厦门免费医学论文发表-巴西米纳斯吉拉斯州北米纳斯吉拉斯州和 Vale do Jequitinhonha 地区慢性恰加斯病患者克氏锥虫的遗传多样性

 

伊曼纽尔·德·莫拉·桑托斯·泽维尔，保拉·菲纳莫尔·阿劳霍，珍妮弗·雷亚内·席尔瓦·佩德拉斯，泰纳拉·达席尔瓦·贡萨尔维斯，努比亚·努内斯·德·索萨，阿里拉·莫塔·费雷拉，Léa Campos de Oliveira-da Silva，埃斯特·塞尔代拉·萨比诺，玛丽亚·多·卡尔莫·佩雷拉·努内斯，安东尼奥·路易斯·皮尼奥·里贝罗，奥塔西利奥·莫雷拉 ，

 

抽象

恰加斯病由血鞭毛寄生虫克氏锥虫引起，因其患病率高、发病率和死亡率高而成为拉丁美洲的一个主要公共卫生问题。克氏锥虫分为七个不同的遗传组 （TcI-TcVI） 和 TcBat，称为离散分型单元 （DTU）。了解 DTU 多样性对于改进诊断和治疗策略以及加强流行病学监测至关重要。本研究旨在调查来自巴西米纳斯吉拉斯州北部和杰基蒂农哈河谷流行城市的慢性恰加斯病患者中克氏锥虫的遗传多样性。它还评估了 DTU 与 SaMi-Trop 队列参与者的年龄、寄生虫负荷、抗体水平和心脏病严重程度之间的关联。使用常规多位点 PCR 直接从慢性心脏型个体的外周血样本中进行分子分型。在纳入研究的 80 名患者中，对 37 个样本 （46.25%） 进行了克氏芽孢杆菌基因分型。在鉴定到单个DTU的样本中，TcI和TcVI呈现相同的频率（n = 5，各为13.51%）。在4个样品中鉴定出TcII（n = 4,10.81%），而在3个样品中鉴定出TcV（n = 3,8.10%）。此外，3 人出现混合感染：TcV + TcVI、TcI + TcV + TcII/TcVI 和 TcV + TcII。TcII/TcVI 的频率最高 （n = 17， 45.94%），该分类不代表混合感染。为了进行统计分析，将TcII/TcVI样品归类为TcII。DTU 与年龄或寄生负载之间没有发现显着差异。然而，观察到个体之间的平均寄生虫负荷存在很大差异，范围为 0.06 至 667 寄生虫当量/mL。还观察到抗克氏毛球菌抗体滴度增加。这项研究的结果证明了寄生虫在慢性心脏恰加斯病患者中的遗传多样性及其在高度流行地区的分布。

 

作者总结

即使在发现 115 年后，恰加斯病仍然是一种地方病和被忽视的疾病。了解克氏锥虫的遗传多样性对于改进诊断和控制策略至关重要。这项研究调查了来自米纳斯吉拉斯州北部和杰基蒂农哈山谷流行地区的慢性心脏病患者中克氏锥虫的遗传多样性。分子分型显示，对于具有单个鉴定 DTU 的样本，TcI 和 TcVI 表现出相等的频率，其次是 TcII 和 TcV。还鉴定出混合感染。TcII/TcVI 的频率最高，该分类不代表混合感染。DTU 与年龄或寄生虫负荷之间没有发现显着差异，同时检测到抗克氏毛滴虫抗体滴度增加。这些发现强化了克氏锥虫分子表征对于了解恰加斯病生态流行病学的重要性，特别是在DTUs多样性高且混合感染发生的地区。这些信息对于制定更有效的诊断、治疗和控制策略至关重要。

 

数字

表2图1图2图3表1图4图5表2图1图2图3

   

引文： Emanuelle de Moura Santos Xavier， Araujo PF， Pedras JRS， da Silva Gonçalves T， de Souza NN， Ferreira AM， et al. （2025） 巴西米纳斯吉拉斯州北米纳斯吉拉斯州和 Vale do Jequitinhonha 地区慢性恰加斯病患者克氏锥虫的遗传多样性。公共科学图书馆 Negl Trop Dis 19（10）： e0013627。 https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013627

