厦门免费医学论文 发表-平滑肌钙调磷酸酶的非磷酸酶依赖性活性协调导致高血压的基因表达程序

Paula Sofía Yunes-Leites ，孙一林 ，萨拉·马丁内斯-马丁内斯，阿尔瓦罗·阿尔法亚特，玛尔塔·托拉尔， 抽象 血管紧张素 II （Ang-II） 通过尚不完全清楚的机制驱动高血压和腹主动脉瘤 （AAA） 的病理性血管壁重塑。既往研究表明，钙调磷酸酶 （Cn） 的磷酸酶活性介导 Ang-II 诱导的 AAA，但参与 Cn 在 AAA 形成中的作用的细胞类型仍然未知。在这里，通过使用新创建的平滑肌细胞 （SMC） 特异性和内皮细胞 （EC） 特异性 Cn 缺陷小鼠 （SM-Cn−/−和 EC-CN−/−小鼠），我们表明 Cn 在 SMC 中表达，而不是 EC，是 Ang-II 诱导的 AAA 所必需的。出乎意料的是，SMC Cn 在 Ang-II 诱导的高血压的早期发作和维持中也发挥了结构作用，与其已知的磷酸酶活性无关。在 Ang-II 激活的信号通路中，Cn 信号在 SMC 中是必不可少的，因为主动脉中受 Ang-II 调节的近 90% 的基因需要在 SMC 中表达。Cn 独立于其酶活性，编排了 Ang-II 诱导与 SMC 收缩性和高血压密切相关的转录程序。SMCs 中的 Cn 缺失，但不是其药理学抑制，损害了动脉收缩力的调节。在 Ang-II 调控需要 Cn 表达而不是其磷酸酶活性的基因中，我们发现 Serpine1 对 Ang-II 诱导的高血压至关重要。事实上，PAI-1（Serpine1 编码的蛋白质）的药理学抑制损害了 SMC 的收缩力和容易消退的高血压。从机制上讲，Serpine1 诱导是由 Smad2 通过 Cn 的结构作用激活介导的。这些发现揭示了 Cn 在血管病理生理学中的意想不到的作用，并突出了 PAI-1 作为高血压的潜在治疗靶点。 数字 图 7图8图 1图 2图 3图 4图5图 6图 7图8图 1图 2图 3 引文： Yunes-Leites PS， Sun Y， Martínez-Martínez S， Alfayate Á， Toral M， Méndez-Olivares MJ， et al. （2025） 平滑肌钙调磷酸酶的非磷酸酶依赖性活性协调导致高血压的基因表达程序。公共科学图书馆生物学23（5）： e3003163. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163 学术编辑： Rebecca Haeusler，美国哥伦比亚大学 收到： 2024 年 12 月 21 日;接受： 2025 年 4 月 15 日;发表： 5月 14， 2025 版权所有： © 2025 Yunes-Leites et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。 数据可用性： 基因表达数据可在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/ 的 Accession Number GSE255061下获得。所有其他相关数据都在论文及其支持信息文件中。 资金： 导致这些结果的项目已获得“La Caixa”银行基金会的资助，项目代码为 LCF/PR/HR22/52420019（至 J.V.）;西班牙科学和创新部向 M.R.C 授予 PID2020-115217RB-I00 和 PID2023-152367OB-I00，向 J.M.R. 授予 PID2021-122388OB-I00，由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助;卡洛斯三世健康研究所（CIBER-CV CB16/11/00264 和 CB16/11/00277 分别致 J.M.R. 和 J.V.）;Fundacio La Marato TV3（20151330 和 202334-31 至 JMR）;马德里委员会向 J.V. 提供 S2022/BMD-7333-CM （INMUNOVAR-CM），由“欧盟下一代欧盟/PRTR”支持;西班牙科学和创新部长向 J.V. 提供 PLEC2022-009298、PLEC2022-009235 和 EQC2021-007053-P 拨款，由 MICIU/AEI/10.13039/501100011033 资助，“ERDF A way of making Europe”;西班牙科学与创新部长 Tematicas_RED2024-154025-T 至 M.R.C. 和 J.M.R.;西班牙科学和创新部将 FPI （BES-2016-076637） 合同给 P.S.Y.-L.，FPI （PRE2019-087460） 合同给 S.M.-G.，Juan de la Cierva （IJC2020-044581-I） 合同给 M.T.，以及 Instituto de Salud Carlos III 与 M.T. 签订合同 Sara Borrell （CD18/00028） 给 M.T.。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。 利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。 缩写： 机 管 局 主动脉瘤;AAA、 腹主动脉瘤;阿布奥， 腹主动脉;Ang-II， 血管紧张素 II;BP， 血压;快递 之 家 钙调磷酸酶;环孢素 / 环孢菌素 A;DEGs， 差异表达基因;挖 地高辛;电子商务 内皮细胞;ECM / 细胞外基质;EVG、 弹性 Verhoeff–Van Gieson;FC、 折叠变化;去 基因本体论;他 苏木精和伊红;HFD / 高脂肪饮食;房 协 高血压评分;低压 慢病毒;mAECs， 小鼠主动脉内皮细胞;MRA， 肠系膜阻力动脉;东北， 去甲肾上腺素;PAI-1， 纤溶酶原激活物抑制剂 1 型;PBS， 磷酸盐缓冲盐水;PFA， 多聚甲醛;qPCR， 定量实时 PCR;RM、 重复测量;投资回报率， 感兴趣区域;SMC， 平滑肌细胞;特克斯， 他莫昔芬;VSMCs， 血管平滑肌细胞;VWR， 血管壁重塑 介绍 动脉是由三个不同的层组成的复杂结构——内膜、中层和外膜——每层都发挥着独特的生理作用。内膜是单层内皮细胞 （EC），而外膜是各种细胞类型和细胞外基质 （ECM） 成分的复合体。该介质由多层 ECM 和血管平滑肌细胞 （VSMC） 组成，其收缩能力为血管的整体收缩性提供了基础。然而，血流动力学力量或分子信号通路的变化会导致病理性血管壁重塑 （VWR），导致动脉壁不稳定，并可能导致主动脉瘤 （AA） 或动脉高血压等结果。 AA 是主动脉壁进行性和异常的扩大和弱化，最终可导致主动脉夹层或破裂，占工业化国家所有死亡人数的 1%-2%。在夹层或破裂之前，AA 通常在临床上是无症状的，因此显然需要改进技术以进行早期诊断。AA 的主要特征包括 VSMC 增殖、迁移和凋亡的上调，以及这些细胞中与静止和收缩相关的基因的抑制 [1]。 高血压是最常见的慢性疾病之一，影响着全球超过 10 亿人。高血压被认为是多器官结局，只有 5% 的患者确定了根本原因 [2]。血压由动脉的收缩状态决定，而动脉的收缩状态可因多种VSMC介导的过程而失调，包括增生、增生和收缩力增加[3,4]。 VWR 由血管紧张素 II （Ang-II） 触发，血管紧张素 II 是肾素-血管紧张素系统的关键效应子。在腹主动脉瘤 （AAA） 中，Ang-II 激活促有丝分裂和促凋亡途径，增加 ECM 沉积，并诱导细胞迁移和炎症 [5,6]。虽然 Ang-II 在 VWR 中的重要性被广泛接受，但潜在的分子机制尚不完全清楚。Ang-II 通过与 1 型受体 （AT1R） 结合来发挥其病理作用，AT1R 激活多种信号通路，包括由胞质增加 [Ca 介导的2+]，PKC 依赖性酪氨酸激酶级联反应的激活，NADPH 依赖性 ROS 的产生，以及 JAK/STAT、AKT 和 MAPK 激酶的激活 [6]。 由胞质 [Ca2+] 是普遍表达的 Ca2+/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙调磷酸酶 （Cn）。Cn 由一个催化亚基 （CnA） 和一个调节亚基 （CnB） 组成，通过介导 Ang-II 诱导的 VSMC 迁移 [7] 和衰老 [8]，调节内皮一氧化氮合酶活性和内皮屏障功能 [9,10]，以及介导成纤维细胞迁移和胶原蛋白分泌，在病理性 VWR 的发展中发挥关键作用 [11]].环孢素 A （CsA） 抑制 Cn 活性会减少 Ang-II 触发的新内膜形成和 AAA 发展，这也受到 Cn 阻断肽慢病毒表达的抑制 [7,12]。尽管 Cn 在病理性 VWR 中很重要，但缺乏关于在不同血管细胞类型中表达的 Cn 对血管疾病发展的相对贡献的认识。 结果 平滑肌 Cn 是 AAA 形成所必需的 为了研究 EC 表达和 VSMC 表达的 Cn 对病理 VWR 的选择性贡献，我们生成了在 ECs 或平滑肌细胞 （SMC） 中条件缺乏 Cn 的他莫昔芬 （Tx） 诱导的敲除小鼠。催化亚基 CnA 由 3 个基因 （Ppp3ca、Ppp3cb 和 Ppp3cc） 编码，调节亚基 CnB 由 2 个基因 （Ppp3r1 和 Ppp3r2） 编码。CnB2 亚基仅在睾丸中表达，而 CnB1 普遍表达，对于维持 Cn 活性是必不可少的 [13]。CnA 和 CnB 是专性异二聚体，因此如果 CnB 缺失，CnA 就会变得不稳定并降解 [14]。因此，我们杂交了 LoxP 侧翼的 Ppp3r1 （Cnb1f/f）小鼠[15]，小鼠表达Tx诱导型Cre重组酶（CreERT2），特别是在 EC （Cdh5-CreERT2) [16] 或 SMC （Myh11-CreERT2) [17]，获得 Cnb1f/f;Cdh5-CreERT2小鼠 （EC-Cnf/f） 或 Cnb1f/f;MYH11-CRERT2小鼠 （SM-Cnf/f） 分别。CNB1f/f-克雷ERT2-neg与 Cnb1 一起重量/重量;Cdh5-CreERT2或 Cnb1重量/重量;MYH11-CRERT2，用作 Cnb1 的对照 （Cn-Ctl）f/f;Cdh5-CreERT2或 Cnb1f/f;MYH11-CRERT2分别。Tx 处理诱导 ECs 中特异性 Cnb1 缺失 （EC-Cn−/−小鼠）或 SMC （SM-Cn−/−小鼠），通过 EC-Cn 小鼠主动脉内皮细胞 （mAEC） 中 CnB 表达的免疫印迹分析证实−/−小鼠（图 1A 和 1B）或 SM-Cn 的主动脉提取物−/−小鼠（图 1C 和 1D）。在体内已证明，在没有调节亚基 CnB 的情况下，催化亚基 CnA 会不稳定 [14,18]。正如预期的那样，Cnb1 缺失导致 CnA 蛋白表达下降（图 1A-1D）。值得注意的是，基线测量表明 ECs 或 SMC 中的 Cn 缺乏对血压 （BP）、主动脉直径或主动脉组织组织没有显着影响（图 1E-1I）。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint 幻灯片 PNG放大图片 国际电影节原始图像 图 1. 条件性钙调磷酸酶 （Cn） 缺失在血管紧张素 II （Ang-II） 不存在时不引起明显症状。 (A） 小鼠主动脉内皮细胞 （mAEC） 和血管平滑肌细胞 （VSMC） 中 CnA、CnB、CD31、α-SMA 和微管蛋白（上样对照）的代表性免疫印迹分析，以及 （B） 它们在 n = 3-4 个细胞批次的蛋白质提取物中的相对表达的定量。标明分子量 （kDa）。每个数据点表示一个单独的实验，直方图中的数据表示为 s.e.m. ±平均值。使用 Tukey 事后检验的单因素方差分析;p < 0.0001，***p < 0.001，**p < 0.01，ns，不显著。（C） n = 10–16 Cn-Ctl 和 n = 8–10 SM-Cn 的总主动脉提取物中 CnA、CnB 和微管蛋白（上样对照）的代表性免疫印迹分析−/−小鼠，以及 （D） 它们在蛋白质提取物中的相对表达的定量。标明分子量 （kDa）。每个数据点表示一只单独的小鼠，直方图中的数据表示为平均值 ± s.e.m. 未配对学生 t 检验;p < 0.0001。（E） 收缩压 （BP）、（F） 舒张压、（G） 腹主动脉 （AbAo） 和 （H） AsAo 直径，单位为 Cn-Ctl、SM-Cn−/−和 EC-CN−/−小 鼠。每个数据点表示一个单独的鼠标，水平条表示平均值（长条）和 s.e.m。每组的小鼠数量在每个面板中指示。（I） 来自指定小鼠的苏木精-伊红染色的 AbAo 和 AsAo 横截面的代表性图像（每个基因型 n = 5 只小鼠）。比例尺，250 μm。可以在 S1 数据中找到基础数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.g001 为了评估 EC 表达和 SMC 表达的 Cn 对 AAA 的贡献，我们使用了小鼠模型 [19]，该模型涉及在饲喂高脂饮食 （HFD） 的小鼠中输注 4 周的血管紧张素 II （Ang-II） 12 周（图 2A）。在 Cn-Ctl 小鼠中，Ang-II 治疗诱导明显的腹主动脉 （AbAo） 扩张（图 2B-2E），而不改变主动脉组织中 CnA 或 CnB 的表达（S1A 和 S1B 图）。虽然 Ang-II 诱导的 AbAo 扩张不受 EC 中 Cn 缺失的影响，但它被 SMC 中的 Cn 缺失所消除（图 2B-2E）。ECs 或 SMCs 中的 Cn 缺失并不能防止这些小鼠的 HFD 诱导的肥胖（S2 图）。AbAo 横截面的离体图像和组织学分析显示 AbAo 重塑，其特征是在 Ang-II 处理的 Cn-Ctl 和 EC-Cn 中以壁厚增加、胶原沉积和弹性纤维杂乱为特征−/−SM-Cn 的 AbAo 中不存在的小鼠−/−小鼠（图 2E-2H）。此外，SM-Cn 的内层 α-SMA 水平显著升高−/−小鼠与 Cn-Ctl 和 EC-Cn 的比较−/−Ang-II 输注后的小鼠（S3A 和 S3B 图）。此外，Cn-Ctl 和 EC-Cn AbAo 中的增殖标志物 （Ki67） 和炎性细胞浸润标志物显著增加−/−小鼠，但不在 SM-Cn 中−/−小鼠（S3 C-S3F 图）。这些发现表明，SMC 表达的 Cn，而不是 EC 表达的 Cn，在 Ang-II 诱导的 AbAo 壁重塑和 AAA 形成中起关键作用。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint 幻灯片 PNG放大图片 国际电影节原始图像 图 2. 平滑肌细胞 （SMC） 钙调磷酸酶 （Cn） 是血管紧张素 II （Ang-II） 诱导的腹主动脉瘤形成所必需的。 (A） 实验设计：在高脂饮食 （HFD） 喂养的第一周，10-12 周龄小鼠连续 5 天用他莫昔芬治疗（空心箭头）。HFD 12 周后，植入 Ang-II 渗透微型泵 4 周;对照小鼠在没有植入 Minipump 的情况下进行手术。在指定的时间点 （紫色箭头） 测量最大主动脉直径和血压 （Eco-BP），并在实验结束时对小鼠实施安乐死。（B） Ang-II 处理 4 周前后小鼠 AbAo 的代表性超声图像。黄线标记管腔边界。比例尺，1 毫米 （C， D） AbAo 直径，（C） 7 Cn-Ctl 和 8 EC-Cn−/−对照处理的小鼠和 16 个 Cn-CTL 和 10 个 EC-Cn−/−Ang-II 处理，以及 （D） 8 Cn-Ctl 和 6 SM-Cn−/−对照处理的小鼠和 18 Cn-CTL 和 16 SM-Cn−/−Ang-II 处理的小鼠。每个数据点表示一只单独的鼠标，水平条表示平均值（长条）和 s.e.m. ****p < 0.0001， ***p < 0.001;重复测量 （RM） 双向方差分析与 Tukey 事后检验。红叉 （†） 表示在实验完成前死亡并表现出动脉瘤破裂的小鼠。（E） 如图所示处理小鼠的主动脉的代表性图像。比例尺，1 mm。（F） 苏木精-伊红 （HE）、Masson 三色 （Masson） 和 Van Gieson （VG） 染色在 4 Cn-Ctl、3 EC-Cn 的 AbAo 切片上的代表性图像−/−和 4 个 SM-CN−/−小 鼠。比例尺，100 μm。（G） 7 Cn-Ctl 和 7 EC-Cn 的 AbAo 切片中侧面积−/−对照处理的小鼠和 16 个 Cn-CTL 和 7 个 EC-Cn−/−Ang-II 处理的小鼠和 （H） 7 Cn-Ctl 和 5 SM-Cn−/−对照处理的小鼠和 9 只 Cn-Ctl 和 9 只 SM-Cn−/−Ang-II 处理的小鼠。每个数据点表示一只单独的小鼠，直方图中的数据表示为平均值 ± s.e.m. ***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05，ns，不显著;使用 Šídák 事后检验的双因子方差分析。可以在 S1 数据中找到基础数据。如S1数据所示，在C组和D以及G组和H中重复来自未处理和Ang-II处理的Cn-Ctl小鼠亚群的数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.g002 SMC Cn 是 Ang-II 诱导的高血压所必需的 Ang-II 诱导小鼠血管收缩和高血压，因此我们研究了 Cn 缺乏是否影响用于图 2 所示实验的同一只小鼠的 Ang-II 诱导的高血压。