BSA）与左旋咪唑（1mg / mL），并轻轻地放在涂有聚-D-赖氨酸（PBS中的2mg / mL）的磨砂载玻片上，然后降低（22 x 40 mm）盖玻片并在干冰上冷冻。如上所示轻弹盖玻片，将载玻片浸入-20°C的预冷甲醇中5分钟。其余步骤，包括洗涤、封闭和抗体孵育，与提到的幼虫免疫染色步骤相似。
For immunostaining of U2OS cells, fixed cells were blocked for 30 min using 3% BSA in with 0.05%(v/v) TWEEN 20 (PBST), followed by primary antibody incubation in the blocking buffer for 1 hour at room temperature. This was followed by three washes with PBST, and secondary antibody incubation with 0.7 μg/L Hoechst 33258 for 1 hour at room temperature. Cells were washed again, stained with 0.7 µg/L Hoechst 33258 for 5 minutes, and mounted on slides using Fluoromount G (Invitrogen).
Primary antibodies used in this study: rabbit anti-SAS-4: 1:5000 (immunostaining or U-Ex-STED) [60]; rabbit anti-GFP: 1:1000 (immunostaining) (gift from Viesturs Simanis); rabbit anti-α-tubulin 1:5000 (Western blotting) (Abcam | ab52866); mouse anti-FLAG: 1:500 (U-Ex-STED) (Thermo | MA1–91878); mouse anti-FLAG: 1:200 (immunostaining), 1:3000 (Western blotting) (Merck | F1804); SPOT: 1:500 (U-Ex-STED) (Chromotek | 28a5-20); mouse anti-α/β-tubulin: 1:500 (immunostaining and U-Ex-STED) [61]; mouse anti-Myc 1:500 (immunostaining) (CST | Ab#2276S); SPOT nanobody Alexa Fluor 568: 1:1000 (immunostaining) (Chromotek | ebAF568); SPOT nanobody Alexa Fluor 488: 1:1000 (immunostaining) (Chromotek | ebAF488).
以下二抗以 1：1000（免疫染色）或 1：500（U-Ex-STED）使用：山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488;山羊抗兔 Alexa Fluor 568;驴防兔 Alexa Fluor 594;山羊抗鼠 Alexa Fluor 647。
显微术
使用了四台共聚焦显微镜系统。首先，一台直立式徕卡 SP8 配备了两个混合光子计数探测器 （HyD） 和一个用于明场成像的透射光电倍增管 （PMT）。该系统采用 63 倍 HC 平面复消色差物镜 （NA 1.4） 和 405、488 和 552 nm 固态激光线进行激发，并搭配 DFC 7000 GT （B/W） 相机。其次，倒置奥林巴斯IX83电动显微镜，配备横河电机转盘CSU-W1头、60倍（NA 1.42 U PLAN S APO）物镜，以及ImagEMX2 EMCCD和Orca Flash 4.0 sCMOS相机，图像采集由VisiView软件控制。第三，使用 100x 1.4 NA 油浸物镜在徕卡 TCS SP8 STED 3X 显微镜上捕获 2D-STED（受激发射耗尽）图像。该系统采用488和589 nm激发激光器，以及592和775 nm脉冲激光器进行耗尽。最后，使用配备 Airyscan 2 检测的倒置蔡司 LSM 980 显微镜进行 Airyscan 成像，该显微镜具有 63× （NA 1.4） 油浸式复消色差物镜和 32 通道 Airyscan 2 区域探测器。
使用配备44.83 × /1.0 NA水浸物镜的蔡司晶格光片7显微镜对晚期秀丽隐杆线虫胚胎（图3A）进行实时成像。成像期间将胚胎保持在 22-24 °C。使用 488 和 561 nm 固态激光器每 10 分钟采集一次体积图像堆栈进行激发;图像是在 PCO Edge 4.2 sCMOS 灰度相机上捕获的。
在配备 63x NA 1.4 Plan-Apochromat 物镜的 Zeiss Axio Observer D.1 倒置显微镜上进行早期胚胎的实时成像以及纤毛和枝晶长度测量，连接到 Andor Zyla 4.2 sCMOS 相机和 LED 光源 （Lumencor SOLA II）。
图像处理和分析