 

编辑 器： Laura-Isobel McCall，美国圣地亚哥州立大学

 

收到： 2024 年 12 月 9 日;接受： 2025 年 10 月 8 日;发表： 10月 15， 2025

 

版权所有： © 2025 Xavier 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

 

数据可用性： 所有相关数据都在稿件及其支持信息文件中。

 

资金： EMSX 和 NNS 是巴西高等教育人员改进协调组织 （CAPES） 的研究生研究员，JRSP 和 TGS 是米纳斯吉拉斯州研究支持基金会 （FAPEMIG） 的研究生研究员。PFA 是里约热内卢 Fundação Carlos Chagas de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro （FAPERJ） 的博士后研究员。这项研究由美国国立卫生研究院 （NIH） （nº 1P50AI098461- ECS） 和 FAPEMIG （APQ-03659-23 - TMV） 资助。ALPR 部分得到 CNPq （310790/2021-2、409604/2022-4、445011/2023-8 和 408659/2024-6） 和 FAPEMIG （RED 00192-23） 的支持。CNPq （03209/2025-9） 和 FAPERJ （CNE E-26/201.096/2022） 支持 OCM。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备中没有任何作用。

 

利益争夺： 提交人声明不存在竞争利益。

 

介绍

在热带生态系统以及农村和城市社区中，一个持续存在的挑战回响：恰加斯病 （CD）。该病由血鞭毛寄生虫克氏锥虫引起[1]，它超越了地理和时间界限，仍然是一个科学和公共卫生的困境。由于没有临床症状，CD的早期发现往往受到阻碍，因为约70%的慢性CD患者无症状（形式不确定），而30%的患者表现为心脏和消化系统表现，这可能致命[2,3]。此外，据估计，目前全世界有6-700万人感染了这种寄生虫[4]。

 

克氏桦虫表现出显着的遗传异质性，分为七个不同的谱系：TcI 到 TcVI，以及 TcBat。这些谱系通常被称为“离散分型单元”（DTU）[5]。克氏桦虫 DTU 模式与 CD 严重程度之间的相关性导致 TcI 与口腔传播或慢性心脏形式之间存在普遍的关联，但不是确定的，而 TcII、TcV 和 TcVI 与更严重的慢性心脏或消化表现有关。另一方面，TcIII、TcIV，尤其是TcBat很少与人类感染相关[3,6,7]。然而，Monteiro等[8]报道说，TcI和TcIV在巴西西部亚马逊地区同时传播，能够感染人类，导致急性感染病例。值得注意的是，TcIV 被确定为该地区与人类感染相关的主要毒株，既有单次感染的爆发，也有涉及不同单倍型的合并感染。

 

北米纳斯和杰基蒂农哈河谷的宏观卫生区慢性克罗恩病易危指数在巴西最高，恰加斯病媒介传播的风险也很高[9,10]。最近关于米纳斯吉拉斯州北部一个城市城市地区受感染的锥薔菌的报道引发了人们对克氏毛虫传播给人类和家畜的风险的担忧[11]。这些数据反映了人群对该病的易感性，但由于获得医疗保健服务的机会有限和病例检出率低，影响了人群的生活质量[9]。此外，CD监测和病媒控制工作也存在缺陷，凸显了在这些地区迫切需要采取更具体的干预措施[12]。

 

因此，加深对恰加斯病生态流行病学的了解，以加强诊断和治疗方法，并加强防控策略至关重要。在此背景下，本研究旨在调查来自巴西米纳斯吉拉斯州北部米纳斯和杰基蒂农哈河谷地区 20 个流行城市的慢性恰加斯病个体中克氏锥虫的遗传多样性，并验证克氏锥虫基因型与个体的年龄、寄生虫负荷、 抗体滴度和心脏病的严重程度。

 

