CD8+ T 细胞空间生物标志物在 ER+ 和 ER− 乳腺癌中的预后意义：一项回顾性队列研究

安德鲁·沃克 ，高晓华，王启晨，加布里埃拉·德拉克鲁斯，李迪东，查尔斯·佩鲁，乔尔·萨尔茨，J.S.马龙

 

抽象

背景

肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 在三阴性乳腺癌中具有预后性，但雌激素受体 （ER） 阳性癌症则不然，雌激素受体 （ER） 阳性癌症占乳腺癌的 70%-80%。这是由于ER阳性肿瘤的免疫浸润相对较低。然而，很少有研究探讨使用空间方法评估的低丰度 TIL 的预后影响。本研究的目的是探讨淋巴细胞相对于肿瘤细胞的分布是否能预测预后。

 

方法和发现

在这项回顾性队列研究中，我们使用从 1,467 名研究参与者那里获得的组织微阵列核心（细胞角蛋白 [Ck]、CD8 和 FoxP3 染色）的多重免疫荧光 （IF） 染色图像来计算上皮细胞和免疫细胞的基于距离的视觉形态测量，包括两个新指标，邻近性和一致性.接近性和一致性定义为 Ck+ 肿瘤细胞和 CD8+ T 细胞之间最近邻距离的平均值和方差的函数。使用Kaplan-Meier生存曲线和Cox比例风险模型差异的对数秩检验，将邻近性和一致性的预后意义与淋巴细胞计数进行比较。在CD8+ T细胞高度接近和一致性的情况下，ER+和ER−乳腺癌的无复发生存期（RFS）均较好。在ER−乳腺癌中，邻近性具有最高的RFS风险比（HR 1.84,95%CI [1.18,2.87];p = 0.0069）与计数和一致性相比。在ER阳性受试者中，RFS的邻近性和一致性风险比为2.04（95%CI [1.39,2.98];p = 0.0003）和1.82（95%CI [1.23,2.69];p = 0.0026），分别。这些关联比淋巴细胞计数更强（HR 1.35,95% CI [0.92,1.98];p = 0.1289）。通过控制年龄、肿瘤分级、分期、ER 状态、黄体酮受体状态和人表皮生长因子受体 2 状态等临床和人口统计学变量，证明了 的独立预后价值。这些 IF 衍生的空间指标也与已建立的 TIL 指标和基于 RNA 表达的肿瘤适应性免疫反应测量相关。尽管这些结果很有希望，但我们对肿瘤免疫微环境的探索受到数据可用免疫标志物数量少的限制。

 

结论

无论 ER 状态如何，由邻近性和一致性描述的空间特征通常与复发相关。ER+ 乳腺癌邻近的预后意义意味着空间参数可以识别将从免疫治疗中受益的个体;高达 75% 的乳腺癌经历 T 细胞接近，提示免疫易感性。

 

作者总结

为什么要进行这项研究？

肿瘤中存在的免疫细胞可以预测某些乳腺癌亚型的生存结果。

先前的研究尚未确定雌激素受体阳性乳腺癌中免疫细胞的存在与存活之间的明确关联，雌激素受体阳性乳腺癌是一种免疫细胞含量较低的常见亚型。

独立于免疫细胞数量的空间方法尚未得到彻底研究，但可以提供对免疫细胞数量较少的乳腺癌的见解。

研究人员做了什么并发现了什么？

我们确定了乳腺癌组织图像中存在的免疫细胞和肿瘤细胞。

我们根据CD8+ T细胞和肿瘤细胞之间的距离开发了两种空间测量。

使用这些测量，我们表明 CD8+ T 细胞与肿瘤细胞的接近与更好的生存结果相关，即使在雌激素受体阳性乳腺癌中也是如此。

这些发现意味着什么？

即使在低丰度的情况下，免疫细胞的存在也可能表明更好的生存机会。

免疫疗法可能使更广泛的以前不符合资格的乳腺癌患者受益。

这项研究的一个关键局限性是，由于缺乏可用标记物，我们无法充分询问肿瘤内的免疫细胞相互作用。

数字

Table 3Fig 1Fig 2Fig 3Table 1Table 2Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Table 3Fig 1Fig 2Fig 3

    

引文： Walker AE， Gao X， Wang Q， De la Cruz G， Li D， Perou CM， et al. （2025） CD8+ T 细胞空间生物标志物在 ER+ 和 ER− 乳腺癌中的预后意义：一项回顾性队列研究。公共科学图书馆医学 22（10）： 电子邮件 1004647。 https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647

 

学术编辑： Ricky W. Johnstone，Peter MacCallum 癌症中心，澳大利亚

 

收到： 2025 年 5 月 21 日;接受： 2025 年 9 月 19 日;发表： 10月 15， 2025

 

版权所有： © 2025 Walker 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

 

数据可用性： 根据 NIH 政策，本研究中使用的参与者数据被认为是“敏感的”。因此，北卡罗来纳大学 IRB 对这项研究的部分批准要求数据共享的数据使用协议。卡罗莱纳州乳腺癌研究通过研究网站 （https://unclineberger.org/cbcs） 为数据共享请求提供了意向书流程。

 

资金： 这项研究得到了北卡罗来纳大学莱恩伯格综合癌症中心的资助，该中心由北卡罗来纳州大学癌症研究基金、Susan G Komen 基金会（OGUNC1202、OG22873776、SAC210102、TREND21686258 MAT 和 AEW）、国家癌症研究所（R01CA253450 MAT 和 KAH）、国家癌症研究所乳腺癌卓越研究专业计划 （SPORE）（NIH/NCI P50-CA058223 到 CMP， MAT、KAH 和 JSM）、乳腺癌研究基金会（HEI-23-003 至 CMP 和 MAT）和美国国防部（HT94252310235至 MAT）。这项研究在北卡罗来纳州中央癌症登记处和北卡罗来纳大学莱恩伯格分校之间的合作快速病例确定 （RCA） 的协助下招募了参与者和/或获取数据。RCA 得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所（P30CA016086 CMP、MAT、KAH 和 JSM）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