虽然 cn-ctl 和 ec-cn−/−小鼠在用 Ang-II、SM-Cn 治疗 1 周后，收缩压和舒张压急剧而持续地增加−/−小鼠保持正常血压（图 3）。这些结果强烈表明 SMC Cn 是 Ang-II 诱导的高血压的关键介质。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint 幻灯片 PNG放大图片 国际电影节原始图像 图 3. 平滑肌细胞 （SMC） 中的钙调磷酸酶 （Cn） 缺失可预防饲喂高脂饮食 （HFD） 小鼠血管紧张素 II （Ang-II） 驱动的动脉高血压。 在小鼠中测量血压 （BP），如图 2 所示。（A） 7 Cn-Ctl 和 8 EC-Cn 中指定时间的收缩压和 （B） 舒张压值−/− 对照处理的小鼠和 16 个 Cn-CTL 和 10 个 EC-Cn−/−Ang-II 处理的小鼠（左图）和 8 只 Cn-CTL 和 6 只 SM-Cn−/−对照处理的小鼠和 18 Cn-CTL 和 16 SM-Cn−/−Ang-II 处理的小鼠（右图）。红叉 （†） 表示 EC-CN−/−在实验完成前死亡并表现出动脉瘤破裂的小鼠。数据表示为均值± s.e.m. ****p < 0.0001，*p < 0.05 vs. EC-CN−/−Ang-II 或与 SM-Cn−/−Ang-II，p < 0.0001，p < 0.001，p < 0.01，p < 0.05 vs. Cn-Ctl 对照，以及（A，右）p < 0.05 vs. SM-Cn ###########−/−对照，NS，无意义;RM 双向方差分析与 Tukey 事后检验。可以在 S1 数据中找到基础数据。如图 A 和图 B 的左右面板所示，来自未处理和 Ang-II 处理的 Cn-Ctl 小鼠子集的数据在图 A 和左侧面板重复。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.g003 在兔子中，高胆固醇饮食会改变主动脉中的 Ang-II 信号传导 [20]。因此，为了排除 HFD 喂养对 SMC Cn 调节血压的可能继发性影响，我们研究了血管 Cn 对喂养食物饮食的小鼠 Ang-II 诱导的高血压的贡献。在 Tx 处理的小鼠中输注 Ang-II（图 4A）可显着增加 Cn-Ctl 和 EC-Cn 的血压−/−治疗第一周但 SM-Cn 血压未显著提高的小鼠−/−小鼠（图 4B、4C 和 S4）。同样，Ang-II 诱导 Cn-Ctl 和 EC-Cn 中的 AbAo 扩张−/−小鼠从治疗的第一周开始，但在 SM-Cn 中没有这种效果−/−小鼠（图 4D 和 4E）。这些结果支持 SMC Cn 在 Ang-II 诱导的高血压和 AbAo 扩张中的关键作用。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint 幻灯片 PNG放大图片 国际电影节原始图像 图 4. 平滑肌细胞 （SMC） 钙调磷酸酶 （Cn） 介导血管紧张素 II （Ang-II） 诱导的高血压，与其磷酸酶活性无关。 （A） 实验设计：10-12 周龄小鼠连续 5 天用他莫昔芬治疗（开箭头），6 周后，在一组小鼠中植入 Ang-II 渗透微型泵 4 周;对照小鼠在没有植入 Minipump 的情况下进行手术。在指定的时间点 （紫色箭头） 测量最大主动脉直径和血压 （BP） （Eco-BP），并在实验结束时对小鼠实施安乐死。（二、三）指定时间收缩压和 （D， E） 最大腹主动脉 （AbAo） 直径，单位为 5 Cn-Ctl，3 EC-Cn−/−和 5 个 SM-CN−/−对照处理的小鼠和 22 Cn-Ctl、10 EC-Cn−/−和 18 个 SM-CN−/−Ang-II 处理的小鼠。数据以平均值表示± s.e.m. ****p < 0.0001，***p < 0.001，**p < 0.01 与 SM-CN−/−Ang-II，p < 0.0001 vs. Cn-Ctl 对照，p < 0.05 vs. SM-Cn #####−/−或 Cn-Ctl 控制;RM 双向方差分析与 Tukey 事后检验。（F） 实验设计：10-12 周龄小鼠配备环孢菌素 A （CsA） 渗透微型泵;对照小鼠在没有植入 Minipump 的情况下进行手术。48 小时后，将 Ang-II 微型泵植入一组 CsA 处理的小鼠 （CsA + Ang-II） 和一组 CsA 对照小鼠 （Ang-II） 中。其余的 CsA 对照小鼠在没有微型泵植入的情况下进行手术 （Control）。在指定时间点 （紫色箭头） 测量最大主动脉直径和血压 （Eco-BP），并在实验结束时对小鼠实施安乐死。（G） 8 只对照小鼠、10 只 Ang-II-小鼠、4 只 CsA 小鼠和 8 只 CsA + Ang-II 处理的小鼠在指定时间的收缩压和 （H） 最大 AbAo 直径。数据表示为平均值± s.e.m. ***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05 vs. CsA + Ang-II，p < 0.0001，p < 0.001 vs. 对照，p < 0.0001 vs. CsA; RM 双向方差分析与 Tukey 事后检验。可以在 S1 数据中找到基础数据。来自未处理和 Ang-II 处理的 Cn-Ctl 小鼠的数据在图 B 和 C 以及图 D 和 E 中重复，如所示 S1 数据。#######$$$$ https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.g004 为了研究 SMCs 中的 Cn 缺失是否也赋予了对其他因素诱导的高血压的抵抗力，我们用去甲肾上腺素 （NE） 或一氧化氮合酶抑制剂 L-NAME 处理小鼠 （S5A 图）。相对于类似处理的 SM-Cn，NE 和 L-NAME 均显着增加 Cn-Ctl 小鼠的血压−/−小鼠和未处理的对照（S5B 图）。这些结果表明，SMC 表达的 Cn 是响应各种高血压刺激的 BP 的重要调节因子。 Ang-II 诱导的高血压不需要 Cn 磷酸酶活性 Cn 在血压调节中的主要作用是出乎意料的，因为抑制 Cn 活性并不能预防 Ang-II 诱导的小鼠高血压 [21]，而且 Cn 抑制剂患者长期治疗会导致高血压，这可能是肾毒性的结果 [22]。许多因素可以解释这种差异，包括 Cn 对人类和小鼠 BP 调节的不同贡献、Cn 抑制剂的脱靶效应，或者药理学抑制与蛋白质缺失的不同作用。用 Cn 抑制剂 CsA 预处理小鼠不能预防 WT 小鼠 Ang-II 诱导的高血压（图 4F 和 4G）;相比之下，CsA 预处理确实阻断了 Ang-II 诱导的这些小鼠的 AbAo 扩张（图 4H）。这一结果证实了有效的磷酸酶抑制作用，并且与之前的报告一致，该报告显示 CsA 可防止 AbAo 扩张和 AAA [7]。NFATc3 是一种已知的 Cn 底物，在 CsA 处理的小鼠的胸腺中被过度磷酸化（S6A 图），证明 CsA 对 Cn 磷酸酶活性具有有效的全身抑制作用（S6A 图）。与之前的报道 [21] 一致，CsA 预处理显着降低了这些小鼠 Ang-II 诱导的心脏肥大（S6B 和 S6C 图）。总之，这些数据表明 CsA 不能预防 Ang-II 诱导的高血压，因此表明 Cn 对 Ang-II 诱导的高血压的贡献与其磷酸酶活性无关。 为了确认 Cn 磷酸酶活性不参与 Ang-II 诱导的高血压，我们通过用编码与 GFP 融合的 LxVP 肽 （LV-LxVP） 的慢病毒 （LV） 接种 WT 小鼠来抑制体内 Cn 活性。与 CsA 一样，LxVP 肽会阻断 Cn 与其底物的结合，从而抑制其活性 [23]。接种 LV 后 6 周，将 Ang-II 给予接种 LV-LxVP 或编码失活突变版本 （LV-LxVPmut） 的 LV 的小鼠，并确定血压（图 5A）。用 LV-LxVPmut 或 LV-LxVP 转导的小鼠的收缩压和舒张压 Ang-II 显着增加，治疗组之间没有显着差异（图 5B）。通过主动脉切片的 GFP 免疫染色证实了所有主动脉层的有效转导（图 5C）。为了评估 LV-LxVP 是否有效地阻断了这些小鼠中 Ang-II 对 Cn/NFAT 的激活，我们分析了 NFAT 蛋白的亚细胞定位和 DNA 结合活性。NFAT 被 Cn 去磷酸化并以活性形式转位到细胞核以结合靶基因启动子。原位西南组织化学在表达 LV-LxVPmut 的 Ang-II 处理的小鼠的内侧 AbAo 和 AsAo 切片的细胞核中检测到丰富的活性 NFAT，但在 LV-LxVP 转导动物的切片中几乎没有检测到核 NFAT 信号（图 5D 和 5E）。这些数据进一步支持 SMC Cn 独立于其磷酸酶活性介导 Ang-II 诱导的高血压的观点。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint 幻灯片 PNG放大图片 国际电影节原始图像 图 5. LxVP 慢病毒转导对钙调磷酸酶 （Cn） 的抑制会损害体内 NFAT 活化，而不会预防 Ang-II 诱导的高血压。 (A） 实验设计：10-12 周龄小鼠接种 LxVPmut 或 LxVP 编码慢病毒 （LV），6 周后，植入 Ang-II 渗透微型泵 4 周。在指定的时间点 （紫色箭头） 测量血压，并在实验结束时对小鼠实施安乐死。（B） 用 LV-LxVPmut （n = 7） 和 LV-LxVP （n = 7） 转导的小鼠的收缩压和舒张压，显示为平均值 ± SEM ****p < 0.0001，***p < 0.001，**p < 0.01，*p < 0.05 和 p < 0.001，p < 0.01 与治疗开始（0 周）相比，分别为 LV-LxVPmut 和 LV-LxVP 转导的小鼠; RM 双向方差分析与 Tukey 事后检验。（C） 来自指定小鼠的 AbAo 和 AsAo 横截面中 GFP 免疫染色的代表性图像。（D） 使用来自指定小鼠的 AbAo 和 AsAo 横截面的 NFAT 探针的西南组织化学的代表性图像，以及 （E） AbAo（左图）和 AsAo（右图）中相对染色（NFAT 活性）的定量。虚线表示内层。仅包括主动脉 GFP 染色阳性且 NFAT 活性一致的小鼠。每个数据点表示一只单独的小鼠，直方图中的数据表示为 s.e.m. Mann-Whitney 检验 **p ±平均值 0.01 <。比例尺，100 μm。可以在 S1 数据中找到基础数据。##### https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.g005 SMC Cn 是 Ang-II 诱导的高血压的早期发作和长期可持续性所必需的 为了研究平滑肌 Cn 是否仅需要长期维持 Ang-II 诱导的高血压或其发作，我们测量了 Cn-Ctl 和 SM-Cn 中的血压−/−Ang-II 输注后早期的小鼠（图 6A）。早在 Ang-II 输注后 2 小时，Cn-Ctl 小鼠就观察到血压强劲增加，并在 24 小时后维持，而 SM-Cn−/−小鼠保持正常血压 （图 6B 和 S7A）。在平行研究中，WT 小鼠在 Ang-II 输注前用 CsA 处理 5 天（图 6C）。与 CsA 长期实验的结果一致（图 4F 和 4G），CsA 预处理在 2 或 24 小时后未能预防 Ang-II 诱导的高血压（图 6D 和 S7B）。胸腺中的 NFAT 磷酸化状态和主动脉 Rcan1-4 mRNA 表达的抑制证实了 CsA 处理小鼠中 Cn 磷酸酶活性的有效抑制（S7C 和 S7D 图）。这些结果强烈表明，Ang-II 激活了对 BP 早期升高至关重要的分子机制，这些机制需要在 SMC 中表达 Cn，但不需要其磷酸酶活性。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint 幻灯片 PNG放大图片 TIFForiginal image Fig 6. Smooth muscle cell (SMC) calcineurin (Cn) is required for both the onset and the long-term sustainability of Ang-II-induced hypertension. (A） 实验设计：10-12 周龄小鼠连续 5 天用他莫昔芬治疗（开放箭头），6 周后，植入 Ang-II 渗透微型泵 2 小时和 24 小时。在指定的时间点（紫色箭头）测量血压，并对小鼠实施安乐死并在需要时进行分析。（B） 指定小鼠的收缩压值（n = 每组和时间点 9 只小鼠）。每个数据点表示一只单独的鼠标，水平条表示平均值（长条）和 s.e.m. ****p < 0.0001 与基线的关系;使用 Tukey 事后检验的 RM 双向方差分析。p < 0.0001 与 2 或 24 小时 Ang-II Cn-Ctl;使用 Šídák 事后检验的 RM 双向方差分析。（C） 实验设计：10-12 周龄小鼠配备 CsA 渗透微型泵（CsA 预处理）;对照小鼠在没有植入 Minipump 的情况下进行手术 （Control）。5 天后，将 Ang-II 微型泵植入 CsA 预处理的对照小鼠中 2 和 24 小时。在指定的时间点（紫色箭头）测量血压，并在需要时对小鼠实施安乐死和分析。（D） 指定小鼠的收缩压（n = 每组和时间点 9 只小鼠）。每个数据点表示一只单独的鼠标，横条表示平均值（长条）和 s.e.m. ****p < 0.0001 与基线的关系;RM 双向方差分析与 Tukey 事后检验。（E） 实验设计：10-12 周龄小鼠配备 Ang-II 渗透微型泵 4 周。Ang-II 输注 7 天后，连续 5 天给予他莫昔芬 （开放箭头）。在指定的时间点 （紫色箭头） 测量血压，并在实验结束时对小鼠实施安乐死。（F） 在 10 Cn-Ctl 和 12 SM-Cn 的指定时间测量收缩压####−/−小 鼠。每个数据点表示一只单独的鼠标，水平条表示平均值（长条）和 s.e.m. ****p < 0.0001， ***p < 0.001 vs. cn-ctl ang-II;RM 双因子方差分析与 Šídák 事后检验。Tx 表示他莫昔芬给药时间点。可以在 S1 数据中找到基础数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.g006 为了确定长期、持续高血压是否需要 Cn 的存在，我们在用 Ang-II 诱导高血压后 7 天触发了 SMCs 中的 Cn 缺失（图 6E）。Ang-II 治疗 7 天后，Cn-Ctl 和 SM-Cn 的高血压程度相似f/f小鼠（图 6F）。此时，所有小鼠都用 Tx 处理以引发 SM-Cn 中 Cn 的平滑肌缺失f/f小鼠， 产生 SM-Cn−/−小 鼠。SM-Cn 血压降低−/−小鼠最早在第一次 Tx 给药后 1 天就持续下降直到实验结束;相比之下，Cn-Ctl 小鼠在实验结束前一直处于高血压状态（图 6F）。这些数据强烈表明，平滑肌 Cn 积极参与 Ang-II 诱导的高血压的发生和维持，将平滑肌 Cn 确定为治疗高血压的潜在靶点。 SMC Cn 协调 Ang-II 诱导的转录程序，参与动脉收缩和高血压 为了深入了解 Cn 介导的高血压早期发病的分子机制，我们进行了转录组学分析，以确定其在主动脉中受 Ang-II 调节需要在 SMC 中表达 Cn 的基因。为了获得响应 Ang-II 的基因表达变化的公正概述，我们选择了每种基因型中 Ang-II 处理后的所有差异表达基因 （DEG）。具体来说，我们比较了未处理与 Ang-II 处理的 Cn-Ctl 小鼠和未处理与 Ang-II 处理的 SM-Cn−/− mice, selecting protein-coding genes with a fold change (FC) > ±2. This set of genes was considered sensitive to Ang-II treatment. Heatmap analysis of these DEGs revealed that smooth muscle Cn is essential for the differential expression of most Ang-II-regulated genes in the aorta (Fig 7A). When analyzing DEGs independently of the FC threshold, we identified 800 DEGs in the aortas of Cn-Ctl mice treated for 2 h with Ang-II versus untreated mice; of these DEGs, almost 90% (722 genes) showed no evidence of Ang-II regulation in the aortas of SM-Cn−/− mice (Figs 7A and S8A and S1 Table). To refine the list of candidate mediators involved in Ang-II-induced hypertension, we focused on a subset of 336 DEGs that were also differentially expressed between Ang-II-treated Cn-Ctl and SM-Cn−/− mice (S8B Fig and S2 Table). thumbnail Download: PPTPowerPoint slide PNGlarger image TIFForiginal image 图 7. 