方法

道德、同意和许可

根据巴西国家卫生委员会第 466/2012 号决议规范涉及人类受试者的研究的伦理原则，本研究获得了国家研究伦理委员会（CONEP，批准号 179.685/2012）和圣保罗大学医学院研究伦理委员会的批准（批准号 042/2012）。所有参与者都通过签署知情同意条款或知情同意书 （Termo de Consentimento Livre e Esclarecido - TCLE） 提供知情同意书。

 

学习规划

这是一项纵向研究，利用 SaMi-Trop 研究（圣保罗/米纳斯吉拉斯州被忽视热带病生物标志物研究中心）的流行病学、临床和实验室数据。SaMi-Trop 是一项涉及恰加斯病患者的前瞻性队列研究，在米纳斯吉拉斯州北部地区和巴西杰基蒂农哈河谷的 21 个城市进行。该研究的基线数据是在2013-2014年期间收集的，第一次随访发生在2015-2016年，第二次随访发生在2019-2021年[13,14]。

 

研究人群

为了绘制和招募研究区域的 CD 患者，使用了与初级卫生保健相关的米纳斯吉拉斯州远程护理网络 （RTMG） 数据库。纳入了 ≥18 岁的个体，他们自我报告了 CD，并在 2011 年至 2012 年间通过 RTMG 进行了心电图 （ECG） 改变。有关资格标准、样本量和作程序的更多详细信息，请参阅以前的出版物[13\u201215]。招募时通过便利抽样选择参与者;因此，没有进行样本量计算。招募了大约 200 名克氏锥虫血清学阳性的患者。其中，80 个在 qPCR 中呈阳性结果。在随访期间收集外周血样本并送去进行基因分型以鉴定克氏桦虫 DTU。根据Piron等[16]的说法，通过实时定量PCR（qPCR）在基线时评估寄生虫负荷，靶向克氏滦虫的卫星DNA。在基线和第二次随访期间，使用不同抗原制剂的商业试剂盒（Architect Chagas，Abbott Laboratories，Wiesbaden，Germany）按照制造商的说明评估抗克氏毛刺杆菌抗体的水平[17]。在研究的第二个随访阶段获得了流行病学和临床数据，以及收集用于基因分型的外周血样本（图1）。

 

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图1. 研究数据收集过程的流程图。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013627.g001

 

来自个人的样本

所有参与者都报告在研究时没有接受病因治疗。从每个人身上收集静脉血样（10 mL），并立即以1：1的比例与6M盐酸胍/ 0.2M EDTA溶液（pH 8.0）混合。然后将它们储存在 4°C 下直至进一步加工。

 

DNA提取

按照Ramírez等[18]推荐的方案，使用“高纯PCR模板制备试剂盒”（Roche，Mannheim，Germany）从300 μL胍-EDTA中的静脉血中提取DNA。在方案的最后一步中，将DNA洗脱在100μL洗脱缓冲液中，并储存在-20°C直至使用。

 

克氏锥虫的参考样本

作为一组阳性对照（从克氏滦虫的参考菌株中提取的DNA），使用分类为DTU TcI至TcVI的克氏桦虫培养的表鞭毛体形式。其中包括以下克隆/菌株：Dm28c （TcI）、Y （TcII）、3663 （TcIII）、4167 （TcIV）、LL014 （TcV） 和 CL Brener （TcVI），取自 Oswaldo Cruz 基金会 （COLPROT/Fiocruz） 的原生动物收藏。

 

克氏锥虫基因分型

使用多位点常规PCR将克氏滦虫基因分型为DTU I至VI[19]。根据对每个靶标的 PCR 产物谱的综合分析，使用以下分子标记来鉴定基因型（图 2）：剪接的 Lead 基因间区域 I 和 II：引物 TCC、TC1 和 TC2 用于区分 TcI （350 bp）、TcII、V 和 VI （300 bp） 以及 TcIII 和 IV（非扩增）。24Sα核糖体RNA亚基基因的可变D7结构域：使用引物D75和D76（第一轮）以及D76和D71（第二轮）进行半巢式PCR，以区分TcII和VI（140 bp）、TcIII（125 bp）、TcIV（140/145 bp）和TcV（125或125 + 140 bp）。A10核片段区域：使用引物Pr1和P6（第一轮）以及Pr1和Pr3（第二轮）分化的TcII（690/580 bp）和TcVI（630/525 bp）进行半巢式PCR。