 

利益争夺： 我读过该期刊的政策，这篇手稿的作者有以下利益竞争：C.M.P 是 BioClassifier LLC 的股东和顾问;C.M.P 还被列为乳腺 PAM50 亚型检测专利申请的发明人。

 

缩写： 自动发声， 适应性富集;AGI， 任何基因组不稳定性;全细胞计数器， 卡罗莱纳州乳腺癌研究;CK， 细胞角蛋白;的 雌激素受体;FFPE， 福尔马林固定，石蜡包埋;他 苏木精-伊红;HER2， 人表皮生长因子受体2;人力资源 风险比;人力资源开发， 高度同源重组缺陷;即， 先天富集;如果 免疫 荧光;NGI， 无基因组不稳定性;或 比值比;公关 黄体酮受体;备注 肿瘤 MARKer 的转运建议;RFS， 无复发生存期;直到 肿瘤浸润淋巴细胞;TNBC， 三阴性乳腺癌;;北卡罗来纳大学， 北卡罗来纳大学教堂山分校

 

介绍

肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes， TIL）的存在对乳腺癌的预后具有重要意义[1\u20123]。此外，免疫治疗联合化疗已成功治疗三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC）[4,5]。然而，根据现行指南，70%-80%的乳腺癌是雌激素受体（estrogen receptor， ER+），不符合免疫治疗条件[6\u20128]。其中许多肿瘤通常具有中度免疫浸润。最近，几项试验证明免疫检查点抑制剂在高级别ER+/人表皮生长因子受体（HER2−）乳腺癌中具有潜在益处[9,10]。鉴于免疫治疗能够靶向肿瘤免疫微环境以及免疫治疗联合辅助化疗的潜在益处，有必要更好地了解免疫细胞与乳腺癌亚型肿瘤的相互作用[5,11]。

 

我们之前的工作将ER+和ER−参与者的基因组不稳定性与免疫反应联系起来，这表明即使在ER+参与者中，免疫原性基因组不稳定性也具有预后意义[12]。然而，在 ER+ 乳腺癌中很难检测到免疫原性反应，因为 TIL 计数往往存在于低或中等水平。因此，考虑免疫细胞是否靠近肿瘤细胞可能很重要。在ER−乳腺癌的高计数免疫浸润的背景下，更容易满足邻近的假设。然而，在中度浸润的肿瘤中，肿瘤和免疫细胞之间的距离可能会有所不同。极少数研究评估了邻近性[13,14]或其他空间特征[15,16]，也很少有研究在分析中使用特定的细胞类型标记物[11,17]，例如通过多重免疫荧光（multiplex immunofluorescent， IF）获得的标记物[18]。依赖苏木精-伊红（HE）染色图像或批量基因表达的TIL计数[2,3,19]忽略了CD8+ T细胞与肿瘤细胞死亡之间潜在的重要空间关系[20]。

 

我们假设淋巴细胞相对于肿瘤细胞的分布可以预测预后。我们将接近度（CD8+ T 细胞和细胞角蛋白 [Ck+] 肿瘤细胞之间的平均最近邻距离的测量）和一致性（CD8+ T 细胞和 Ck+ 肿瘤细胞之间最近邻距离的变异性的测量）视为描述 CD8+ T 细胞在肿瘤免疫微环境中分布的两个空间指标。我们将这些措施与已建立的乳腺癌免疫微环境的基因表达和基于计数的措施进行了比较，并评估了不同研究人群的乳腺癌参与者与乳腺癌预后的关联。

 

方法

本研究根据肿瘤MARKer预后研究的REporting建议（REMARK）指南（S1 REMARK检查表）进行报告[21]。

 

研究人群

这项研究在卡罗莱纳州乳腺癌研究 （CBCS） 的第 3 阶段（2008-2013 年）中使用了乳腺癌的病理图像。3期CBCS的数据收集方法已有详细描述[22]。通过北卡罗来纳州中央癌症登记处的快速病例确定招募受试者[23]。CBCS资格要求受试者为20-74岁且首次诊断为浸润性乳腺癌的女性，并且必须是北卡罗来纳州特定县的居民[23]。受试者根据北卡罗来纳大学教堂山分校医学院机构审查委员会的方案入组，并提供了知情同意书[23]。组织微阵列核心的多重 IF 图像以及复发时间数据可供 1,740 名参与者使用。在去除未通过质量控制标准的组织微阵列核心后，数据集减少到 1,467 名参与者，如图像处理部分所述。补充材料中提供了详细的质量控制流程图（S1 图）。在质量控制之前和之后计算了常见人口统计学和临床变量的分布，以确保参与者的减少不会引入偏差（图 1）。我们没有观察到这些变量的分布有任何实质性变化。在1,467名受试者中，914名受试者具有免疫分级数据[24]，864名受试者具有任何基因组不稳定性/无基因组不稳定性（AGI/NGI）类别[12]，只有288名受试者具有整张玻片图像TIL空间评分，包括瘤内强度、瘤周强度、TIL森林和TIL沙漠评分[25]。将这些基于RNA的和更大规模的空间指标与本文推导的空间指标进行比较，以方便生物学解释。

 

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图1. 质量控制前后参与者的人口统计学和临床变量分布。

 

该表提供了 3 期卡罗莱纳州乳腺癌 （CBCS） 研究参与者的分布，以及质量控制前后几个重要临床和人口统计变量的可用多重免疫荧光组织微阵列图像。应用质量控制后，参与者的分布变化很小。参与者人数 （N）;非非裔美国人（Non-AA）;雌激素受体 （ER）;黄体酮受体（PR）;人表皮生长因子受体 2 （HER2）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.g001