平滑肌细胞 （SMC） 钙调磷酸酶 （Cn） 协调 Ang-II 诱导的与动脉收缩力相关的转录程序。 （一、二）受血管紧张素 II （Ang-II） 调节的差异表达基因 （DEG） 的标准化平均表达相对于每个独立 RNAseq 数据集中未处理条件的热图。（C） 比较 Cn 表达依赖性 DEG （336） 和 Cn 活性非依赖性 DEG （2,596） 数量的维恩图，并显示受 Ang-II 调节需要 Cn 表达而不是其活性的共享 DEGs 的数量 （271）。（D） 通过 g：Profiler 获得的 271 个 Cn 表达依赖性 DEGs 中最显著富集的细胞成分 （CC）。（E） 用 GFP 或 Cre 编码慢病毒（分别为 LV-GFP 或 LV-Cre）转导的原代 VSMC 的蛋白质提取物中 CnA、CnB 和微管蛋白（上样对照）的代表性免疫印迹分析（n = 7 个单独实验）。标明分子量 （kDa）。（F） 实验设计：胶原凝胶在 37 °C 下聚合 1 h，VSMC （8 × 104）接种在每个凝胶上，粘附 5 小时，并缺血清 72 小时。然后将凝胶轻轻从板中取出，并在 37 °C 下在补充有 3% FBS 的 DMEM 中孵育 24—48 小时。 （G） 在指定条件下固定胶原凝胶的代表性图像和 （H） 归一化表面积。每个数据点表示一个实验的平均值，直方图中的数据表示为 s.e.m. 的平均值± （n = 7 个 LV-GFP 和 LV-Cre 的独立实验;n = 5 个编码 LxVP 肽或其非活性形式 LxVPmut 的慢病毒独立实验）。p < 0.001;n.s.，不显著;未配对的学生 t 检验。比例尺，5 毫米。来自对照（Cn-Ctl 或 WT）的 （I） 主动脉环和 （J） 肠系膜阻力动脉 （MRA） 环张力的量化，SM-Cn−/−，或 CsA 处理的 WT 小鼠，在用 80 mM KCl（左图）和指示的 KCl 浓度（右图）刺激 30 分钟后。左面板：每个数据点表示一只单独的鼠标，直方图中的数据表示为平均值 ± s.e.m. ****p < 0.0001;使用 Tukey 事后检验的单向方差分析。右图：数据显示为平均值 ± SEM ****p < 0.0001 vs. 对照，p < 0.0001 vs. CsA;使用 Tukey 事后检验的双向方差分析。主动脉环实验包括来自 16 个对照、10 个 SM-Cn 的样品####−/−和 7 只 CsA 处理的小鼠，而 MRA 环则从 12 只对照、8 只 SM-Cn 中分析出来−/−和 5 只 CsA 处理的小鼠。可以在 S1 数据中找到基础数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.g007 由于 CsA 预处理不能预防 Ang-II 诱导的高血压，我们推断 Ang-II 诱导对 CsA 敏感的基因不太可能介导高血压。因此，我们进行了额外的转录组学分析，以确定其受 Ang-II 调控不受 CsA 影响的基因。这项研究的性能非常高，在接受 Ang-II 处理 2 小时的小鼠的主动脉中鉴定出 2,653 个 DEGs（S8C 图 和 S3 表）。为了在这种情况下获得基因表达的无偏性概述，我们从未处理和 Ang-II 处理的 WT 小鼠之间以及未处理和 AngII 处理的 CsA 预处理小鼠之间的比较中选择了具有 FC > ±2 的蛋白质编码 DEGs。这些 DEGs 的热图分析显示 Ang-II 处理对主动脉转录组有显着影响，而 CsA 预处理对 Ang-II 的基因表达调节有微妙的影响（图 7B），其中 2,596 个 Ang-II 调节基因（近 98%）对 CsA 预处理不敏感（S8C 图）。将这些基因与 336 个 Cn 依赖性 DEGs 进行比较，确定了一组 271 个基因，其受 Ang-II 的调节需要 Cn 表达，但不需要其磷酸酶活性（图 7C）。这些基因的功能注释聚类揭示了与参与细胞收缩性调节的细胞成分密切相关的簇项的富集，例如 “肌动蛋白丝束”、“收缩纤维”、“粘着斑 ”和 “肌原纤维” （图 7D）。 VSMC contractility has a direct effect on BP regulation [3], and actomyosin cytoskeleton dynamics is critical for VSMC contractility regulation [24]. To investigate the influence of Cn on VSMC contractile capacity, we cultured primary Cnf/f VSMCs transduced with GFP-encoding or Cre-encoding lentivirus (LV-GFP or LV-Cre, respectively) on collagen disks. In this assay, contractile capacity is determined by measuring the collagen disk surface area, which decreases as the attached cells contract in response to 3% fetal bovine serum (FBS) (Figs 7F and S9) [25,26]. Transduction with Cre-encoding LV efficiently deleted Cn expression (Fig 7E) and substantially impaired gel contraction relative to cells transduced with LV-GFP (Fig 7G and 7H). In contrast, transduction of WT VSMCs with an LxVP-encoding lentivirus (LV-LxVP) failed to prevent gel contraction (Fig 7G and 7H). These results suggest that Cn regulates VSMC contractility through a mechanism unrelated to its phosphatase activity. To investigate the contribution of SMC Cn to vessel contractility regulation in a more physiological setting, we measured the KCl-induced contraction of vehicle- or CsA-pretreated aortic and mesenteric resistance artery (MRA) rings from WT, Cn-Ctl, and SM-Cn−/− mice. Cn deficiency, but not inhibition of its phosphatase activity with CsA, decreased aortic and MRA contractility in response to saturating (Fig 7I and 7J, left panels) or increasing KCl concentrations (Fig 7I and 7J, right panels), providing further support for the idea that Cn expression in SMCs is critical for arterial contractility regulation independently of Cn phosphatase activity. 为了研究这组 271 个基因与高血压的潜在关联，我们使用 Harmonizome 数据集集合 （http://amp.pharm.mssm.edu/Harmonizome） 进行了分析。该分析提供了这些基因中 >70% 的高血压评分 （HS） （S4 表），表明可能与高血压有关，并支持我们的转录组学方法作为识别编码 Ang-II 诱导的高血压介质的基因的方法的有效性。对于具有最高 HS 的基因，Ang-II 诱导的 FC 表达的图形表示显示 SM-Cn 中的调节明显不同−/−相对于 Cn-Ctl、WT 和 CsA 预处理的小鼠（图 8A）。我们使用 RT-qPCR 进一步分析了 HS 最高的三个基因 — Serpine1 、 Ier3 和 Gja1 — 在个体小鼠的主动脉中的表达。Ang-II 暴露 2 小时后，这些基因的表达在 Cn 缺陷小鼠中受到显着抑制，但在 CsA 处理的小鼠中未受到抑制（S10 图），确定它们是 Ang-II 诱导的高血压的候选介质。 缩略图 下载： PPT的PowerPoint 幻灯片 PNG放大图片 国际电影节原始图像 图 8. 纤溶酶原激活物抑制剂 1 型 （PAI-1） 介导血管平滑肌细胞 （VSMC） 收缩力和血管紧张素 II （Ang-II） 诱导的高血压。 (A） 高血压评分 （HS） 最高的前 30 个基因列表，包括相对于未治疗小鼠，Ang-II 处理 2 小时后它们的基因符号、HS 和表达倍数变化 （FC）。（B） PAI-1 和微管蛋白（上样对照）的代表性免疫印迹分析，以及 （C） 它们在未处理对照 （n = 4） 和 SM-Cn 的蛋白质提取物中的相对表达的定量−/− (n = 2） 小鼠和来自 Ang-II 处理的对照 （n = 6）、SM-Cn−/− (n = 6） 和 CsA 预处理 （n = 6） 小鼠。标明分子量 （kDa）。使用 Tukey 事后检验的单因素方差分析;p < 0.0001，***p < 0.001，**p < 0.01，ns.，不显著。（D） 来自指定组小鼠的磷酸化 Smad2 免疫染色 AbAo 横截面的代表性图像。L， 流明.比例尺，100 μm。（E） 相同横截面中磷酸化 Smad2 核信号平均强度的定量。每个数据点表示一只小鼠，其值表示每只小鼠至少两个独立图像的平均量化。直方图中的数据表示为平均值 ± s.e.m. **p < 0.01;未配对的学生 t 检验。（F） 代表 Smad2/3、PAI-1 和微管蛋白（上样对照）的免疫印迹分析，以及 （G） 它们在指定组蛋白质提取物中的相对表达的定量（n = 3 个独立实验）。标明分子量 （kDa）。数据以平均值表示± s.e.m. *p < 0.05，**p < 0.01;使用 Šídák 事后检验的双因子方差分析。（H-K）在指定条件下固定胶原凝胶的代表性图像 （H， J） 和归一化表面积 （I， K）。每个数据点表示每个实验的平均值，直方图中的数据表示为 s.e.m. 的平均值±（n = 3-4 个独立实验，使用 3% FBS 和 50 μM TM5441 （H））。p < 0.001， ****p < 0,0001;未配对的学生 t 检验。比例尺，5 毫米。（L） 实验设计：10-12 周龄小鼠在一组 Ang-II 预处理的小鼠 （Ang-II + TM5441） 中加入 TM5441 微型泵前 24 小时配备 Ang-II 渗透微型泵 （Ang-II）。在指定的时间点 （紫色箭头） 测量血压，并在实验结束时对小鼠实施安乐死。（M） 10 只 Ang-II 处理的小鼠 （Ang-II） 和 8 只用 Ang-II + TM5441 处理的小鼠在指定时间的收缩压。数据表示为平均值 ± s.e.m. ****p < 0.001，与对照;RM 双因子方差分析与 Šídák 事后检验。（N） 实验设计：10-12 周龄小鼠在腹膜内注射 TM5441 或载体给一组 Ang-II 预处理的小鼠前 7 天装有 Ang-II 渗透微型泵 （Ang-II）。在指定的时间点 （紫色箭头） 测量血压，并在实验结束时对小鼠实施安乐死。（O） 5 只 Ang-II + 载体（对照）和 6 只用 Ang-II + TM5441（对照 + TM5441）处理的小鼠在指定时间的收缩压。数据表示为平均值 ± s.e.m. ****p < 0.001，与对照组相比;RM 双因子方差分析与 Šídák 事后检验。（P） 拟议的机制：SMC Cn 的结构作用介导 Ang-II 通过 Smad2 激活诱导 PAI-1，随后导致 VSMC 收缩和血压 （BP） 升高。可以在 S1 数据中找到基础数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.g008 与 mRNA 数据一致，PAI-1（Serpine1 编码的蛋白质）的表达在接受 Ang-II 处理 2 小时的小鼠主动脉中增加。这种增加在 SM-Cn 中没有发生−/−小鼠，并且没有被 CsA 治疗所预防 （图 8B 和 8C）。多种转录因子可诱导 Serpine1 表达，包括 p53、AP1、NF-kB、CREB1 和 SMAD2/3 [27–30]。值得注意的是，SMAD2/3 激活不仅通过 TGF β发生，还通过 Ang-II 触发的 TGF β非依赖性机制发生 [31,32]。为了探讨这些因子在 AngII 介导的 Serpine1 诱导中的作用，我们评估了 Smad2 在 Ser465/467 位点的磷酸化，这是其激活的标志物。在 Cn-Ctl 和 CsA 处理的小鼠的主动脉中输注 Ang-II 2 小时后，Smad2 磷酸化显着增加，但在 SM-Cn 的主动脉中未观察到−/− mice (Figs 8D, 8E, S11A and S11B). These findings indicate that Smad2 activation by Ang-II is mediated by a phosphatase-independent activity of Cn. To further evaluate the role of Smad2 in PAI-1 induction by Ang-II, we knocked down Smad2 in VSMCs. Smad2 silencing substantially reduced PAI-1 induction by Ang-II in VSMCs (Figs 8F, 8G and S11C), strongly suggesting that a structural role of Cn mediates Serpine1 induction through Smad2 activation. PAI-1 is a key regulator of VSMC contractility and hypertension Given the identification of PAI-1 as a major candidate mediator of Ang-II-induced hypertension, we investigated its potential role in regulating contractility and Ang-II-induced hypertension. Pre-treatment of VSMCs with the PAI-1 inhibitor TM5441 nearly abolished their capacity to contract collagen gels (Fig 8H and 8I), a result that was consistently replicated when Smad2 was silenced (Fig 8J and 8K). In an in vivo approach, when mice were treated with PAI-1 inhibitor 24 h after the induction of hypertension with Ang-II (Fig 8L), there was a marked reduction in BP 24 h after the inhibitor administration (Fig 8M). Additionally, in a complementary experimental setup, acute intraperitoneal administration of TM5441 fully reversed hypertension induced by 7 days of Ang-II treatment (Fig 8N and 8O). These findings suggest that PAI-1 inhibition may rapidly restore