 

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图2. 直接从临床样本中进行克氏桦虫基因分型的流程图。

 

该图显示了每个PCR靶标的预期扩增子大小（以碱基对（bp）为单位。SL-IR I 和 II：剪接的前导基因区域，24Sα rDNA：24Sα 基因的发散 D7 结构域，A10：核 A10 片段。资料来源：[19]。

 

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按照惯例，克氏滦虫的表示后跟符号 （/） 表示样品可能感染了任何提到的 DTU。在这些情况下，（/） 表示所使用的基因分型标准无法在所呈现的标准中识别特定的 DTU。

 

使用Veriti热循环仪（Applied Biosystems）进行扩增反应，具体如下：将5 μL提取的DNA加入12.5 μL的2X GoTaq Green预混液（Promega，Madison，USA）中，其中含有GoTaq DNA聚合酶，缓冲液（pH 8.5），400 μM的每种dNTP和3 mM的MgCl2，以及1.25 μL的每种引物（储备溶液： SL-IR 靶标为 25 μM，24Sα 和 A10 靶标为 10 μM）和 5 μL 超纯水。PCR产物（25 μL）通过琼脂糖凝胶电泳（2%和3% w/v，90V）分离，用0.1X GelRed（Biotium）染色，并在紫外光下观察。使用 100 bp 分子量标记 （Ludwig） 来估计扩增产物的大小。

 

变量

以基因分型结果作为结局（因变量），分类如下：TcI、TcII、TcV、TcVI、TcII/TcVI、TcV + TcII/TcVI、TcI + TcV + TcVI、TcV + TcII。自变量包括城市、年龄、性别、寄生虫负荷、抗体水平和严重程度。患者年龄根据出生日期计算，分为两组：≤ 60 岁和 >61 岁。性别分为男性或女性。关于严重程度概况，参数分类如下： 心电图 （ECG） 变化：分为正常/轻微改变或重大改变。功能类别：分为I、II、III、IV。B型利钠肽（b-type natriuretic peptide， BNP）：按年龄分类为正常或改变[20]。射血分数：分为>50%（正常）或≤50%（改变）[21]。这些数据是从心电图、实验室检查、超声心动图和纽约心脏协会 （NYHA） 功能分类中获得的。

 

统计分析

进行了描述性分析，呈现了分类变量的简单频率 （n） 和相对频率 （%）。随后，使用Fisher精确检验进行双变量分析，仅考虑显著性水平高达5%的关联（p < 0.05）。使用 Shapiro-Wilk 检验验证连续数据的正态分布。采用非参数Kruskal-Wallis检验进行比较分析，显著性设置为p < 0.05。为了评估基线和随访之间抗克氏毛滴虫抗体滴度的变化，应用配对样本 t 检验，考虑 5% 的显着性水平。所有分析均使用预测分析软件 - IBM SPSS Statistics 18.0 版进行。

 

空间分布

DTU 案例的地理配准是使用米纳斯吉拉斯州北部和 Jequitinhonha 河谷城市的地理网格进行的，这些地理网格是从巴西地理和统计研究所 （Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE） 的可公开访问的制图数据库中提取的 （https://www.ibge.gov.br/geociencias/downloads-geociencias.html）。使用 QGIS 软件 3.34.7 （https://www.qgis.org/） 版本进行地图构建。

 

结果

该研究包括 80 名患有心脏型慢性恰加斯病的人，年龄在 34 至 96 岁之间，其中女性占主导地位 （n = 59， 73.8%）。在 34 至 91 岁个体的 46.25% （37） 血液样本中成功鉴定了 DTU 的分子分型，其中 27 名是女性 （73%） （S1 表）。

 