 

组织微阵列染色和处理

从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块上切下多达四个1 mm核心，并添加到组织微阵列网格中，并从CBCS3病例的子集中获得组织。CBCS3组织微阵列构建的细节之前已经描述过[26]。使用Bond Rx全自动载玻片染色系统（Leica Biosystems）和Bond Research Detection kit（DS9455）对5μm FFPE切片进行三重免疫荧光。载玻片在 Leica Bond Dewax 溶液 （AR9222） 中脱蜡，在 Bond Wash 溶液 （AR9590） 中水合，并依次染色 CD8 （Cell Marque， 108R-14）、FoxP3 （abcam， ab20034） 和 Ck （Leica Biosystems， NCL-L-AE1/AE3-601）。具体而言，在 100 °C 下在 pH 6.0 （AR9961） 的 Bond-Epitope Retrieval 溶液 1 （ER1） 中进行 CD8 抗原修复 20 分钟。预处理后，将载玻片与CD8（1：200）在25°C下孵育1小时，然后与Novolink Polymer（Leica Biosystems，RE7260-CE）孵育，然后用TSA Cy3（Akoya Biosciences，SAT704A001EA）。在100°C下在键表位修复溶液1（ER1）中进行第二轮抗原修复10分钟。然后将载玻片与FoxP3（1：120,2小时）在25°C下孵育，然后与Novolink聚合物或Post Primary plus Polymer组合孵育，并用TSA Cy5（Akoya Biosciences，SAT705A001EA）检测。最后一轮抗原修复与 ER1 一起进行 10 分钟，然后将载玻片在 25 °C 下在 Ck 中孵育（1：300,30 分钟），然后用 Novolink 聚合物或 Post Primary 加聚合物组合和 Alexa Fluor 488 酪胺试剂（Thermo Fisher Scientific，B40953）。用 Hoechst 33258 （Invitrogen） 染色细胞核。用 ProLong Gold 抗淬灭试剂（Thermo Fisher Scientific，P36930）安装染色载玻片。该运行包括阳性和阴性对照（无一抗）。使用 Aperio Versa 200 扫描仪（Leica Biosystems）以 20× 的表观放大倍数对 IF 载玻片进行高分辨率采集。图像已上传到 eSlideManager 数据库 （Aperio）。染色过程由北卡罗来纳大学教堂山分校 （UNC） 的病理学服务核心完成，这项研究得到了北卡罗来纳大学人类伦理办公室和机构审查委员会的批准。

 

图像处理

多重 IF 图像由多个 1 mm 组织微阵列核心的载玻片组成，其中大多数参与者最多有四个核心，而一小部分参与者采集了两个组织样本，最多有八个核心。组织微阵列核心取自病理学家确定的肿瘤内区域，该区域选择了高比例的上皮细胞。图像有四个颜色通道，每种颜色表示四种生物标志物之一：Hoechst（蓝色）、细胞角蛋白（青色）、CD8（绿色）和 FoxP3（红色）。Hoechst 通道是细胞核的指示剂，CD8 和 FoxP3 是淋巴细胞的指示剂，细胞角蛋白是肿瘤细胞的指示剂。

 

细胞分割和分类在Qupath数字病理学软件中进行[27]。使用 Qupath 中的细胞检测功能对细胞进行分割，该功能根据 Hoechst 通道的强度对细胞进行分割。病理学家目视评估了几个样本，以确认最终的分割给出了合理的表示。使用 Qupath 中的简单阈值分类器进行细胞分类。细胞被分类为肿瘤、CD8+ T 细胞、CD8+/FoxP3+ 或未分类。阈值是根据对细胞边界内像素级平均通道强度的仔细分析来选择的。当CD8和FoxP3通道的平均强度都超过阈值时，细胞被分类为CD8+/FoxP3+，当CD8（而不是FoxP3）的平均强度超过阈值时，CD8+ T细胞被分类为CD8 + T细胞，仅当Ck通道的平均强度高于阈值并低于FoxP3和CD8的阈值时，才将肿瘤分类为肿瘤。病理学家目视评估了几张样本图像以验证最终分类。在同一载玻片上，CD8的QuPath定量与Halo定量高度相关（ρ = 0.97）。QuPath CD8密度测量值（单位面积计数）也与来自同一肿瘤标本不同核心的RNA表达数据相关（ρ = 0.49）。有关细胞检测功能中使用的参数以及使用的细胞分类阈值的详细信息，请参阅补充材料（S1 表）。从 QuPath 导出细胞的质心坐标以及类标签，并在 Python 中计算邻近度和一致性生物标志物，如下一节所述。为确保数据质量，去除了肿瘤细胞少于 1,000 个且总细胞少于 3,000 个的组织微阵列核心。

 

空间生物标志物

空间生物标志物值是在 Python 中计算的，所有空间测量都是在接收临床数据之前进行的。计算每个组织微阵列核心从肿瘤细胞到 CD8+ T 细胞的最近邻距离。所有距离都小于 1,000 微米，具体取决于组织微阵列核心的大小。由于最近邻距离的分布高度偏斜，因此确定最近邻距离的以 10 为底的对数 （log10） 是更好的表示。汇总了与单个研究 ID 相对应的每个组织微阵列核心的 log10 最近邻距离的集合，并计算了每个研究 ID 的聚合 log10 最近邻距离分布的平均值和方差。一致性指标被解释为个体内和跨核心异质性的衡量标准。log10 最近邻距离的平均值和方差不是对肿瘤细胞接近度和距离一致性的直观测量。相反，接近度计算为 log10 最近邻距离平均值的函数，一致性计算为 log10 最近邻距离方差的函数。这确保了高接近值意味着 CD8+ T 细胞平均更接近肿瘤细胞，并且高一致性值在 CD8+ T 细胞和肿瘤细胞之间的距离上具有较小的变异性。但是，对这些指标的解释是相对的，而不是绝对距离指标。