使用斐济（ImageJ）[62]对显微镜图像进行可视化和定量。为了量化图1E中的核面积，确定了包含每个原子核最大横截面积的Z平面。一个椭圆被视觉拟合到这个平面上，测量其面积并用作核尺寸的代理。
为了呈现/量化2D-STED图像（图1G-1I和2B-2E），将各个通道居中以校正色偏。将 1 像素高斯模糊应用于所有图像以进行分析和显示。仅出于显示目的，为了考虑图像集中的可变缩放系数，在每张图像上绘制相同像素尺寸的感兴趣区域 （ROI），然后均匀缩放以匹配最小视场。亮度和对比度针对每张图像进行单独调整。为了测量中心粒直径，在每个中心粒上画一条线，并在强度曲线上拟合超高斯曲线。以配合的半最大全宽 （FWHM） 作为中心粒直径。
对于图3B，GFP：：SAS-1病灶是使用自定义斐济宏从晶格光片显微镜数据集中量化的。绘制用户定义的 ROI 以将分析限制在胚胎区域，并逐帧应用高斯拉普拉斯 （LoG） 检测器来识别潜在的中心粒。使用针对每个通道优化的亚像素定位和强度阈值，在每个通道和每个时间点的基础上进行点检测。仅保留用户指定的 ROI 内的焦点，并保存它们的位置和强度以供进一步分析。
For signal intensity quantification in Figs 5G and 6C, sum-projected images of gonads were divided into eight (Fig 5G) or seven (Fig 6C) regions defined by ~3 × the diameter of diplotene nuclei, measured at the onset of cellularization (Fig 5G) or at the gonad loop (Fig 6C). ROIs of 1.8 μm2 were placed on each focus and an adjacent background area. Background-corrected intensities were calculated per channel and normalized to the most distal region. For S2D–S2I Fig, 15 × 15-pixel ROIs were centered on each focus and a nearby background region at the z-slice of maximal intensity. A 6.3 µm sum projection centered on this slice was generated, and background-subtracted signal was measured.
Ciliary assays
对于图4E（L1-L2幼虫）和图4G-4J（L4幼虫）的纤毛染色，将动物在M9缓冲液中洗涤，并与1μM SPY650-微管蛋白（螺色素）孵育3小时。孵育后，在M9缓冲液中再次洗涤蠕虫并立即成像。对于图4L和S5A-S5D图中的染料填充测定，将约200只L4幼虫从M9中的NGM板上洗掉，并与10μg/mL的DiI孵育3小时。在评分/成像之前，让蠕虫在NGM板上脱色30分钟。
趋化性测定基于[40]。从NGM板中收集大约50-100只喂养良好的成虫，并将其放入装有M9缓冲液的Eppendorf管中，并用M9洗涤两次以去除任何残留细菌。通过沿其直径在直线上标记两个点并位于板外围附近，制备了10 cm NGM测定板。在其中一个点，施用 1 μL 100% 异戊醇（引诱剂）与 1 μL 10% 叠氮化钠混合。在相反的点，加入1μL100%乙醇（驱虫剂）与1μL 10%叠氮化钠混合。叠氮化钠有助于麻痹蠕虫，促进准确计数。然后将洗涤后的蠕虫转移到板的中心，距离引诱剂和驱虫点源约 5 厘米。1小时后，分析蠕虫分布情况。对向任一端迁移的蠕虫进行计数和分析，即在引诱剂或驱虫点的大约 2.5 厘米半径范围内。
趋化性指数采用以下公式计算：
趋化指数范围从 -1（完美驱虫剂）到 1（完美引诱剂）。
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sas-1 无等位基因的生成。
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S1 图。 sas-1 无等位基因的生成。
一个。野生型sas-1、sas-1（is6）[11]和sas-1（is13）等位基因示意图。指示用于基于 PCR 的基因分型的 N 端和 C 端引物。湾。使用（A）中提到的引物，从对照和sas-1（is13）突变蠕虫的基因组DNA中PCR产物的琼脂糖凝胶图像。C.Sanger测序显示sas-1（is13）缺失74 bp，从5'-UTR延伸到外显子1，导致ATG起始密码子丢失。D.蠕虫裂解物的蛋白质印迹。请注意，sas-1：：3xflag 的 ~ 65 kDa 波段在 sas-1（is13） 中丢失。E.sas-1（is13）/hT2（gfp）蠕虫的后代试验;N = 8 个技术重复。F.源自菌株 tagRFP-T：：sas-1/sas-1（is13） 的后代基因型示意图，以及 S1G 和 S1H 中相应动物的指示图（创建并改编自 BioRender.Gönczy， P. （2025） https://BioRender.com/s7jx4jh）。G，H。表达GFP：：SAS-7和可能的合子或/和母体TagRFP-T：：SAS-1（G，N = 8个性腺）以及GFP：：SAS-7和母体TagRFP-T：：SAS-1（H，N = 6个性腺）的蠕虫性腺的代表性实时图像。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s001