在基因型表征方面，观察到 TcII/TcVI 的频率更高，在 45.94% 的病例中被鉴定出来 （17/37）。DTU TcI 和 TcVI 的频率等于 13.51%（各 5/37），而 TcII 在 10.81% （4/37） 的个体中检测到。此外，8.10%的个体感染了TcV（3/37），3例出现混合感染（1个以上DTU），即TcV+TcVI、TcI+TcV+TcII/TcVI和TcV+TcII。值得注意的是，TcV 存在于所有混合感染病例中（S1 表）。对于统计分析，无法区分特征（TcII/TcVI）的样本被视为TcII。

 

就在米纳斯吉拉斯州北部地区和杰基蒂农哈河谷发现的克氏锥虫 DTU 的分布而言，在五个不同的城市中发现了 TcI 作为单一传染性 DTU，在四个城市中发现了 TcII，在三个城市中发现了 TcV，在五个城市中发现了 TcVI，在分析的 20 个不同城市中，有 11 个城市发现了未解决的 TcII/TcVI 谱。此外，在三个城市观察到混合感染：图马利纳、圣弗朗西斯科和弗朗西斯科萨（图3）。图马利纳市因集中 18.9% 的克氏锥虫样本呈阳性而脱颖而出，在所分析的城市中比例最高。此外，Turmalina在这些城市中也呈现出更大的DTU多样性，鉴定出TcI、TcII、TcV、TcII/TcVI和混合感染（TcV + TcVI），提供了该地区寄生虫的复杂传播动态（图3）。

 

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图3. 来自北部和杰基蒂农尼亚河谷地区个体样本中的克氏锥虫 DTU 的地理分布 （n = 37），巴西米纳斯吉拉斯州，2024 年。

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大多数 DTU （67.6%） 是在 61 岁以上的个体中发现的（表 1），尽管年龄和 DTU 之间没有观察到统计学上的显着差异。此外，61 岁以上的患者的平均寄生虫负荷最高（57.73 等寄生虫/mL）。

 

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表 1. 根据确定的 DTU （n = 37） 比较研究个体的城市、性别和年龄组。

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在比较不同 DTU 之间的寄生虫载量时，观察到感染 TcV 和 TcII/VI 的个体的寄生虫血症平均分别为 174.00 Eq. 寄生虫/mL 和 57.28 Eq. 寄生虫/mL。尽管这些均值较高，但 TcV 和 TcII/VI DTU 之间寄生虫血症水平的差异没有统计学意义（图 4）。

 

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图4. 通过确定的 DTU 比较慢性恰加斯病患者的寄生虫负荷 （n = 37）。

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当比较基线和随访之间个体产生的抗克氏锥虫抗体的滴度时，仅观察到TcV鉴定的抗体滴度平均增加（图5），而在其他个体中，抗体水平随着时间的推移而降低。

 

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图5. 比较慢性恰加斯病患者在基线（2013/2014 年）和随访（2019/2021 年）时抗克氏锥虫抗体滴度，按已确定的 DTU 分布 （n = 37）。

 

黑线代表每个参与者在时期之间的个体轨迹，而红线代表基因型平均值[17]。

 

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大多数分析样本未显示心脏严重程度特征。然而，60% （3/5） 感染 TcI 的个体表现出重大的心电图改变，并被归类为功能等级 IV。感染 TcV 的个体也表现出重大的心电图改变，频率为 66.7% （2/3），并被归类为功能等级 III。在3名混合感染患者中，BNP水平均发生改变，其中2人表现出主要心电图改变，2人被归类为功能分级III（表2）。

 

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表 2. 根据 DTU （n = 37），来自巴西米纳斯吉拉斯州北部和杰基蒂诺尼亚河谷地区慢性恰加斯病患者的心脏严重程度概况。

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讨论

这项研究揭示了北米纳斯吉拉斯州和杰基蒂农哈河谷流行城市慢性恰加斯病患者中克氏锥虫 DTU 的广泛多样性，比之前报告的要多。尽管克氏锥虫感染没有表现出性别偏好[22]，但研究参与者中女性占主导地位，平均年龄为66.5岁，反映了慢性恰加斯病的预期流行病学特征[23,24]。