 

接近度由以下公式给出：（3 - 从肿瘤细胞到 CD8+ T 细胞的 log10 最近邻距离的平均值）。邻近度的范围可以从 0 到 3，因为 log10 最近邻距离的最大平均值小于 3。一致性由以下公式给出：（1—肿瘤细胞到 CD8+ T 细胞的 log10 最近邻距离的方差）。一致性范围为 0 到 1，因为最近邻距离的最大方差小于 1。淋巴细胞计数计算为分类为 CD8+ T 细胞和 CD8+/FoxP3+ 细胞的细胞总数。参与者水平的淋巴细胞计数计算为所有参与者核心的淋巴细胞计数的平均值。当根据高/低淋巴细胞计数对参与者进行划分时，使用中位数作为分界点。将邻近性和一致性二值化，以比较接近度/一致性值高与低的参与者之间的复发差异。我们探索了各种切点，以确保接近性和一致性。分析中使用的切点是基于根据四分位数将数据分为四组，然后折叠具有相似生存率的组。崩溃后，中位数是一致性的最终切点，第 1 四分位数是接近度的最终切点。试图使用训练和测试拆分找到最佳的、数据驱动的切点，但由于只有一小部分参与者复发，这导致结果不稳定。尝试优化的结果作为补充材料提供（S2 表）。

 

统计分析

Kruskal-Wallis检验是方差分析检验的非参数版本，用于确定按ER状态划分的邻近度、一致性和log10淋巴细胞计数分布的中位数之间是否存在统计学上的显着差异，以及乳腺癌亚型之间。采用Kaplan-Meier法估计无复发生存期（RFS）曲线。所有曲线都包括 95% 置信区的估计值。对数秩检验用于计算生存曲线的 Kaplan-Meier 估计值之间差异的 p 值。风险比和相应的 95% 置信区间是使用 Cox 比例风险模型计算的。在纳入 Cox 比例风险模型之前，对连续计数和邻近度测量进行了归一化。多变量生存模型的所有 p 值均来自 Cox 比例风险模型。在所有情况下，比例风险假设都使用Grambsch和Therneau（1994）[28]描述的比例性检验得到证实，该检验由R生存包中的cox.zph函数实现。在一个模型的协变量集是更复杂模型的子集的情况下，在比较模型时，似然比检验用于确定显着性。Spearman 相关系数用于确定我们的计数、邻近度和一致性指标与瘤内强度、瘤周强度、TIL 森林和 TIL 沙漠评分之间的单调关联。Fisher 的 z 变换用于估计 Spearman 相关系数的 95% 置信区间。假设数据是由多项式模型生成的，计算比值比 （OR） 和 95% 置信区间，以确定接近性、一致性和淋巴细胞计数与 AGI 分类参与者的关联水平，并确定接近性、一致性和淋巴细胞计数与自适应富集 （AE） 参与者的关联水平。0.05 水平用于所有具有统计显着性的检验。除生存分析外，所有统计分析均使用 Python 中的 SciPy 1.14.1 版进行。使用 Python 中的 Lifelines 0.29.0 版计算 Kaplan-Meier 曲线，使用 R 中的 Survival 3.5.5 计算 Cox 比例风险模型。

 

道德声明

该研究根据美国共同规则获得了北卡罗来纳大学机构审查委员会 （92-0410） 的批准。所有研究参与者在进入研究之前都提供了书面知情同意书。这项研究符合相关的伦理法规，包括《赫尔辛基宣言》。

 

结果

接近性和一致性

为了量化淋巴细胞浸润，我们计算了邻近度，即每个肿瘤细胞到 CD8+ T 细胞的平均最近邻距离的函数（图 2）。CD8+ T 细胞定义为 CD8+ /FoxP3−。由于计数是一种常用的空间指标，因此计算淋巴细胞计数，定义为 CD8 或 FoxP3 阳性细胞的数量，以比较邻近性和一致性。

 

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图2. 乳腺癌组织的多重免疫荧光 （IF） 图像和相应的细胞分割。

 

乳腺癌组织的多重 IF 图像。（a 和 c） 细胞用 4 种颜色染色，表示 Hoechst（蓝色）、细胞角蛋白（青色）、CD8（绿色）和 FoxP3（红色）的生物标志物。（b和d）多重IF图像，带有指示细胞分类的叠加彩色图块：上皮（青色），CD8 + T细胞（绿色），CD8 + / FoxP3 +（黄色），仅FoxP3（红色）和未分类（深灰色）。使用Hoechst通道检测细胞，并根据细胞角蛋白，CD8和FoxP3通道的强度分类为上皮细胞，淋巴细胞或未分类。计算从每个上皮细胞到最近的 CD8+ T 细胞（蓝线长度）的距离。距离用于计算邻近度和一致性。图像（a）表示高接近标本，而（c）表示低接近标本。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.g002

 

我们计算了邻近度、一致性和计数分布的核密度估计值（图3）。邻近度和计数的分布往往更宽，而一致性的分布则更紧密。Kruskal-Wallis检验给出的H统计量用于确定ER状态的计数中位数、邻近性和一致性之间是否存在差异的证据（图3）。高接近性、高一致性和高计数显示出与 ER 状态相关的有力证据。就幅度而言，log10淋巴细胞计数与ER状态的关联最强（H = 76.44，p < 0.0001），其次是接近 性（H = 17.45，p < 0.0001）和一致性（H = 6.01，p = 0.01）。