normotension in hypertensive patients. Taken together, our results emphasize the link between BP regulation and VSMC contractility, demonstrating that PAI-1 is a critical mediator of VSMC contractility and Ang-II-induced hypertension. Its expression is induced by Ang-II through Smad2 activation, which is dependent on a structural role of Cn in SMCs that does not require its phosphatase activity (Fig 8P). Discussion The results of this study reveal that the phosphatase activity of SMC Cn is critical for Ang-II-induced abdominal aorta dilatation, whereas, unexpectedly, Cn drives hypertension independently of its phosphatase activity. Through this non-enzymatic function, SMC Cn emerges as a master regulator of a gene expression program that leads to hypertension. Almost 90% of the genes regulated by the vasopressor Ang-II during hypertension onset require Cn expression in SMCs, but only a small fraction of these genes require Cn phosphatase activity for this regulation. Together, our findings suggest a critical structural role for Cn in BP and gene expression regulation. Cn was identified in previous studies as a mediator of Ang-II-induced AAA and vascular remodeling [7,12,33], yet the aortic cell types responsible for this role remained unknown. Our current findings demonstrate that Ang-II-induced AAA formation in hyperlipidemic mice requires Cn expression in SMCs, but not in ECs. Our previous research indicated that AAA formation requires the phosphatase activity of Cn [7]. With our new findings, we now show that, while the development of hypertension also requires the presence of Cn in SMCs, it does not require Cn enzymatic activity. Although we confirmed the absence of Cn in both SMC- and EC-specific KO mice by immunoblotting, a limitation of this study is the lack of immunofluorescence validation or direct assessment of Cn/NFAT activity loss in specific vascular compartments. However, we assessed this by analyzing the expression of Rcan1-4, a well-characterized NFAT target gene responsive to CsA treatment [7]. Its induction by Ang-II was significantly blunted in aortas of SM-Cn ⁻  ⁻ mice (S7D Fig), indicating reduced NFAT activity and providing functional evidence of Cn inactivation in our models./ 高血压是一种复杂的多因素疾病，尽管其患病率很高，但其发病机制的基础尚不完全清楚，这给其临床管理和治疗带来了问题 [2]。几项研究已证明 VSMC 与高血压有关[34–37]。我们目前的结果表明，SMCs 中 Cn 的特异性缺失，而不是 ECs 中的 Cn 特异性缺失，可防止 Ang-II 诱导的收缩压和舒张压增加。此外，SMCs 中的 Cn 缺失也抑制了血管加压药 NE 和 L-NAME 诱导的高血压。由于 SMC Cn 在用 Ang-II 诱导高血压后 1 周缺失大大降低了血压，我们的结果表明 SMC Cn 不仅在高血压的发病中起着重要作用，而且在维持高血压中也起着重要作用。最近的一项报告表明，Ang-II 诱导的持续高血压需要催化亚基 CnAβ，但不是其诱导所必需的，因为组成型 CnAβ 缺失在治疗的前 3 周并不能预防 Ang-II 诱导的高血压，但确实导致 1 周后收缩压降低 [33]。由于 SMC 中的 Cnb1 缺失导致这些细胞中表达的两个 Cn 催化亚基（CnAα 和 CnAβ）不稳定并阻断 Ang-II 诱导的高血压，因此我们建议虽然 CnAα 介导 Ang-II 诱导高血压，但可能需要 CnAβ 来维持其。 免疫抑制剂 CsA 抑制 Cn 磷酸酶活性可阻止 Ang-II 诱导的主动脉扩张，但不能预防 Ang-II 诱导的高血压。药物抑制和遗传消融之间的这种差异可能源于先前报道的长期环孢素A治疗对高血压的影响[38–40]或环孢素对凋亡途径的脱靶效应[41]、亲环蛋白D[42]或亲环蛋白B[43]。这些脱靶效应也可能解释了在未处理的 CsA 预处理和未处理的 WT 小鼠之间观察到的基因调控差异（图 7B）。然而，我们检测到单独用 CsA 治疗的小鼠没有 BP 增加。应该注意的是，以前的研究使用了更高的环孢素A剂量（20-30 mg/kg/d，而本研究中为5 mg/kg/d）和不同的给药途径[38-40]。这些结果表明，SMC Cn 通过独立于其磷酸酶活性的机制介导 Ang-II 诱导的高血压，这一观点得到了我们发现的支持，即编码 Cn 抑制肽 LxVP 的 LV 也未能阻止 Ang-II 诱导的高血压，尽管有效阻断了 Cn 底物 NFAT 的激活。 已经描述了某些酶的催化非依赖性作用;例如，短期突触前可塑性需要 αCamKII 的存在，但不需要其激酶活性 [44]。尽管 Cn 功能被广泛归因于其磷酸酶活性，但已提出在心脏纤维化中具有磷酸酶非依赖性作用 [21]，并在突触后密度分布 [45] 和功能性 TCR 信号复合物的组装中得到证明 [46]。此外，Cn 与其底物 NFAT 的相互作用不仅导致其去磷酸化介导的激活，还通过掩盖核输出信号导致其保留在细胞核中 [47]。已经鉴定出与经典 LxVP 和 PIxIT 位点不同的新 Cn 相互作用子和 Cn 结合位点 [48]，一些已鉴定的 Cn 相互作用子可以作为 Cn 支架或调节 Cn 酶活性或其亚细胞分布 [49,50]，这表明 Cn 可能是大分子信号复合物的一部分。在这一行中，我们的结果表明，一些 Cn 相互作用子可能独立于 Cn 磷酸酶活性介导 BP 调节。 Although BP is largely determined by the resistance arteries, large arteries also contribute by regulating pulse wave pressure during the cardiac cycle, and changes in aortic stiffness or compliance are strongly associated with hypertension in humans [51]. There is increasing evidence that large artery damage has a deleterious impact on the microcirculation that affects hypertension; however, the underlying molecular mechanisms are poorly understood [4]. Since we detected hypertension as early as 2 h after Ang-II infusion in WT and Cn-Ctl mice, we reasoned that a transcriptomic analysis of the aorta performed at this time could identify genes mediating hypertension onset. The regulation of nearly 90% of the genes affected by Ang-II in the aorta required Cn expression in SMCs, indicating that among the numerous signaling pathways activated by Ang-II, those mediated by Cn are critical, at least in the aorta, for early signaling events. Consistent with our previous results showing that just 11 of >1,500 Ang-II-regulated genes in cultured VSMCs are sensitive to Cn inhibition by CsA [7], only 2% of the transcriptome regulated by Ang-II in the aorta required Cn phosphatase activity. These results further support a structural, phosphatase-activity-independent role for Cn in gene expression regulation. To identify candidate mediators of hypertension, we focused on genes whose regulation by Ang-II was dependent on Cn expression but not on its phosphatase activity. Functional annotation clustering analysis of these genes revealed that Cn orchestrates the induction of a gene expression program enriched in cellular components strongly associated with VSMC contractility regulation. Moreover, Cn deletion in cultured VSMCs, but not inhibition of its phosphatase activity, impaired the contractile capacity of these cells. Accordingly, Cn deletion in SMCs, but not its phosphatase activity inhibition, diminished the contractile capacity of aortic and resistance arteries. These results are consistent with previous findings showing that impaired vessel contractility leads to diminished Ang-II-induced hypertension [17,34,36,37,52] and strongly suggest that SMC Cn regulates artery contraction and hypertension onset and maintenance in a phosphatase-activity-independent manner. Cn 缺失不仅预防了 Ang-II 诱导的高血压，还预防了 NE 或 L-NAME 诱导的血压升高。需要注意的是，这三种刺激增加 [Ca2+]我，这对 VSMC 收缩至关重要，并且 Cn 与钙动力学的调节有关 [53,54]。因此，一种有趣的可能性是 Cn 可能通过调节 [Ca2+]我因此 SM 收缩。在这方面，在 Harmonizome 分析中 HS 最高的基因是 Gja1，它编码连接蛋白 43 （Cx43），这是一种调节 Ca 的蛋白质2+VSMC 的依赖性收缩 [55]。 我们的结果表明，SMC Cn 在协调包括 271 个基因的基因表达程序的早期诱导中起关键结构作用。虽然其中许多基因与血管收缩力和高血压的发生和维持有关，但近 30% 的 Ang-II 调控基因需要 Cn 表达而不是其酶活性，以前与高血压无关，因此是高血压治疗干预的潜在新靶点。 值得注意的是，Serpine1 是 HS 最高的基因之一，其受 Ang-II 的调节是通过 Smad2 激活和 SMC Cn 的结构作用介导的。Serpine1 编码 1 型纤溶酶原激活物抑制剂 （PAI-1），其血浆水平与临床高血压相关 [56]。Serpine1 缺失已被证明可以减少 L-NAME 诱导的高血压 [57]。我们目前的研究结果通过证明 PAI-1 抑制实际上消除了 VSMC 的收缩能力并迅速逆转了 Ang-II 诱导的高血压，从而扩展了这一知识。 尽管之前已经报道了 TM5441 降低血压的能力 [58]，但我们的结果首次揭示了 TM5441 迅速而迅速地降低 Ang-II 建立的高血压。具体来说，在 Ang-II 诱导的高血压后 24 小时施用 TM5441 可在 24 小时内显著降低血压，而在 Ang-II 治疗 7 天后急性施用可完全逆转高血压（图 8L-8O）。综上所述，这些发现突出了 PAI-1 作为 Cn 调节的高血压介质，并支持其作为 SMC 收缩性关键因素的作用。此外，数据强烈主张评估 PAI-1 抑制剂（如 TM5441）作为高血压治疗的潜在治疗剂。 