 

在米纳斯吉拉斯州北部进行的一项研究发现，该疾病的总体患病率超过 9%，4-14 岁的个体患病率为 0.8%，其母亲的血清学呈阴性。这些结果表明该疾病通过媒介继续主动传播[25]。在米纳斯北部的一个城市进行的另一项研究记录了城市地区感染克氏锥虫的锥薔薇物种的发生。这些物种的存在是一个重大的公共卫生问题，因为它表明寄生虫传播给人类和家畜的风险[11]。然而，杰基蒂农哈河谷仍然是慢性恰加斯病最易受感染的地区之一[9]。

 

我们的研究以及其他研究[24\u201226]发现，老年人CD的发病率有所增加，这似乎反映了一系列相互关联的因素。其中，病媒控制运动（如消除感染锥瘤）和输血传播的成功尤为突出，导致巴西急性病例的发生率显著降低[24,26]。然而，低估率仍然很高，许多感染者不知道自己的病情[25]。尽管家庭中存在天然锥蘉，但CD控制程序是脱节的，作用不连续[12]。此外，尚无在常规产前保健中对CD进行系统调查[27]，许多卫生专业人员仍未意识到该疾病或未在临床怀疑中考虑该疾病，这影响了早期诊断和治疗[28,29]。

 

在这项研究中，在分析的样品中观察到更高的 TcII/TcVI 频率 （45.94%）。这一发现与 Tavares de Oliveira 等人的结果一致。[30]，在330例阳性患者中，他成功对175个样本进行了基因分型，其中23例（13.1%）在巴西东南部呈TcII/TcVI特征。在某些情况下，无法区分 TcII 和 TcVI DTU，因为即使在反复 PCR 尝试后，A10 分子靶标也没有扩增。尽管该目标以其高灵敏度而闻名，但由于个体的寄生负载较低，可能会发生扩增失败。这些结果与Rodrigues-dos-Santos等[31]和Oliveira等[30]的研究结果一致，他们也报告了TcII/TcVI感染，但无法区分DTUs。此外，这些发现强化了先前对巴西各地区TcII/TcVI频率的调查，特别是与恰加斯病的国内传播周期相关的研究[31,32]。

 

在鉴定到单个DTU的样品中，TcI和TcVI的频率相等（13.51%）。Souza等[33]发现，来自圣保罗州内陆的9.52%（2/21）慢性恰加斯病患者中存在TcI。此外，Tavares de Oliveira等[30]在巴西东南部地区的三个个体中发现了TcI基因型的存在。作为补充，Cunha等[34]在一项系统评价中观察到，在巴西北部（阿马帕州、托坎廷斯州、帕拉州和亚马逊州），25.2%的克氏锥虫人类感染归因于TcI基因型，从而将该基因型的地理分布转移到全国。在巴西东南部地区，3.3% 的人检测到 TcI，大多数病例起源于米纳斯吉拉斯州。同时，TcVI与南锥体部分地区恰加斯病的国内周期密切相关[3]。在查科地区、阿根廷北部、智利[35]和巴西南部的人类感染中，有报道称该DTU，这些地区从圣卡塔琳娜州克氏虫口腔传播暴发的个体中分离出11株菌株[36]。此外，在米纳斯吉拉斯州的杰基蒂诺尼亚河谷流行区发现了该病毒，对63个样本进行了基因分型，其中11.1%为TcVI[37]。

 

关于TcII基因型，10.81%的感染者被鉴定出来，这与之前的研究一致，这些研究强调了这种DTU在巴西流行地区的优势[30,31,38]。谱系 II 与人类感染广泛相关，特别是在该国南部和东南部地区，并且存在于 CD 的家庭和森林传播周期中。此外，TcII经常与严重的临床表现相关，包括心脏和消化系统[3,7,30,39]。

 