 

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图3. 按雌激素受体 （ER） 状态和 PAM50 亚型分布计数、接近度和稠度。

 

3 期卡罗莱纳州乳腺癌研究 （CBCS） 参与者中 （a） 对数基 10 淋巴细胞计数、（b） 邻近度和 （c） 一致性值的密度图，具有亚密度，并叠加了按 ER 状态（上行）和 PAM50 基因特征亚型（下行）着色的数据的抖动散点图。H 统计量和 p 值对应于 Kruskal-Wallis 检验，这是方差分析检验的非参数版本。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.g003

 

我们还评估了 PAM50 分子亚型的计数中位数、接近度和一致性之间的差异（图 3）。同样，PAM50亚型的log10淋巴细胞计数差异最大（H = 92.85;p < 0.0001），但邻近性差异也很显着（H = 26.48;p < 0.0001）和稠度（H = 8.77;p = 0.03）。与 ER 状态一样，邻近性和一致性的分布是重叠的，特别是在 Basal 与 Luminal 中。这意味着接近性和一致性并不能区分 ER 状态和 PAM50 亚型以及淋巴细胞计数，而是跨亚型共享的空间参数。

 

最后，我们考虑了所有计算的空间指标之间的相关性水平（S3 表）。接近度和计数显示出中等水平的相关性（corr. = 0.5545）。这并不出乎意料，因为细胞距离本质上受细胞密度的影响。然而，计数和一致性之间的相关性较低（corr. = 0.3261）。此外，接近性和一致性的相关性相对较低（corr. = 0.4717）。

 

无复发生存期分析

连续接近度、一致性和计数分数包含在 Cox 比例风险模型中，以评估空间测量的显着性（表 1）。为了实现可解释性，计算风险比，使得较高的连续变量值（假设的良好预后表型）是所指对象。给出了调整后和未调整的风险比，每个空间评分都针对其他两个变量进行了调整。由于两个变量之间的中等相关性，还考虑了邻近度和计数之间的相互作用。在单变量模型中，所有空间变量都显示出与复发相关的证据，其中接近性 （p < 0.001） 和一致性 （p < 0.001） 的证据最强。在所有样本中，邻近性与RFS的关联最强（HR：2.46,95%CI [1.54,3.92];p < 0.001）。在根据其他空间因素调整的多变量模型中，邻近度保持了很强的效应量，风险比为2.04（95%CI [1.12,3.70];p = 0.0189）。一致性显示出一些与复发相关的证据，风险比为1.14（95%CI [1.00,1.30];p = 0.0554）。没有证据表明，在调整其他空间指标后，计数或计数与邻近度之间的交互作用与复发相关。

 

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表 1. 连续空间度量的 Cox 比例风险模型。

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.t001

 

邻近性和一致性包含在具有重要临床和人口统计学变量的 Cox 比例风险模型中（表 2）。在根据年龄、分期、分级、急诊室状态、PR状态和HER2状态进行调整的多变量模型中，邻近性继续显示出与风险比2.88相关的有力证据（95%CI [1.70,4.90];第 < 0.0001 页）。然而，没有证据表明在调整临床变量和年龄后一致性与复发相关 （p = 0.2060）。

 

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表 2. Cox 比例风险模型，用于针对临床变量进行调整的连续空间指标。

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.t002

 

二分空间度量的RFS函数的Kaplan-Meier估计如图4所示，单变量和多变量Cox比例风险模型的风险比如图5所示。与先验知识一致，ER阴性肿瘤显示出淋巴细胞计数与改善结果之间的关联（图4，第三行，p = 0.027）。较高的淋巴细胞计数与较长的生存率相关（HR 1.61;95% CI [1.05， 2.45];p = 0.0284 对于低计数与高计数）。然而，邻近性也显示出相关性，与可比的HR（HR 1.84;95%CI [1.18,2.87];p = 0.0069）。一致性几乎没有证据表明与复发相关（p = 0.0576）。

 

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图4. 总体参与者和按雌激素受体 （ER） 状态分层的参与者的计数、接近度和一致性的 Kaplan-Meier 生存曲线。

 

Kaplan-Meier 估计无复发生存期 （RFS），比较 3 期 CBCS 参与者总体上的高邻近度与低接近度、一致性和淋巴细胞计数，并按 ER 状态分层。95% 的置信范围由阴影区域给出。每个图下方给出了高危参与者人数表。P 值 （p） 对应于曲线之间差异的对数秩检验。风险比 （HR） 和 95% 置信区间 （95% CI） 用于高状态与低状态的生存曲线风险之间的差异。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.g004

 

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图5. 总体参与者的计数、邻近性和一致性风险比的森林图，并按雌激素受体 （ER） 状态分层。

 

风险比和邻近度、一致性和淋巴细胞计数的 95% 置信区间的森林图二元变量在考虑所有参与者时比较低值和高值，并按 ER 状态分层。风险比在未调整的情况下给出（蓝色），根据淋巴细胞计数（红色）进行调整，并根据接近性和一致性（黑色）进行调整。风险比是相对于参考组的（参考文献）。参考组是高计数、高邻近性和高一致性。每组给出了组规模 （N） 和经历复发的参与者人数（事件）。风险比 （HR）;95% 置信区间 （95% CI）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.g005

 

当同时考虑 ER+ 和 ER− 肿瘤时，计数和邻近度的关联存在差异。在总体乳腺癌中，高接近性和高一致性都显示出与复发相关的有力证据（p < 0.001），而几乎没有证据表明淋巴细胞计数与复发相关（图4，上行）。邻近性的风险比为1.94（95%CI [1.46,2.58];p < 0.0001 低邻近度与高邻近度），低一致性受试者复发率更高，风险比为 1.62（95% CI [1.22， 2.15];p = 0.0008 低一致性与高一致性）。淋巴细胞计数的总体关联性最弱，风险比为1.29（95%CI [0.98,1.71];p = 0.0709）。