（TIF）
S2 图。 SAS-1（IS13）中SAS-7和SAS-4的水平。
甲、乙。对照（A）和sas-1（is13）突变体（B）性腺的代表性免疫荧光图像，均表达GFP：：SAS-7并对GFP和SAS-4进行免疫染色。白色编号区域标记了执行信号量化的位置，如C所示。C.对照的远端性腺（N = 6个性腺）和sas-1（is13）突变体（5个性腺;N = 230 个区域 1 的原子核;N = 236 个区域 2 的原子核;N = 208 个区域 3 的原子核）。D、E、G、H。表达 SAS-4：：GFP （D， E） 或 GFP：：SAS-7 （G， H） 的对照 （D， G） 或 sas-1 （is13） 突变体 （E， H） 蠕虫中性腺有丝分裂区域的实时成像。如图所示，定义了宽度~18μm、相距~18μm的三个区域。然后量化SAS-4：：GFP和GFP：：SAS-7在这些区域的信号强度。F，我。SAS-4：：GFP （F） 和 GFP：：SAS-7 （I） 在 （D、E、G、H） 中描述的三个区域的信号强度的量化。F 的病灶数：对照（5 个性腺;N = 58 代表区域 1,61 代表区域 2,61 代表第 3 区），SAS-1（is13）（5 个性腺;区域 1 为 N = 48，区域 2 为 60，区域 3 为 54）。I：对照（5个性腺;区域 1 为 N = 58，区域 2 为 55，区域 3 为 59），SAS-1（is13）（5 个性腺，区域 1 为 N = 56，区域 2 为 56，区域 3 为 51）。学生双尾 t 检验，其中 P < 0.001 （***）。F中对照与sas-1（is13）的差异不显著（区域1：P = 0.77，区域2：P = 0.055，区域3：P = 0.69）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s002
（TIF）
S3 图。 监测对照和 sas-1（is13） 雌性种系中的中心粒。
一个。在有丝分裂区、早期前期和对照（分别为 N = 15、14 和 20）和 SAS-1（is13）突变体（分别为 N = 18、10 和 10）性腺的有丝分裂区、早期前期和晚期前期对 SAS-4 免疫染色的中心粒的代表性 U-Ex-STED 图像。比例尺针对膨胀系数 5 进行了校正。B. 来自 A. 学生双尾 t 检验的对照和 sas-1（is13） 突变性腺指定区域的中心粒宽度的定量，其中 P < 0.05 （*）;磷< 0.01 （**）;P < 0.001 （***）。C、D。 表达 SAS-4：：GFP（绿色）的 sas-1（IS13） 突变雌雄同体与表达 TagRFP-T：：SAS-7（洋红色）的对照雄配。（根据 BioRender 创建和改编。Gönczy， P. （2025） https://BioRender.com/s7jx4h，以及 [63]）。E.标记交配实验的可能结果：（左）对照;在这种情况下，在第 2 周期中，两个 SAS-4：：GFP 病灶存在于两个卵裂球中，它们经历双极纺锤体组装。（中间）SAS-1 对于中心粒组装至关重要;在这种情况下，胚胎中不存在SAS-4：：GFP病灶，并且单极纺锤体组装发生在双细胞阶段的两个卵裂球中。（右）SAS-1 对于中心粒完整性至关重要;在这种情况下，每个卵裂球中最初存在两个 SAS-4：：GFP 病灶，但此后被消除（用黑叉表示）。F，G。原核会议控制时实时成像的快照（F;N = 10）和sas-1（is13）突变体（G;N = 9）单细胞期胚胎。每分钟获取一次图像。DIC通道是单个平面，而GFP：：SAS-7通道是选定Z平面的最大强度投影。虽然两个精子贡献的中心粒在对照组的原核会议时总是可见的 （N = 10），但在 sas-1（is13） 突变胚胎 （N = 9） 的同等阶段不存在 GFP：：SAS-7 的病灶，尽管在某些胚胎的早期阶段检测到一个 （3/9）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s003
（TIF）
S4 图。 SAS-1 在纤毛功能中发挥作用。
一个。如图所示，在幼虫阶段和成年期表达 TagRFP-T：：SAS-1 和 GFP：：SPD-5 的动物前部感觉纤毛的实时成像。每个阶段的 N = 10。在成年阶段的 TagRFP-T 通道中观察到的明亮圆柱形信号可能是来自口腔口的自发荧光。湾。ZIF-1介导的degron系统示意图，本例中ZIF-1表达在dyf-7启动子的控制下。C-F.在对照（C），nphp-4（tm925）（D），Pdyf-7：:d egron（E，注意两个剩余的ZF：：GFP：：SAS-1病灶，可能是由于这些神经元中缺乏ZIF-1表达）和Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925）（F）动物中表达TagRFP-T：：SPD-5和ZF：：GFP：：SAS-1的L1幼虫的实时成像。