关于 TcV，8.1% 的人被感染。到目前为止，在研究地区的人类感染中尚未报告这种 DTU;然而，这种基因型已在巴西亚马逊地区被检测到[40]。随后使用各种基因分型技术的研究证实了TcV在患有不同心脏和/或消化系统疾病的个体中的优势[3,41,42]。TcV的存在通常与国内感染周期中的媒介和人类有关，在拉丁美洲各个地区的森林周期中很少观察到[3]。

 

三个样本呈混合感染：一个是TcV + TcVI，另一个是TcI + TcV + TcII/TcVI，最后一个是TcV + TcII。这一发现与Abras等[43]的研究一致，他们在西班牙巴塞罗那地区分析的20名个体中发现了两个个体的混合感染，一个是TcV + TcII/TcVI，另一个是TcV + TcII。DTU TcV、TcII和TcVI似乎集中在南美洲中部和南部，主要局限于国内传播周期。此外，Oliveira等[44]的研究还检测到玻利维亚77名个体中有33.7%（n = 26）存在这些感染。这是首次在米纳斯北部个体的单个样本中发现 TcI + TcV + TcII/TcVI 混合感染。

 

在米纳斯吉拉斯州北部进行的一项研究中鉴定了黑色锥体瘤。在63份克氏锥虫阳性样本中，有56份被基因分型。TcI基因型最为普遍，占55%（31/56），其次是TcIII，占20%（11/56），TcII占7%（4/56）。此外，在18%（10/56）的样本中检测到TcI + TcIII混合感染[45]。必须采取综合的环境观，认识到人类并不是孤立的，克氏枷虫水库可以连接家庭和森林传播循环[46]。在这种情况下，不同克氏枷虫DTU的传播表明了传播周期之间的相互联系。

 

克氏桦虫 DTU 在米纳斯吉拉斯州北部地区和杰基蒂农尼亚河谷的分布揭示了 CD 流行病学的特定复杂性。在地理上相近的城市中存在感染不同 DTU 的媒介可能表明存在多个传播周期，包括森林传播，或者可能表明一些感染个体可能在森林覆盖或邻近农村地区接触过寄生虫，那里存在森林传播。这种分布模式不仅突出了寄生虫的遗传多样性，而且还暗示了对疾病控制和预防策略的相关影响。某些地区循环 DTU 的识别可能支持更准确的治疗决策，并有助于优化治疗方案。此外，了解与这些 DTU 相关的传播途径可以加深对恰加斯病生态流行病学的了解，指导实施更有效的监测行动。

 

感染TcV和TcII/VI的个体平均寄生虫血症水平较高（分别为174.00等寄生虫/mL和57.28等寄生虫/mL）。然而，这种差异没有统计学意义。这一发现与Rodrigues-dos-Santos等[31]一致，他们也报告了感染TcII/TcVI的个体中寄生虫载量较高，尽管DTU与寄生虫血症水平之间没有发现统计学上的显着关联。这种模式可能与合并症或高龄的存在有关，这些因素可能有利于免疫抑制和恰加斯病的重新激活。我们的数据也强化了这一观察结果，因为老年人的平均寄生虫负荷最高。

 

在分析抗克氏锥虫抗体滴度时，仅在感染 TcV 的个体中观察到显着增加。根据Nunes等[21]的说法，这些抗体水平升高与恰加斯病患者的死亡率较高有关。此外，研究表明，抗体滴度较高的个体心肌病发病率高出三倍。这些发现强调了抗克氏毛刺抗体作为预后不良和心脏并发症风险增加的标志物的作用，强调了监测这些滴度在这些个体的风险评估和临床管理中的重要性[47]。然而，值得注意的是，我们研究中的 DTU 鉴定仅在随访时进行。因此，我们不能排除在招募时（研究基线）可能存在不同的 DTU，但在后来的随访期间未检测到的可能性。

 

对心脏严重程度特征的分析揭示了感染不同 DTU（特别是 TcI 和 TcV）以及混合感染的个体的重要信息。大多数样本没有显示出严重的心脏特征，但数据表明，很大一部分个体表现出值得关注的心电图改变和功能分类。

 