 

在ER阳性参与者中，高接近性和一致性与较低的复发率密切相关（图4，中行，p值<0.01）。低接近度与高接近性和一致性的风险比为2.04（95%CI [1.39,2.98];p = 0.0003）和1.82（95%CI [1.23,2.69];p = 0.0026），与总体癌症相似。相比之下，低淋巴细胞计数与高淋巴细胞计数的风险比为1.35（95%CI[0.92,1.98];p = 0.1289）（图 5）。当包括CD8 + / FoxP3 +细胞来计算邻近性和一致性时，RFS分析的结果是相似的（S2图）。这表明，虽然淋巴细胞计数与 ER 阳性参与者的复发无关，但无论 ER 状态如何，由邻近性和一致性描述的空间特征通常与复发相关。

 

为了评估相对于仅具有淋巴细胞计数的模型的邻近性和一致性的独立价值，我们使用了嵌套的 Cox 比例风险模型和似然比检验（S4 表）。我们发现，与单独计数的模型相比，包括邻近性和一致性提高了拟合度（p < 0.0001）。此外，在调整计数时，邻近性和一致性的风险比与未调整的风险比没有显着差异，总体和ER阳性（图5）。

 

同样，我们评估了淋巴细胞计数是否在包括邻近性和一致性在内的模型中提供独立价值。与仅包含邻近度和一致性的模型相比，LRT 测试表明，与仅包含邻近度和一致性的模型相比，在模型中包含计数并没有提高拟合度 （p = 0.55）。此外，当通过包括邻近性和一致性来调整计数的影响时，风险比显着降低（图5）。即使在ER阴性患者中，调整邻近性和一致性后的计数风险比也没有显示与复发相关（1.18,95%CI [0.70,1.99];p = 0.53）。

 

鉴于计数和邻近度中等相关，我们还考虑了分层模型来评估计数和邻近之间的关系（图6）。在淋巴细胞计数低的受试者中，高接近度与改善结局相关 （p = 0.0002）。在淋巴细胞计数高的受试者中，高一致性仍然与提高生存率相关（p = 0.0005）。因此，接近性和一致性在预测复发方面具有超越淋巴细胞计数的独立价值。

 

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图6. Kaplan-Meier 生存曲线的邻近性和一致性，按高淋巴细胞计数和低淋巴细胞计数分层。

 

Kaplan-Meier 估计无复发生存期 （RFS），比较了 3 期卡罗莱纳州乳腺癌研究 （CBCS） 参与者的高与低接近性和一致性，并按高与低淋巴细胞计数分层，定义为高于中位数或低于中位数。95% 的置信范围由阴影区域给出。P 值 （p） 对应于曲线之间差异的对数秩检验。在淋巴细胞计数低的参与者中，高邻近度与低邻近度的 RFS 曲线差异更为显着。在淋巴细胞计数高的参与者中，高一致性与低一致性的 RFS 曲线差异更为显着。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.g006

 

基于组织微阵列的 TIL 空间评估与全玻片 TIL 分析的比较

为了将我们相对于既定生物学指标的免疫空间关系测量置于背景中，我们将邻近度和一致性测量值（根据 CBCS 的组织微阵列确定）与来自同一参与者幻灯片的一组空间 TIL 分数进行了比较。在幻灯片中，按照Fassler的描述，估计了更大规模的指标，包括TIL森林、TIL沙漠、瘤内强度和肿瘤周围强度[25]。值得注意的是，可以在直径为 1 mm 的组织微阵列核心中确定接近度和一致性，而针对森林和沙漠评估的整个载玻片图像由最长尺寸为 15-25 mm 的组织样本组成。在这个更大的尺度上，TIL 森林和沙漠评分分别涉及 TIL 的存在与否，肿瘤内强度和肿瘤周围强度分别描述肿瘤内部和外围的 TIL 水平。

 

接近度、一致性和淋巴细胞计数都与四张全玻片图像 TIL 评分相关（图 7）。我们观察到邻近度和瘤内强度之间的相关性最强（corr. = 0.60），但也观察到邻近度与肿瘤周围强度（corr. = 0.57）和TIL森林（corr. = 0.50）的关联，以及与TIL沙漠的负相关（corr. = -0.47）（图7）。由于与瘤内和瘤周强度呈抛物线关系，一致性的相关性较弱。当分数增加到 1 以上时，一致性就会增加。尽管如此，一致性与 TIL 森林 （corr. = 0.32） 相关，与 TIL 沙漠 （corr. = -0.36） 分数成反比，但比邻近度和淋巴细胞计数更弱。综上所述，这些分析表明，我们来自组织微阵列核心的小尺度空间指标反映了与预后相关的大规模 TIL 空间结构。我们进行了针对整张玻片图像 TIL 分数进行调整的灵敏度分析，虽然由于缺少整张玻片图像数据，这些分析功效不足，但我们观察到了相似的幅度关联（S5 表）。

 

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图7. 全玻片图像肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 评分的邻近度、一致性和计数分布的小提琴图。

 

描述 （a） 邻近度、（b） 一致性和 （c） log10 分布的小提琴图对于 Fassler 论文中给出的瘤内强度、瘤围强度、TIL 沙漠和 TIL 森林的分数计数 [25]。给出了斯皮尔曼相关系数 （ρ） 和系数显着性的 p 值。请注意，在所有参与者中，只有 288 名在 TIL 森林、沙漠、瘤内强度和瘤周强度方面进行了评分。斯皮尔曼相关系数的 95% 置信区间 （95% CI） 使用 Fisher 的 z 变换计算。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.g007

 