G.S4C-S4F中TagRFP-T：：SPD-5强度的量化图。矩形投资回报率为 15.82 μm2在两栖纤毛或相邻蠕虫体周围绘制（用于背景减法），投影Z切片总和为6μm。TagRFP-T：：SPD-5 信号报告是两栖纤毛的背景减去平均信号强度。N = 26（对照，来自13只动物）;N = 24（nphp-4（tm925），来自12只动物）;N = 22（Pdyf-7：:d egron，来自 11 只动物），N = 22（Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925），来自 11 只动物）。学生双尾t检验，与对照组相比均不显著;nphp-4（tm925）：P = 0.34，Pdyf-7：:d egron：P = 0.07，Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925），P = 0.05。香港对照（H）、nphp-4（tm925）（I）、Pdyf-7：:d egron（J）和Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925）（K）动物中表达CHE-11：：mKate2和ZF：：GFP：：SAS-1的L1幼虫进行实时成像。L.S4H-S4K中CHE-11：：mKate2强度的量化图。如S4G图N = 12（对照，来自6只动物）中所述进行定量;N = 12（nphp-4（tm925），来自 6 只动物）;N = 12（Pdyf-7：:d egron，来自 6 只动物），N = 15（Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925），来自 8 只动物）。学生双尾 t 检验和比较与对照组进行;nphp-4（tm925）：P <0.001 （***），Pdyf-7：:d egron：P = 0.16，Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925），P <0.001 （***）。nphp-4（tm925）与Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925）的比较：P = 0.06。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s004
（TIF）
S5 图。 枝晶长度测量和化学感觉测定。
公元 D.对照（A）、nphp-4（tm925）（B）、Pdyf-7：:d egron（C）、Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925）（D）动物用DiI染色的phasmid神经元的代表性图像。树突长度的测量方法如下，从神经元细胞体的末端到纤毛的开始画一条分段线（纤毛的染色比神经元的其余部分通过 DiI 染色得多，因此很容易识别）。图像是选定 Z 平面的最大强度投影。E.从 A-D 定量枝晶长度。定量的树突：N = 27（对照，来自14只动物）;N = 27（nphp-4（tm925），来自 14 只动物）;N = 26（Pdyf-7：:d egron，来自 14 只动物），N = 23（Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925），来自 12 只动物）。学生双尾t检验与对照组相比均无统计学意义nphp-4（tm925）：P = 0.06，Pdyf-7：:d egron：P = 0.4，Pdyf-7：:d egron nphp-4（tm925），P = 0.09。F. 化学感觉测定示意图（不按比例）（根据 BioRender 创建和改编。Gönczy， P. （2025） https://BioRender.com/8ba9yul）。有关更多详细信息，请参阅文本。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s005
（TIF）
S6 图。 SAS-1 和 SSNA-1 之间的相互作用。
公元 D.延时成像快照显示 DIC 和 GFP：：SAS-7 在对照组的原核会议时胚胎中的分布 （A;N = 10）、sas-1（t1476）（B;N = 10）、ssna-1（bs182）（C，N = 10）和 sas-1（t1476）;ssna-1（bs182）（D;N = 7） 胚胎。DIC 通道是单个平面，而 GFP：：SAS-7 通道是选定 Z 平面的最大强度投影。E.具有两个 C2 结构域和一个 C 端 α 螺旋的 SAS-1 的 AlphaFold2 预测。连接两个 C2 域的柔性环用虚线表示。F.SAS-1 与 SSNA-1 四聚体结合的 AlphaFold2 预测。SSNA-1 正在形成头尾原纤维，SAS-1 的 C 端螺旋与两个螺旋的界面结合。右上：用虚线标记的界面的放大表示;青色的 SAS-1，粉红色的 SSNA-1。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s006
(TIF)
S7 Fig. SAS-1 contributes to SSNA-1 distribution at sensory cilia.