在感染 TcI 的个体中，60% 表现出显着的心电图改变，并被归类为功能等级 IV，这表明无法在没有不适的情况下进行任何活动，包括休息症状。这种分类至关重要，因为它反映了严重的心力衰竭[48]。

 

在感染 TcV 的个体中，66.7% 表现出重大的心电图改变，并被归类为功能等级 III。这一类意味着，尽管个体在休息时可能感到舒适，但强度低于平时的体力活动会导致症状[49,50]。

 

在三名混合感染者中，BNP 水平都发生了变化。其中两人表现出重大的心电图改变，被归类为功能等级 III。BNP是评估心力衰竭严重程度的重要生物标志物，也是疾病进展的重要预后标志物[51,52]。

 

数据表明，尽管大多数分析样本没有表现出明显的心脏严重程度特征，但具有不同 DTU 的个体中有很大一部分表现出相关的心电图改变和功能分类，表明风险增加。了解这些概况有助于优化治疗并改善受影响个体的预后。

 

本研究中使用的克氏桦虫基因分型方法遵循专业评论推荐的方法之一[53]，并符合DTU命名法的国际共识[54]。该方法因其在临床样本中（尤其是低寄生虫血症慢性患者）的高灵敏度以及成本效益和快速解读而被广泛使用[30,31,55,56]。直接基因分型可以检测混合感染，并更准确地评估寄生虫遗传多样性，而基于培养分离株的方法可能有利于适应体外条件的亚群[53]。尽管多位点 PCR 方法依赖于多个标记来区分密切相关的 DTU（例如 TcII 和 TcVI），但它采用了完善的算法和严格的控制，确保了可靠的结果。该方法的准确性已通过Sanger测序得到验证[19,31]。虽然桑格测序或下一代测序 （NGS） 等替代方法可以克服 PCR 的一些局限性，但它们要复杂得多，成本也高得多。本研究中使用的方法将灵敏度、实用性和成本效益有效结合，使其特别适合大规模临床分析，同时保持 DTU 检测的可靠性，包括混合感染。这项研究有一个局限性，因为不可能扩增对克氏锥虫分子表征至关重要的所有基因。因此，在某些样本中，特别是那些被确定为 TcII/TcVI 的样本中，DTU 之间没有发生完全区分。这种限制可归因于在疾病慢性期患者样本中观察到的寄生虫负荷较低，这使得检测和扩增特定遗传标记变得困难。仅出于统计分析目的，将分类为TcII/TcVI的样本分配到TcII组，因为该分类表明基因分型结果尚无定论，并且在该样本集中，TcII在流行病学上更有可能在该地区发生[57]。未来具有更全面数据的研究可能会克服这些局限性，并允许更精确地表征慢性病患者的克氏桦虫基因型。

 

本研究获得的数据扩展了对克氏锥虫不同菌株及其在流行地区的分布的认识。此外，该研究以开创性的方式证实了米纳斯吉拉斯州北部存在 TcI 和 TcV，以及 Jequitinhonha 山谷存在 TcV，强调了继续研究寄生虫遗传变异性的重要性。不同基因型的表征有助于更好地了解恰加斯病的生态流行病学，从而制定更有效的控制和预防策略。

 

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有关研究中包含的个体 （n = 80）、寄生虫负荷和克氏锥虫基因型鉴定的一般信息。

 

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S1 表。 有关研究中包含的个体 （n = 80）、寄生虫负荷和克氏锥虫基因型鉴定的一般信息。

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013627.s001

 

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确认

作者要感谢 SaMi-Trop 对这项研究的财政支持，感谢高等教育人员改进协调 （Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES） 的奖学金，传染病和寄生虫病实验室 （Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias - LADIP），生物勘探和遗传资源实验室， 卫生研究所 （Instituto de Pesquisa em Saúde - IPS） 提供进行研究的基本实验室基础设施，COLPROT/Fiocruz 提供研究中使用的克氏锥虫参考菌株。作者还感谢使用了 Fiocruz 平台网络的 Fiocruz 分子分析平台 （RPT09J） 的设备和技术援助。

 

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