Methods Mouse strains To delete Cn specifically in SMCs or ECs, we crossed Cnb1flox/flox (Cnf/f) mice [15] with either Cdh5-CreERT2 transgenic mice [16] to obtain EC-Cnf/f mice or with Myh11-CreERT2 transgenic mice [17] to obtain SM-Cnf/f mice. All mouse strains were backcrossed with C57BL/6J mice for more than eight generations to obtain a homogeneous genetic background and were maintained in homozygosity for the CnB1-floxed locus and in hemizygosity for the CreERT2 transgene in the case of EC-Cnf/f and SM-Cnf/f mice. All mice were genotyped by PCR of genomic DNA obtained from tail samples (genotyping PCR). In some experiments, genomic DNA samples from Tx-treated mice were analyzed by agarose gel electrophoresis to detect the Cre-loxP recombination (recombination PCR). Primer sequences used for genotyping were: CnB1-floxed mice (5′-CCCTAGGCACTGTTCATGGT-3′, 5′-GCCACAGATTAGCCTCGTGT-3′, 5′-CACATTCACCCACAATTGC-3′), Myh11-CreERT2 mice (5′-TGACCCCATCTCTTCACTCC-3′, 5′-AACTCCACGACCACCTCATC-3′, 5′-AGTCCCTCACATCCTCAGGTT-3′), and Cdh5-CreERT2 mice (5′-GCCTGCATTACCGGTCGATGCAACGA-3′, 5′-GTGGCAGATGGCGCGGCAACACCATT-3′). Animal procedures Animal procedures were approved by the CNIC Ethics Committee and by the Madrid regional authorities (ref. PROEX 80/16 and PROEX 182.1/20) and conformed to European regulations regarding animal care (Directive EU 2010/63EU and Recommendation 2007/526/EC). All mice were housed in the CNIC specific pathogen-free animal facility with controlled temperature, humidity, and light-dark cycles. Sacrifice of mice was done by CO2 inhalation. Cnb1f/f-CreERT2-neg together with Cnb1wt/wt;Cdh5-CreERT2 or Cnb1wt/wt;Myh11-CreERT2, were used as controls (Cn-Ctl) for Cnb1f/f;Cdh5-CreERT2 or for Cnb1f/f;Myh11-CreERT2, respectively. For inducible and conditional gene deletion, 10–12-week-old Cn-Ctl, SM-Cnf/f, and EC-Cnf/f male mice were given daily 1 mg i.p. injections of Tx (Sigma-Aldrich) on five consecutive days, generating SM-Cn−/− and EC-Cn−/− mice. Cn-Ctl, SM-Cn−/−, and EC-Cn−/− male mice were used after 6 weeks of Tx administration. Ang-II (Sigma-Aldrich), CsA (Novartis), NE (Sigma-Aldrich), and TM5441 (MedChemExpress) were administered at 1 μg/kg/min, 5 mg/kg/d, 10 mg/kg/d, and 20 mg/kg/d, respectively, using subcutaneous osmotic minipumps (Alzet Corp, model 2001 or 2004). Nω-nitro-l-arginine methylester hydrochloride (l-NAME; 0.5 g/l; Sigma-Aldrich, N5751) was administered in drinking water every 3 days. For minipump implantation, all mice were isoflurane-anesthetized (3%–5% isoflurane for induction, 1%–2% isoflurane for maintenance), and a small surgical pocket was made in the dorsal skin, where the minipump was implanted. Mice undergoing the same surgical procedure but without minipump implantation were used as controls for the Cn-Ctl, SM-Cn−/−, EC-Cn−/−, and CsA-treated groups. For the AAA model, Cn-Ctl, SM-Cn−/−, and EC-Cn−/− male mice were fed a HFD (EF M HF coconut oil, + 7.5 g/kg Cholesterol Experimental diet, 38% chow, 10 mm; S9167-E011, SSNIFF) for 12 consecutive weeks. In the first week of feeding, Tx was injected to induce deletion in the CreERT2-expressing mice. After 12 weeks of the HFD, this treatment was combined with the systemic infusion (1 µg/kg/min) of Ang-II (Sigma-Aldrich) with osmotic minipumps (Alzet Corp) [19]. For the SM-Cn−/− transcriptome analysis, short-term Ang-II infusion and mouse selection were performed as follows: male mice were treated with Tx and, after 6 weeks, baseline BP measurements were performed. Osmotic minipumps with Ang-II (1 µg/kg/min) were implanted in Cn-Ctl and SM-Cn−/− mice in parallel, and BP was measured after 2 and 24 h. Treated Cn-Ctl mice with systolic BP > 130 mmHg were considered valid for analysis and were euthanized; all the SM-Cn−/−选择平行治疗的小鼠进行分析，因为它们在输注 Ang-II 后均未显示血压升高。对于 CsA 转录组分析，将带有 CsA （CsA 组） 的渗透微型泵植入 WT C57BL/6J 雄性小鼠中。在这个阶段，微型泵没有植入对照小鼠。5 天后，进行基线血压测量。将 Ang-II 渗透微型泵 （1 μg/kg/min） 平行植入 CsA 和对照小鼠中，并在 2 小时和 24 小时后测量血压。Ang-II 处理的 CsA 和收缩压> 130 mmHg 的对照小鼠被认为对分析有效并实施安乐死。如果我们无法确认任何 SM-Cn 中的 CnB1 缺失−/−小鼠或抑制任何 CsA 处理的小鼠胸腺中 NFAT 去磷酸化，将这些小鼠从实验中取出。通过 RT-qPCR 验证和通过 western blotting 进行蛋白质表达的实验以类似的方式进行。 血压测量 使用自动 BP-2000 血压分析系统 （Visitech Systems， Apex， NC， USA） 通过小鼠尾袖法测量动脉血压。简而言之，小鼠每天接受 BP 测量训练，持续一周。训练后，在治疗前一天测量血压，以确定每个小鼠队列的基线血压值。在实验过程中重复测量数次。在位于温暖表面 （37 °C） 上的尾袖限制器中的小鼠中记录血压测量值。连续进行 15 次收缩压和舒张压测量，记录每只小鼠的最后 10 个读数并取平均值。 体内超声成像 使用 VEVO 2100 回声成像设备（VisualSonics，多伦多，加拿大）以 30 微米分辨率通过高频超声从异氟醚麻醉小鼠（1.5%-2% 异氟醚）获得超声图像。超声心动图用于在二维引导 M 模式下，在胸骨旁长轴视图中测量舒张期最大内主动脉内径和室间隔厚度。在治疗开始前进行测量以确定基线直径，并在实验过程中重复数次。在终点，当主动脉直径增加 50% 或更多时，主动脉被归类为 AAA [59,60]，当主动脉直径增加 20%-50% 时被归类为扩张，当主动脉直径增加 20% 或更少时，主动脉被归类为 AAA，在所有病例中，当直径增加 20% 或更少时，主动脉被归类为正常。 慢病毒的产生和感染 表达 LV 的 Cre 重组酶、GFP 蛋白、LxVP 和 LxVPmut 肽之前已经描述过 [7,18]。假型 LV 的产生和滴定如前所述 [18,61]。简而言之，使用磷酸钙法瞬时转染 HEK-293T 细胞，并通过超速离心（26,000 rpm 下 2 小时;超透明管;SW28 转头和 Optima L-100 XP 超速离心机;贝克曼）。将病毒悬浮在低温无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并通过转导 Jurkat 细胞滴定 48 小时。通过流式细胞术 （BD FACSCanto 流式细胞仪和 FlowJo v10.8 软件） 定量转导效率 （表达 GFP 的细胞） 和细胞死亡 （碘化丙啶染色）。HEK-293T 和 Jurkat 细胞系购自 ATCC。所有细胞均呈支原体阴性。 体内主动脉慢病毒转导 通过腹膜内注射氯胺酮 （120 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （16 mg/kg） 对 WT 雄性小鼠进行麻醉，并做一个小切口以暴露颈静脉 [7,61]。病毒溶液（200 μl，109 particles/ml in PBS) was inoculated directly into the jugular vein 6 weeks before Ang-II minipump implantation. Transduction efficiency was analyzed postmortem in aortic samples by GFP immunohistochemistry. Cell procedures Primary mouse VSMCs were isolated and grown as described [62]. In brief, aortas from Cnf/f male mice were dissected, and the adventitia was removed with forceps. Aortic tissue was cut into small rings and digested with 1 mg/ml collagenase type II (Worthington) and 0.5 mg/ml elastase (Worthington) in DMEM (Gibco) until single cells were observed under the microscope. The enzymatic reaction was stopped by the addition of DMEM supplemented with bovine serum. For primary mAECs, digested tissue was incubated with anti-ICAM-2 (BD Biosciences, 553326) conjugated to magnetic beads (Dynal Thermofisher, 11035). Isolated cells were cultured, and the remaining tissue was removed on the following days. VSMCs were cultured in DMEM (Gibco) supplemented with 20% FBS (Gibco) and antibiotics. mAECs were cultured in DMEM F-12 (BioWhittaker BE, 12-719F) supplemented with 20% FBS, 100 mg/ml heparin (Sigma-Aldrich), 5 mg/ml EC growth factor (Gibco), and antibiotics on culture plates pre-covered with 0.5% gelatin and 100 mg/ml collagen type I (Sigma-Aldrich, C2124-50ML). EC purity was > 80% after 1 week of culture. All experiments were performed in passages 3–5, and all cells were mycoplasma-negative. VSMCs were infected with specific LVs for 5 h at a multiplicity of infection = 10. The medium was then replaced with fresh supplemented DMEM. Seven days after the transduction, infection efficiency was evaluated and experiments were performed. In the case of Cre-recombinase-expressing LVs, infection was confirmed by immunoblot detection of Cn deletion. In the case of LxVP-expressing LVs, infection was confirmed by RT-qPCR detection of GFP. 按照制造商的方案，使用 Lipofectamine 转染试剂 （Invitrogen， 13778075） 用 siRNA 转染 VSMC。Smad2 特异性 siRNA（ON-TARGETplus 小鼠 Smad2 siRNA （SMARTPool） L-040707-00-0005，Dharmacom）靶向以下序列：5'-ACUCAGAAUUGCAAUACUA-3'、5'-CGAAUGUGCACCAUAAGAA-3'、5'-GCUCAAGCAUGUCGUAAAC-3' 和 5'-GAAAGGGUUGCCACAUGUU-3'。非靶向对照 siRNA（ON-TARGETplus 非靶向池，D-001810-10-05，Dharmacom）靶向序列：5′-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3′、5′-UGGUUUACAUGUUGUGA-3′、5′-UGGUUACAUGUUUUCUGA-3′ 和 5′-UGGUUACAUGUUUUCCUA-3′。通过免疫印迹分析确认沉默效率，其中评估了转染 Smad2 siRNA 的 VSMC 裂解物中的 Smad2 蛋白水平。结果表明 Smad2 表达有效敲低，验证了转染方案。 对于胶原收缩测定，将 150 μl 等分试样的 PureCol TM EZ 凝胶溶液（Sigma-Aldrich，5074）在 37 °C 下在 p48 孔中聚合 1 小时，并在 8 × 10 中聚合4将 VSMC 接种在每块凝胶上。将细胞粘附在凝胶上 5 小时，然后饥饿 72 小时。然后将凝胶-细胞复合物轻轻地从平板上分离，并在补充有 3% FBS 的 DMEM 中孵育 24—48 小时。当指示时，用 50 μM TM5441 （MedChemExpress） 预处理细胞 2 小时。实验结束时，将凝胶在 PBS 中洗涤，并用 3% 多聚甲醛 （PFA） 固定 15 分钟。凝胶图像是使用 Nikon SMZ800 勺式相机（0.8× 物镜）拍摄的。每个条件在 3-4 个孔中复制，每个条件用不同批次的 VSMC 复制。凝胶收缩用 ImageJ 软件定量如下：将每个凝胶面积量化并归一化为单次实验中所有面积的平均值;显示了每个条件的标准化区域的平均值。 肌层图 来自对照（Cn-Ctl 或 WT）和 SM-Cn 的环（3 mm 长）−/−切除雄性小鼠胸降主动脉和上 MRA 并置于线肌图（型号 610M，丹麦 Myo Technology，丹麦奥胡斯）上用于测量等长张力。