与基因表达生物标志物的关系

我们接下来假设免疫浸润的空间参数可以预测 RNA 中测量的分子特征。我们查询了免疫特征和基因组不稳定性特征。Hamilton及其同事2022年根据与TIL计数相关的基因表达确定了三种不同的免疫类别（AE、先天富集（IE）或免疫安静）[24]。如表3所示，与IE和Immune Quiet（参考）联合治疗相比，AE肿瘤具有高接近性、一致性和淋巴细胞计数，比值比为4.5（95%CI [3.0,7.1];p < 0.0001）、2.4（95% CI [1.8， 3.2];p < 0.0001），比值比为 6.0（95% CI [4.4， 8.4];p < 0.0001）。此外，AGI生物标志物的生物标志物（定义为高同源重组缺陷（high homologous rehongicectency （HRD）和/或TP53突变样特征;与NGI标志物相比）与先前工作中的适应性免疫类别相关[12]，并且与高淋巴细胞计数（OR 2.5;95% CI [1.9， 3.3];p < 0.0001），但与邻近性和一致性没有很强的相关性。在考虑基于RNA的免疫亚型的敏感性分析中，调整RNA免疫亚型后，邻近性和一致性的风险比基本不变（S6表和S7表）。

 

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表 3. 空间生物标志物与基因表达衍生免疫类别的列联表。

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.t003

 

讨论

虽然免疫反应在乳腺癌中的临床意义已经确定，但非三阴性亚型（即 ER 阳性）的重要性仍存在不确定性。免疫相关预后的最佳指标仍在争论中。我们的工作探索了肿瘤和肿瘤周围区域淋巴细胞的空间参数作为复发的预测因子。淋巴细胞的接近性和一致性是 ER+ 和 ER− 乳腺癌复发的重要决定因素，而淋巴细胞计数显示出较弱的关联，尤其是在 ER+ 之间。淋巴细胞计数在具有接近性和一致性的预后模型中没有提供独立的价值。ER+ 中邻近度相对值的一个可能解释与计数和邻近度之间的内在关系有关;当计数较高时，邻近性实际上也很高。然而，当淋巴细胞计数较低时，空间接近性很重要，并且与改善无复发生存期相关。这些数据表明，较低浓度、靶向良好的免疫反应可有效减缓进展。此外，一致性衡量肿瘤细胞之间CD8+ T细胞的均匀性水平以及免疫反应的核心间异质性。更均匀的免疫反应可能意味着 CD8+ T 细胞细胞毒性作用的效率更高。此外，邻近性和一致性都与从整张幻灯片图像中提取的其他空间 TIL 分数相关。两者还与基于RNA的AE基因表达有关。这些结果表明，CD8+ T细胞相对于肿瘤细胞的位置具有预后和生物学意义，并且敏感的空间参数对于表征肿瘤免疫微环境很重要。

 

我们的工作与先前的几项研究一致，这些研究表明，较高水平的CD8+ T细胞与TNBC的阳性预后相关[29,30]。大多数研究表明，CD8+ T细胞浸润对ER+受试者的获益有限或没有获益[31,32]。然而，先前的一项研究记录了基质和瘤内区域的CD8+ T细胞，并建立了瘤内T细胞与ER+/HER2−和ER−受试者的生存率之间的关联[33]另一项研究使用QuPath（本文使用的开源数字病理学软件）构建了一种机器学习算法，用于根据各个组织隔室中TIL的密度对HE图像进行评分[34]并证实了TIL在TNBC中的预后意义，但未评估ER+或ER−/HER2+乳腺癌的结局[34]这些研究均未关注空间接近性和一致性，反映了先前文献强调CD8+ T细胞计数的普遍趋势。

 

最近的两项研究考虑了CD8+ T细胞的空间参数[13,14]。一项研究发现，乳腺癌肿瘤20μm以内的CD8+ T细胞密度可预测新辅助治疗的病理完全缓解和无病生存期[14]。然而，他们的方法仍然强调细胞密度（尽管在规定的范围内），而不是使用距离来测量空间差异。此外，他们在按癌症亚型分层时没有考虑生存差异。另一项研究考虑了CD8+ T细胞与胰腺导管腺癌细胞的接近性，并观察到当CD8+ T细胞更接近粘连斑激酶（FAK）肿瘤细胞时，总生存期更长[13]。先前文献中与 ER+ 疾病相关的不一致可能反映了未测量的参数或与未知指标相关的因素的测量;我们的数据表明，接近性和一致性是两个合理的潜在参数。为了使CD8+ T细胞诱导细胞毒性反应，它们必须与肿瘤细胞直接接触[20]，因此基于距离的方法在自然量化CD8+ T细胞和肿瘤细胞之间的相互作用方面具有理论优势。+

 

我们的工作还应结合HE图像中TIL的自动空间表征方法来考虑[25,34\u201236]Abousamra及其同事使用卷积神经网络，通过将平铺图像补丁分类为TIL阳性或阴性（基于检测到的至少2个淋巴细胞）来创建整个幻灯片图像TIL图[36] 这些模型在使用复杂的深度学习模型方面具有优势。然而，对图像图块进行分类可能会遗漏肿瘤免疫微环境中的细粒度变化，并导致邻近性错误分类。我们使用简单的基于距离的方法简化了整玻片图像的可扩展性，并且非常适合通常用于大型队列的组织微阵列。此外，组织微阵列水平淋巴细胞浸润的接近性和一致性与整个载玻片水平的 TIL 瘤内强度和瘤周强度的测量值相关。这表明应用于组织微阵列的空间指标可以预测肿瘤内的大规模空间免疫结构。

 