A. Live imaging of anterior cilia of L1 larvae expressing TagRFP-T::SAS-1 in control (N = 12) and ssna-1(bs182) mutant (N = 13). B. Quantification of TagRFP-T::SAS-1 signal intensity in anterior sensory cilia from S7A. Quantification was performed as mentioned in S4G Fig with a ROI of ~12 µm2. N = 24 from 12 control worms, and N = 26 from 13 ssna-1(bs182) mutants. Student’s two-tailed t-tests, whereby P < 0.05 (*). C. Representative immunofluorescence image of L1 larva stained for ZF:GFP::SAS-1 (green) and SSNA-1::SPOT (magenta). Insets are 2 times magnified.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s007
(TIF)
S8 Fig. Schematic of potential impact of SAS-1 loss on centriole integrity.
A, B. Schematic of two rounds of centriole duplication in the mitotic region of the female germline in control (A) and sas-1(is13) mutant (B) animals. Dashed lines indicate cytoplasmic area around individual germ line nuclei. In the control, the two pre-existing centrioles (C0) each gave rise to one new centriole (C1), which matured during mitosis (top row). In the following interphase, all four centrioles (2x C0 and 2x C1) mentor assembly of one new centriole each (C2) (second row). In the following mitosis, C2 centrioles mature (third row). In the next interphase (last row), all centrioles mentor assembly of one new centriole each (white). In sas-1(is13) mutants, centrioles are generated, but lose structural integrity as they traverse the subsequent mitoses. As a result, germ cell nuclei at the end of the second mitosis exhibit two types of configurations. In both types, the first, younger, centriole (C2) is intact, whereas the second, older, centriole is either deformed (C1) or absent (C0), depending whether it was formed in the previous cell cycle (C1) or earlier than that (C0). Note also that ~20% of sas-1(is13) nuclei are devoid of centrioles (see S2C Fig), so that organelle loss must be more drastic in some cases, perhaps in those configurations with the oldest C0 centrioles. C, D. Schematic of centriole duplication during the meiotic divisions of spermatogenesis in control (C) and sas-1(is13) mutant (D) animals. In the control, the two pre-existing centrioles (C0) each gave rise to one new centriole prior to the first meiotic division (C1). All four centrioles (2x C0 and 2x C1) mentor assembly of one new centriole each (C2) prior to the second meiotic division. In sas-1(is13) mutants, centrioles are assembled as in the control, but the two that were present initially (C0) lose structural integrity during the two meiotic divisions, so that they are ruptured in mature sperm. As a consequence, sperm exhibit two configurations types: one in which both centrioles appear intact, albeit widened, and another one in which one of the centrioles is ruptured.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s008
(TIF)
S1 电影。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s009
（阿维）
S1 表。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s010
（PDF格式）
S1 数据集。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1011912.s011
（XLSX）
确认
我们感谢 Kevin O'Connell 和 Jason Pfister 在发表前分享 ssna-1（bs182） 和 ssna-1：：spot 蠕虫菌株，并进行了富有成效的讨论，Jen-Hsuan Wei 在发表前交流了结果，Cédric Pourroy 帮助了 SPY650-微管蛋白睫状体标记实验，Alana Dastous 帮助了 AlphaFold 多聚体，Rémi Dornier（生命科学学院生物成像和光学平台， EPFL）用于量化 GFP：：SAS-1 病灶的宏观。我们感谢 Friso Douma、Gabriela Garcia-Rodriguez 和 Marie Pierron 对手稿的建设性评论。
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