器官腔室中充满克雷布斯溶液（以 mM 为单位的成分：NaCl 118、KCl 4.75、NaHCO325， 硫酸镁41.2、氯化钙22， KH2采购订单41.2 和葡萄糖 11）并注入碳水化合物 （5% CO2和 95% O2，pH ∼7.4），在 37 °C 下。 当指示时，在从动物中取出时将 CsA （200 ng/ml） 添加到 WT 动脉中，并在环形切除期间和腔室的整个实验中保持。将主动脉环和 MRA 环分别拉伸至 5 和 3 mN 的张力，并平衡 30 min。使用肌电图软件 （LabChart） 获得张力特性。最初分别用 80 和 50 mM KCl 刺激主动脉环和 MRA 环，然后测定 KCl 浓度-响应曲线 （1-100 mM）。血管收缩测量值表示为环施加的力 （mN）。 主动脉组织学 用 CO 处死小鼠后2吸入，用生理盐水灌注主动脉，分离并在 4% PFA 中于 4 °C 下固定过夜。 固定主动脉的石蜡横截面 （5 μm） 用 Masson 三色 （Masson）、苏木精和伊红 （HE） 或弹性 Verhoeff-Van Gieson （EVG） 染色。通过使用 NDP.view2 图像查看软件量化包含完整主动脉横截面的四个非连续切片中的介质面积，从 HE 染色确定内侧壁厚度。 For immunohistochemistry, deparaffinized sections (5 µm) were rehydrated, boiled to retrieve antigens (10 mM citrate buffer, pH 6), and blocked for 1 h with 5% goat serum plus 2% BSA in PBS. Samples were incubated with anti-GFP primary antibody (Invitrogen, A11122, 1:200) overnight at 4° and then with a biotinylated secondary antibody for 1 h at room temperature. Signal was detected with the DAB (3,3′-Diaminobenzidine) reaction (Vector Laboratories) for a maximum 7-min reaction time. Sections were then counterstained with hematoxylin, dehydrated, and mounted with DPX (CasaÁlvarez). For immunofluorescence, deparaffinized sections (5 µm) were rehydrated, boiled for antigen retrieval (10 mM citrate buffer, pH 6), and blocked for 1 h with 5% goat serum plus 2% BSA plus 5% horse serum in PBS-Triton 0.01% for anti-Ki67, anti-CD68, and anti- α-SMA. For p-Smad2, DNA was denatured with 1.5M HCl for 20 min RT, followed by blocking with 10% goat serum plus 2% BSA plus 10% horse serum in PBS-Triton 0.01%. Samples were incubated overnight at 4 °C with with the following primary antibodies: anti-Ki67 (ab15580, Abcam), anti-CD68 (ab15580, Abcam), and anti-phospho-Smad2 (Ser465/467; AB3849-I, Millipore) primary antibodies. Bound primary antibodies were detected with Alexa Fluor 594-conjugated or 647-conjugated secondary antibodies (Thermo Fisher, 1:500). Cy3 conjugated anti-α-SMA (C6198, Sigma, 1:2000) was incubated for 1 h RT. DAPI (1 ng/ml; Invitrogen) was used to label cell nuclei. Images were captured using a confocal microscope (Leica, SP5). For quantification, the medial layer of the aorta was defined as the region of interest (ROI) based on the elastin signal. ImageJ software was used to measure the mean intensity of α-SMA staining, and an ImageJ macro quantified nuclear p-Smad2 intensity. CD68-positive cells and Ki67-positive nuclei were manually counted and averaged per section. Data represent the average of at least two sections per mouse. In situ southwestern histochemistry was performed as previously described [7]. Briefly, 5 μm aortic cross sections were deparaffinized and rehydrated. Sections were fixed with 0.5% PFA for 25 min at 28 °C, and endogenous alkaline phosphatase was quenched with 5 mM levamisole (L9756, Sigma-Aldrich). Preparations were then digested with 0.5% pepsin A (P7000, Sigma-Aldrich) in 1 N HCl for 35 min at 37 °C and washed twice with HEPES/BSA buffer (10 mM HEPES, 40 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, and 0.25% BSA, pH 7.4). Sections were incubated with 0.1 mg/ml DNase I in HEPES/BSA buffer for 30 min at 30 °C. Activated NFAT proteins were probed with the synthetic sense DNA sequence 5′-GATCGCCCAAAGAGGAAAATTTGTTTCATACAG-3′. This sequence contains a composite site comprising the NFAT and AP1 sites from the mouse IL-2 promoter [63]. The NFAT probe was labeled with digoxigenin (DIG) (Sigma-Aldrich) and diluted to 25 pM in HEPES/BSA buffer containing 0.5 mg/ml poly (dI-dC) (P4929, Sigma-Aldrich). Absence of probe was used as negative control. After overnight incubation at 37 °C in a humidified chamber, sections were washed twice with buffer 1 (0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.03% Tween-20, pH 7.5) and incubated for 1 h in blocking solution (0.1% SSC and 0.1% SDS diluted 1:10 in buffer 1 without Tween). The preparations were washed with buffer 1 and incubated for 2 h at 37 °C with an anti-DIG antibody conjugated to alkaline phosphatase (1:200 in blocking solution; 11093274910, Roche). Next, sections were washed in buffer 1 and buffer 3 (Tris HCl 0.1 M, 0.1 M NaCl, and 50 mM MgCl2, pH 9.5) at room temperature. Bound alkaline phosphatase was visualized with nitroblue tetrazolium chloride and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (NBT/BCIP; 11681451001, Roche). The reaction was stopped by incubation in buffer 4 (10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 8.0), and sections were dehydrated through a graded ethanol series and mounted in 50% glycerol in PBS. All bright-field images were obtained with a Leica DM2500 microscope with 20× and 40× HCX PL Fluotar objectives and with Leica Application Suite V3.5.0 software. Southwestern histochemistry images were analyzed and quantified with ImageJ software as follows: after color deconvolution by fast red blue DAB, the blue channel was selected (color 2). The same threshold was selected in all images, and only the medial aortic region was selected as a ROI and measured. Raw data are presented. Layouts were obtained in Adobe Illustrator. Immunoblotting Mouse samples were obtained by dissection, and in the case of aortas, perivascular tissue and adventitia were removed with forceps. The tissue was frozen in liquid nitrogen and then homogenized using a mortar. Cultured cells were washed with ice-cold PBS and frozen at −80 °C. Protein extracts from tissue samples and cells were obtained in ice-cold high-salt lysis buffer (20 mM Tris HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2、50 mM NaF、10 mM EDTA、0.5 M NaCl、1% Triton X-100）用于检测 CnB、CnA、微管蛋白、α-SMA、Cd31 和 NFATc3，以及在 RIPA 缓冲液（150 mM NaCl、10 mM Tris HCl pH8、1% Triton X-100、0.1% SDS、1% 脱氧胆酸钠和 5 mM EDTA）中用于检测 PAI-1、磷酸化 Smad2 （Ser465/467）、Smad2/3 和微管蛋白。两种裂解缓冲液均补充有蛋白酶、磷酸酶和激酶抑制剂。将匀浆在 4 °C 下以 16,000g 离心 15 分钟，并在上清液中收集蛋白质。用 Lowry 检测试剂盒定量蛋白质。在还原条件下，在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质样品 （30 μg），并转移至硝酸纤维素膜上。使用以下一抗检测蛋白质：小鼠单克隆抗 CnB （Sigma， 0581， 1：1000）、兔多克隆抗 CnA （Merck Millipore， 07-1491， 1：2000）、小鼠单克隆抗微管蛋白 （Sigma， T6074， 1：40000）、兔多克隆抗 Cd31 （Abcam， ab28364， 1：1000）、小鼠单克隆抗 α-SMA （Sigma， A5228;1：5000）、兔多克隆抗 NFATc3 （M-75） （SCB， sc-8321， 1：1000）、兔单克隆抗 PAI-1 （Abcam， ab222754， 1：500）、抗磷酸化 Smad2 （Cell Signaling 3108， 1：1000）和抗 Smad2/3 （Cell Signaling， 8685， 1：1000）。与适当的特异性 HRP 偶联二抗洗涤和孵育后，使用增强型化学发光 （ECL） 检测试剂（GE Healthcare，美国伊利诺伊州芝加哥，RPN2106）观察免疫反应条带，或使用 Immobilon Forte Western HRP 底物（WBLUF0100，Millipore）在 ImageQuant LAS 4000 设备中采集。使用 ImageJ 对蛋白质条带强度进行定量，使用微管蛋白条带强度进行归一化。 RT 和定量 PCR 用 5 ml 盐水溶液灌注后提取主动脉，丢弃外膜层。使用研钵和自动微珠匀浆器 （MagNA Lyzer） 对冷冻组织进行匀浆。用 TRIZOL （Life Technologies） 分离总 RNA。在 37 °C 下，在含有 200U 莫洛尼鼠白血病病毒 （MMLV） 逆转录酶 （Life Technologies）、100 ng 随机引物和 40U RNase 抑制剂 （Life Technologies） 的 20 μl 反应混合物中逆转录总 RNA （1 μg） 50 分钟。在 AB7900 序列检测 PCR 系统（Applied Biosystem，Foster City，CA，USA）中使用 SYBR Green PCR 或 TaqMan 通用 PCR 预混液（Go Taq Probe PCR Master Mix;Promega、A600A 或 A610A）。使用以下 TaqMan 探针：Ptgs2 （Mm00478374_m1） 和 Hprt1 （Mm00446968_m1）。用于SYBR Green检测的特定探针如下：Gja1 （5′-CTTGGGGTGATGAACAGT-3′;5′-TGAGCCAAGTACAGGAGT-3′ [64]）、Hprt （5′-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3′;5′-CACAGGACTAGAACACCTGC-3′）、Ier3 （5′-GCGCGTTTGAACACTTCTCG-3′;5′-TGGCGCCGGACCACTC-3′）、Rcan1–4 （5′-TTGTGTGGCAAACGATGT-3′;5′-CCCAGGAACTCGGTCTTGT-3′）、Serpine1（5'-GAGGTAAACGAGAGCGGCA-3';5'-AAGAGGATTGTCTCTGTCGGG-3'）。在 SYBR 扩增的情况下，通过扩增后熔解曲线分析检查探针特异性;对于每个反应，仅产生一个 Tm 峰。样品中靶 mRNA 的量由 2−∆CT相对量化方法，使用 Hprt 进行归一化，并以图表表示。代表的每个样本都属于一个小鼠主动脉。 