我们分析的一个优势是能够将 IF 图像中的空间指标与来自同一标本的批量基因表达数据进行比较。基因表达衍生的免疫簇[24]与空间生物标志物之间的联系表明，CD8+ T细胞在肿瘤免疫微环境中发挥作用，反映了免疫细胞的更广泛模式。然而，我们无法完全探究多种免疫标志物与空间排列之间的关系。接近性和一致性可能受到与其他淋巴细胞类型相互作用的影响，之前的一些研究表明，调节性 T 细胞的增加可能会损害 CD8+ T 细胞的活性。此外，我们观察到基于TP53和HRD [12]的基因组不稳定性不能预测免疫细胞的接近性和一致性，而淋巴细胞计数与基因组不稳定性相关。这可能反映了新抗原产生与非常强大的免疫反应之间的关系。然而，我们缺乏数据来专门询问新抗原作为计数与空间免疫原性模式的介质。我们分析的一个局限性是，我们没有在整个载玻片的更大区域上验证我们的 IF 测量值，但是，我们发现接近性和一致性与整个载玻片免疫特征相关，这是有希望的。最后，虽然IF使我们能够区分淋巴细胞类型，但我们研究了CD8+ T细胞，而忽略了免疫细胞类型之间的其他空间相互作用。然而，鉴于 CD8 在细胞毒性免疫反应中的既定作用，CD8 是一种优先标志物。

 

总之，我们的分析表明淋巴细胞（特别是 CD8+ T 细胞）位置具有预后价值。如果得到验证，邻近性和一致性可能会识别受益于免疫治疗的 ER 阳性乳腺癌，从而扩大治疗选择以包括多达 75% 的 ER+ 肿瘤（即该数据集中显示高邻近的癌症比例）。多重 IF 染色的成本效益和效率越来越高，可以在临床环境中实施 [18]。因此，未来的临床研究可能能够利用多重IF衍生的空间免疫标志物的接近性和一致性来预测对免疫治疗的反应。如果经过验证，HE 派生的距离指标也有可能有用。鉴于 ER+ 肿瘤占乳腺肿瘤的大多数，更仔细地评估免疫反应以确定可能的受益者具有很大的影响。

 

支持信息

质量控制流程图。

 

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S1 图。 质量控制流程图。

图显示了由于质量控制失败而被排除在分析之外的参与者人数。此外，还显示了各种分析中包括的参与者人数以及可用的 WSI 图像和基因表达衍生分类。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s001

 

（巴布亚新几内亚）

 

S2 图。 总体参与者的计数、邻近性和一致性的风险比的森林图，并在包括双阳性细胞以计算邻近性和一致性时按 ER 状态分层。

结合 CD8+ /FoxP3− 和 CD8+/FoxP3+ 淋巴细胞的无复发生存期的风险比，以计算接近性和一致性。显示了接近度、一致性和淋巴细胞计数的风险比（菱形）和 95% 置信区间（线），在中位数（高作为参考对象）、总体和按 ER 状态分层。估计值未经调整（蓝色），根据淋巴细胞计数（红色）进行了调整，并在相关的情况下针对接近性和一致性（黑色）进行了调整。参考类别 （Ref.） 被定义为高计数、高邻近性和高一致性。每组给出了组规模 （N） 和经历复发的参与者人数（事件）。HR：风险比;95% CI：95% 置信区间。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s002

 

（巴布亚新几内亚）

 

S1 表。 用于细胞检测和分类的调谐参数。

QuPath函数中使用的细胞检测和细胞分类阈值的调优参数表。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s003

 

（DOCX）

 

S2 表。 灵敏度分析，以优化计数、邻近度和一致性训练和测试集的切割点。

优化高计数与低计数、接近度和一致性的切割点的结果。我们根据 2/3 到 1/3 的训练和测试拆分对数据进行拆分。此外，我们对复发数据使用分层抽样，以确保训练和测试集中有足够数量的复发参与者。我们根据数据的分位数找到一个最佳切点，该分位数最小化了对数秩检验的 p 值。尽管切割点在训练集上似乎表现良好，但在大多数情况下，基于测试数据中非常不同的风险比，似乎存在过度拟合。此外，许多在训练数据中具有统计学意义的结果在测试数据中不再具有统计学意义。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s004

 

（DOCX）

 

S3 表。 空间指标的相关矩阵。

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s005

 

（DOCX）

 

S4 表。 嵌套多变量 Cox 比例风险模型的似然比检验摘要。

多变量 Cox 比例风险模型的摘要，其中包含所有参与者的邻近度、一致性和淋巴细胞计数二元协变量。提供了协变量调整后的风险比的估计值，以及风险比显著性的 p 值。使用似然比检验比较具有嵌套协变量的模型，并提供比较的嵌套模型之间差异显著性的 p 值。每个协变量的参考组分别为高邻近度、高一致性和高淋巴细胞计数。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s006

 

（DOCX）

 

S5 表。 具有 WSI TIL 分数的 Cox 比例风险模型。

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s007

 

（DOCX）

 

S6 表。 具有基于 RNA 的免疫类别的 Cox 比例风险模型。

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s008

 

（DOCX）

 

S7 表。 具有 CD8 T 细胞特征的 Cox 比例风险模型。

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s009

 

（DOCX）

 

S1 清单。 备注清单。

生物标志物报告指南清单 [21] 提供涉及每个项目的章节和段落编号。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pmed.1004647.s010

 

（DOCX）

 

确认

作者要感谢北卡罗来纳大学生物样本处理设施的样本处理、储存和样本支付 （http://bsp.web.unc.edu/）。我们感谢 CBCS 参与者和研究人员。本出版物中的调查结果和结论是作者的，并不一定代表北卡罗来纳州卫生与公众服务部公共卫生司的观点。本文件中包含的观点和结论是作者的观点和结论，不应被解释为代表美国政府明示或暗示的官方政策。

 

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