RNA sequencing Aortas were isolated after perfusion with saline, and the perivascular tissue and the adventitia layer were removed with forceps. A piece of aortic tissue was used for PCR confirmation of CnB1 recombination, and the thymus was isolated for protein extraction to check the NFAT phosphorylation state, when appropriate. Aortic tissue was frozen in liquid nitrogen and homogenized with lysis buffer (Qiagen, 64204) using an automatic bead homogenizer (MagNA Lyser; Roche). Total RNA was isolated with the RNeasy MinElute Cleanup Kit (QIAGEN, 74204). Each triplicate was a pool of three aortas (total, nine aortas per condition). RNA quality and purity were analyzed by Nanodrop and Bioanalyzer (Agilent 2100 Bioanalyzer RNA NanoChip). Only RNA samples with appropriate absorbance ratios were used (260/280 nm > 2.0; 230/260 nm 2.0–2.2); RNA samples with a RIN (RNA Integrity number-Bioanalyzer) below seven were discarded. For each condition, 1.5 μg of RNA was retro-transcribed with oligo dT priming, and the cDNA obtained was used to generate the transcriptome library. The library was sequenced using Illumina technology (Illumina Genome Analyzer IIx System). Library generation and sequencing were performed by the CNIC Genomics Unit under the supervision of Dr. Ana Dopazo. Reads were aligned first using BoWTie version 0.12.7 and then mapped to the latest Ensembl transcript set using RSEM v1.16. One replicate of the untreated Cn-Ctl group showed a high deviation from the other two replicates in PCA analysis and was therefore discarded. Genes showing altered expression with an adjusted p < 0.05 were considered DEGs. Only protein-coding genes were included in further analysis. Gene expression data are available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/ under accession number GSE255061. Venn diagrams were generated with the online software Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html), and the DEGs represented in each diagram are indicated in the figure and figure legend. Heatmaps were generated using R library ‘stats’ [65] and ‘gplots’ [66] to represent mean normalized mRNA expression of the DEGs regulated by Ang-II in Cn-Ctl, SM-Cn−/−, WT, and CsA-pretreated mice versus the untreated condition (FC > ±2). Mean normalized mRNA expression was obtained from triplicates of each condition. The HS was extracted automatically by an exact pattern match using the gen symbol as the identifier. The processed database was the Harmonizome dataset collection [67] for the curated CTD Gene-Disease Associations related to the term ‘Hypertension’, where the standardized value was renamed the HS. Functional enrichment analysis Gene Ontology (GO) enrichment analysis of DEGs was performed using g:Profiler software [68]. The analysis mainly focused on gen function data sources related to cellular components (GO:CC). We were able to map genes to statistically significant enriched terms. The statistical domain scope was only applied to annotated genes, adjusting the significance threshold by multiple testing (using the g:Profiler tailor-made algorithm g:SCS), set to a value p < 0.05. This approach has produced more accurate results than obtained with the standard Bonferroni correction or BH-False Discovery Rate methodologies [69]. To select the most relevant functional categories, the term size was adjusted to 0 as minimum and 300 as maximum, avoiding redundant and generic terms. Statistical analysis GraphPad Prism software (versions 9.4.1 and 10.1.2) was used for the statistical analysis. Appropriate tests were chosen according to the data distribution based on the Saphiro–Wilk normality test. Outliers were identified and excluded by the ROUT method. Comparisons for measured parameters and repeated measurements (RM) are indicated in each figure legend. Differences were analyzed by unpaired Student t test, Mann-Whitney test, and one-way ANOVA or two-way ANOVA tests, and multiple comparisons were analyzed with the Tukey or Šídák post hoc tests, as appropriate; the tests used are indicated in each figure legend. Differences were considered statistically significant at p < 0.05. The number of animals used is indicated in the corresponding figures or figure legends. No statistical method was used to predetermine sample size. Sample size was chosen empirically according to our experience in the calculation of experimental variability. All experiments were carried out with at least three biological replicates. Experimental groups were balanced in terms of animal age and weight. Only male mice were used because the Myh11-CreERT2 transgene was inserted in the Y chromosome (https://www.jax.org/strain/019079). Investigators were not blinded to group allocation during experiments or to outcome assessments. Animals were genotyped before experiments, caged together, and treated in the same way. Supporting information Ang-II administration in mice does not modify Cn expression in the aorta. Showing 1/17: pbio.3003163.s001.tif Skip to figshare navigation Sorry we could not load your data. 1 / 17 Download figshare S1 Fig. Ang-II administration in mice does not modify Cn expression in the aorta. (A) Representative immunoblot analysis of CnA, CnB and tubulin (loading control) and (B) quantification of their relative expression in protein extracts from untreated Cn-Ctl (n = 3–4) and Ang-II-treated Cn-Ctl (n = 4–7), Molecular weights (kDa) are indicated. Each data point denotes an individual mouse, and data in histograms are presented as mean ± s.e.m. unpaired Student t test. Underlying data can be found in S1 Data. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s001 (TIF) S2 Fig. Cn deletion in SMCs does not prevent HFD-induced body weight gain. Body weight of 29 Cn-Ctl, 19 EC-Cn−/−, and 28 SM-Cn−/− mice fed a chow diet and 46 Cn-Ctl, 15 EC-Cn−/−, and 18 SM-Cn−/− mice after 12 weeks of HFD. Each data point denotes an individual mouse, and the horizontal bars denote the mean (long bar) and the s.e.m. ****p < 0.0001, ***p < 0.001; one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison post hoc test. Underlying data can be found in S1 Data. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s002 (TIF) S3 Fig. Immunofluorescence characterization of the AbAo in the AAA mouse model. (A) Representative images of α-SMA immunostaining in AbAo cross-se ctions from the indicated groups of mice, and (B) quantification of α-SMA mean intensity in the same cross-sections. Representative images of (C) Ki67 (arrowheads), and (D) CD68 (arrowheads) immunostaining in AbAo cross sections from the indicated groups of mice, with quantification of (E) Ki67 + nuclei and (F) CD68+  cells in the same cross sections. (A,C,D) L, lumen. Scale bar, 100 μm. (B,E,F) Each data point denotes an individual mouse, with values representing the average quantification of at least 2 independent images per mouse. Data in histograms are presented as mean ± s.e.m. ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05; two-way ANOVA with Šídák’s post hoc test (B); Mann–Whitney and unpaired Student t test (E, F). Underlying data can be found in S1 Data. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s003 (TIF) S4 Fig. Cn deletion in SMCs inhibits AngII-induced diastolic hypertension. Diastolic BP values at the indicated times in 5 Cn-Ctl, 3 EC-Cn−/−, and 5 SM-Cn−/− control-treated mice and 22 Cn-Ctl, 10 EC-Cn−/−, and 18 SM-Cn−/− Ang-II-treated mice. Data are mean ± s.e.m. ****p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01 vs. SM-Cn−/− Ang-II, p < 0.001 vs. Cn-Ctl control, p < 0.01, p < 0.05 vs SM-Cn######−/− or Cn-Ctl control; RM two-way ANOVA with Tukey’s post hoc test. Underlying data can be found in S1 Data. Data from untreated and Ang-II-treated Cn-Ctl mice were repeated in left and right panels as indicated in S1 Data. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s004 (TIF) S5 Fig. Cn deletion in SMCs inhibits norepinephrine (NE)- and L-NAME-induced AHT. (A) Experimental design: 10–12-week-old mice were treated with tamoxifen for 5 consecutive days (open arrow heads) and, after 6 weeks, NE osmotic minipumps were implanted for 4 weeks in one group of mice; control mice were operated without minipump implantation. Another mouse group was treated with L-NAME in drinking water for 4 weeks. BP was measured at the indicated time points (purple arrows), and mice were euthanized at the end of the experiment. (B) Systolic BP values of 10 Cn-Ctl and 5 SM-Cn−/− control-treated mice, 11 Cn-Ctl and 6 SM-Cn−/− NE-treated mice, and 5 Cn-Ctl and 6 SM-Cn−/− L-NAME-treated mice. Data are means ± s.e.m. ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05 vs. treated SM-Cn−/−，p < 0.001 vs. 对照 Cn-Ctl，p < 0.05 vs. 对照 SM-Cn #####−/−;RM 双向方差分析与 Tukey 事后检验。可以在 S1 数据中找到基础数据。如S1数据所示，来自未处理的Cn-Ctl和未处理的SM-Cn - / - 小鼠的数据在顶部和底部面板中重复。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s005 （TIF） S6 图 CsA 对 Cn 的抑制会损害 Ang-II 诱导的 NFAT 去磷酸化和心脏肥大。 (A） 如图所示处理的 WT 小鼠胸腺提取物的代表性 NFATc3 免疫印迹分析（上图）和膜的丽春红染色（下图）。显示了高磷酸化 NFATc3 （P-NFAT） 和去磷酸化 NFATc3 （NFAT）。（B） 实验结束心脏重量与体重比 （HW/BW） 值。每个数据点表示一只单独的小鼠，直方图中的数据表示为平均值 ± s.e.m. ****p < 0.0001， ***p < 0.001;使用 Šídák 事后检验的双向方差分析。（C） CsA （第 -2 天） 和 Ang-II （第 0 天） 给药前以及 Ang-II 治疗 21 天后超声心动图确定的室间隔 （IVS） 厚度。每个数据点表示一只单独的鼠标，横条表示平均值（长条）和 s.e.m. ****p < 0.0001，**p < 0.01;RM 双向方差分析与 Tukey 事后检验。（二、三）Ang-II （n = 10）、CsA + Ang-II （n = 8）、对照 （n = 8） 和 CsA （n = 5）。可以在 S1 数据中找到基础数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s006 （TIF） S7 图 Cn 缺失但不抑制 Cn 磷酸酶活性，可防止 Ang-II 诱导的舒张性高血压。 (A、B）在相同的 Cn-Ctl SM-Cn 的指定时间点测量舒张压−/−，以及未预处理和 CsA 预处理的 WT 小鼠，如图 6B （A） 和图 6D （B） 所示。每个数据点表示单个小鼠的 BP 值，水平条表示平均值（长条）和 sem（n = 每组和每个时间点 9 只小鼠）。p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05 vs. 基线;RM 双向方差分析与 Tukey 事后检验。p < 0.01 与 2 或 24 小时 Ang-II Cn-Ctl;RM 双因子方差分析与 Šídák 的事后检验。（C） 如图所示处理的小鼠胸腺提取物的代表性 NFATc3 免疫印迹。显示了高磷酸化 NFATc3 （P-NFAT） 和去磷酸化 NFATc3 （NFAT）。膜的丽春红染色如下所示。（D） 通过 RT-qPCR 评估的未处理对照（3 Cn-Ctl 加 3 WT）主动脉提取物中 mRNA 表达的定量，SM-Cn##−/− (n = 5），以及 CsA 预处理 （n = 6） 小鼠和 Ang-II 处理的对照（3 Cn-Ctl 加 3 WT），SM-Cn−/− (n = 5） 和 CsA 预处理 （n = 6） 小鼠。每个数据点表示一只单独的小鼠，直方图中的数据表示为平均值 ± s.e.m. **p < 0.01， ****p < 0.0001;使用 Šídák 事后检验的双向方差分析。可以在 S1 数据中找到基础数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s007 （TIF） S8 图 从转录组分析中选择可能与 AHT 相关的基因。 (A） 选择经 Ang-II 处理 2 h 的 Cn-Ctl 小鼠中的 800 个 DEGs 作为 AHT 的潜在介质，在 SM-Cn 中调节 130 个 DEGs−/−用 Ang-II 处理 2 小时的小鼠被排除在外，留下 722 个可能与 AHT 相关的基因，如 Venn 图（下图）所示。（B） 在这些基因中，只有那些在高血压 （Cn-Ctl Ang-II 2 h） 和非高血压 （SM-Cn） 之间表达不同的基因−/− Ang-II 2 h) were selected using a Venn diagram (below). The figure indicates the resulting 336 DEGs potentially involved in AHT and whose regulation is Cn-expression dependent. (C) 2,653 DEGs regulated in WT mice by treatment with Ang-II for 2 h were selected as potential mediators of AHT. Only those whose expression was similar in both hypertensive conditions (not showing differential expression between WT Ang-II 2 h and CsA Ang-II 2 h) and CsA-independent were selected using a Venn diagram (below). The figure indicates the resulting 2,596 DEGs potentially involved in AHT and whose regulation is independent of Cn phosphatase activity. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s008 (TIF) S9 Fig. Collagen contraction assay. (A) Representative images from three independent experiments and (B) quantification of the surface area of fixed collagen gels in the absence or presence of cells stimulated as indicated. Each data point denotes the mean of each experiment, and data in histograms are presented as mean ± s.e.m. *p < 0.05 by two-way ANOVA with Šídák’s post hoc test. No cells without serum (n = 2), starved cells (n = 3), No cells with 3% FBS (n = 3), Cells with 3% FBS (n = 3). Underlying data can be found in S1 Data. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s009 (TIF) S10 Fig. Serpine1, Gja1, and Ier3 induction is mediated by a structural role of SMC Cn. RT-qPCR analysis of mRNA expression in aortic extracts from untreated control (3 Cn-Ctl plus 3 WT), SM-Cn−/− (n = 5), and CsA-pretreated (n = 6) mice and from Ang-II-treated control (3 Cn-Ctl plus 3 WT), SM-Cn−/− (n = 5), and CsA-pretreated (n = 6) mice. Two-way ANOVA with Šídák post hoc test; ****p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05. Underlying data can be found in S1 Data. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s010 (TIF) S11 Fig. Smad2 activation is mediated by a structural role of SMC Cn. (A) Representative immunoblot analysis of phospho-Smad2, Smad2/3 and tubulin (loading control) and (B) quantification of their relative expression in protein extracts from untreated control (n = 3) and SM-Cn−/− (n = 3) mice; CsA-pretreated (n = 3) mice; and Ang-II-treated control (n = 4), SM-Cn−/− (n = 4） 和 CsA 预处理 （n = 4） 小鼠。标明分子量 （kDa）。每个数据点表示一只单独的小鼠，直方图中的数据表示为平均值 ± s.e.m. *p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001;使用 Šídák 事后检验的双因子方差分析。（C） 图 8F 中代表性免疫印迹的蛋白质提取物中蛋白质提取物中相对表达的定量（n = 3 个独立实验），每个数据点代表一个单独的重复。数据表示为均值 ± sem. ***p < 0.001，未配对的学生 t 检验。可以在 S1 数据中找到基础数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s011 （TIF） S1 表。 S8A 中所示的 722 个 DEG 列表图 1。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s012 （XLSX） S2 表。 S8B 图 336 所示的 336 个 DEG 的列表。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s013 （XLSX） S3 表。 S8C 图 2,653 个 DEG 的列表。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s014 （XLSX） S4 表。 图 7C 中所示的 271 个 DEG 的列表。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s015 （XLSX） S1 Raw 图像。 支持文章图表和支持信息文件中的所有印迹结果的原始未裁剪图像。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s016 （PDF格式） S1 数据。 图 1-8 和 S1-S11 的数据。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003163.s017 （XLSX） 确认 我们感谢 S. Bartlett 的英语编辑以及 CNIC 组织学、基因组学、生物信息学和高级成像部门提供出色的技术支持和建议。CNIC 得到了西班牙科学和创新部 （Ministerio de Ciencia e Innovación） 和 Pro-CNIC 基金会的支持;CBM 得到了 Consejo Superior de Investigaciones Científicas、Universidad Autónoma de Madrid 和 Fundación Ramón Areces 的支持。CBM 和 CNIC 是北奥乔亚卓越中心（分别为 CEX2021–001154-S 和 CEX2020–001041-S）。 引用 1.Curci JA.挖掘主动脉的“土壤”以了解腹主动脉瘤的生长。脉管的。2009;17 增刊 1（增刊 1）：S21-9。PMID：19426606 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 2.费迪南德 KC、哈里森 D、约翰逊 A.NEW-HOPE 研究和针对难以控制和顽固性高血压的新兴疗法。Prog Cardiovasc Dis. 2020 年;63(1):64–73.PMID：31923435 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 3.Touyz RM、Alves-Lopes R、Rios FJ、Camargo LL、Anagnostopoulou A、Arner A 等人。高血压患者的血管平滑肌收缩。心血管研究 2018;114(4):529–39.PMID：29394331 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 4.Brown IAM、Diederich L、Good ME、DeLalio LJ、Murphy SA、Cortese-Krott MM 等人。高血压传导动脉和阻力动脉中的血管平滑肌重塑。动脉凝血血栓血管生物学 2018;38(9):1969–85.PMID：30354262 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 5.Savoia C、Burger D、Nishigaki N、Montezano A、Touyz RM. 血管紧张素 II 和高血压中的血管表型。专家 Rev Mol Med. 2011;13：e11.PMID：21450123 查看文章PubMed/NCBI谷歌学术 6.介导血管紧张素 II 在血管平滑肌细胞中生理和病理生理作用的信号转导机制。药理学修订版 2000;52(4):639–72.PMID：11121512 查看文章PubMed/NCBIGoogle Scholar 7.Esteban V, Méndez-Barbero N, Jiménez-Borreguero LJ, Roqué M, Novensá L, García-Redondo AB, et al. 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