厦门免费医学论文发表-胆碱能传递的神经肽能调节丧失诱导肌肉细胞稳态补偿以保持突触强度
邵佳杰，雅娜·利瓦尔德，瓦格纳·斯图尔·科斯塔，克里斯蒂安·鲁塞，延斯·格鲁伯，穆罕默德·贾姆谢扎德，沃尔夫·格布哈特，亚历山大·戈特沙尔克
抽象
神经肌肉接头 （NMJ） 的化学突触传递受运动回路电活动的调节，但也可能受神经调控的影响。在这里，我们评估了神经肽信号转导在秀丽隐杆线虫 NMJ 功能可塑性中的作用。我们表明 CAPS （Ca2+分泌依赖性激活蛋白）直系同源物 UNC-31 调节致密核心囊泡的胞吐作用，影响突触前和突触后的功能特性，以及 NMJ 介导的运动。尽管诱发乙酰胆碱 （ACh） 传递减少，但 unc-31 的丢失导致对突触前刺激的反应更强烈，即增强肌肉收缩和 Ca2+瞬 变。根据表达谱，我们鉴定了参与胆碱能 （FLP-6、FLP-15、NLP-9、NLP-15、NLP-21 和 NLP-38） 和 GABA 能运动神经元 （FLP-15、NLP-15） 的神经肽，介导 NMJ 的正常传递。在没有这些肽的情况下，神经元无法响应增加的 cAMP 信号转导而上调其 ACh 输出;对于 FLP-15;NLP-15 双突变体，我们观察到突触后电流总体增加，表明这些神经肽可能具有抑制性。我们还鉴定了由 aex-5/kpc-3 和 egl-3/kpc-2 编码的前蛋白转化酶，它们协同作用产生这些神经肽。我们提出，由肌肉激活增加介导的突触后稳态缩放，可能是通过兴奋性，可能会补偿受神经肽信号传导影响的突变体中胆碱能传递的减少，从而维持净突触强度。我们表明，在没有 UNC-31 的情况下，肌肉兴奋性是通过上调肌肉 L 型电压门控 Ca 的表达来调节的2+频道 EGL-19。我们的结果揭示了神经肽能调节在突触可塑性中的作用，将突触前传递的变化与肌肉兴奋性的代偿性变化联系起来。
数字
图 10图 1图 2图 3图 4图5图 6图 7图8图 9图 10图 1图 2图 3
引文： Shao J， Liewald JF， Steuer Costa W， Ruse C， Gruber J， Djamshedzad MS， et al. （2025） 胆碱能传递的神经肽能调节丧失诱导肌肉细胞稳态补偿以保持突触强度。公共科学图书馆生物学23（5）： e3003171 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171
学术编辑： Mark J. Alkema，美国马萨诸塞大学陈氏医学院
收到： 2024 年 9 月 17 日;接受： 2025 年 4 月 17 日;发表： 5月 8， 2025
版权所有： © 2025 Shao et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有相关数据均在论文的图表和补充图表中提供，数字数据在每个主要图表的支持 S1 数据到 S9 数据中提供，在补充图表的 S1 数据集中提供，每个补充图表都有单独的选项卡。
资金： 这项工作由德国研究基金会 （DFG） 资助，CRC1080项目 B02 （https://gepris.dfg.de/gepris/projekt/227591453），并得到歌德大学 （（https://www.uni-frankfurt.de/49115505） 的核心支持，两者都是 A.G. C.R. 是研究员（Kekulé 津贴，K 215/54;https://www.vci.de/fonds/stipendien/kekule-stipendium/seiten.jsp）Fonds der Chemischen Industrie （FCI） 的。资助者对研究内容没有影响。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
缩写： ACh、 乙酰胆碱;疼痛 ACh 酯酶;援助 生长素诱导的降解;AP、 动作电位;DCV， 致密的核心囊泡;IPTG， 异丙基-β-d-硫代半乳糖-吡喃糖苷;MNs， 运动神经元;mPSCs， 微型突触后电流;MWT， Multiworm 跟踪器;nAChRs， 烟碱乙酰胆碱受体;NGM， 线虫生长培养基;NMJ， 神经肌肉接头;个人电脑 前蛋白转化酶;PSCs， 突触后电流;SVs， 突触囊泡;vAChT， 囊泡型 ACh 转运蛋白;VGCCs， 电压门控 Ca2+渠道;wt / 野生型
介绍
NMJ 的化学突触传递是由运动神经元 （MN） 和运动前中间神经元网络编排的，并涉及模式的产生，因此可以发生协调运动和运动 [1,2]。MN 电活动模式导致突触小泡 （SVs） 融合和神经递质释放 [3]。SV 融合的速率取决于突触末梢去极化的程度和持续时间，这会触发电压门控 Ca2+通道 （VGCC） [4]。它还取决于从储备池中动员 SV，因此去极化可以以更高的速率导致 SV 融合。这些机制使突触传递的调节具有可塑性，并且还使突触前稳态放大成为可能[4–10]。这可能发生在递质输出异常的情况下，或者当神经递质检测受损时，对突触后侧的逆行信号（减少或缺失）做出反应。这在果蝇的神经肌肉接头 （NMJ） 中得到了很好的表征 [11–13]。还有一些机制涉及突触后稳态缩放，以响应低于正常的突触前递质释放。例如，使用河豚毒素长期阻断突触前放电，或通过 GABA 阻滞剂增加突触前放电，分别导致微型突触后电流 （mPSC） 振幅增加或减少 [14]。然而，也可能有其他突触后机制响应突触前递质释放的慢性减少。
线虫秀丽隐杆线虫的 NMJ 包括直接支配肌肉的胆碱能 MN 和 GABA 能 MN。此外，支配腹侧肌肉的胆碱能神经元也突触到 GABA 能神经元上，支配背肌，以使身体弯曲发生;这种拓扑结构也以相反的方式发生，由不同的MN子集组成[15]。对胆碱能神经元的 GABA 能反馈由 GABA 介导B受体 [16,17]。光遗传学刺激实验表明，胆碱能MNs在重复或长时间刺激后脱敏，而GABA能神经元似乎被增强[16,18–20]，从而表现出急性突触前可塑性。神经肽通过神经肽进行另一层调节，神经肽响应光遗传学 cAMP 的产生而释放，并以自分泌方式引起 SV 的 ACh 含量的调节 [21]。另一篇出版物描述了当ACh酯酶（AChE）功能受到抑制时突触前胆碱能输出的调节，这种调节涉及从本体感觉神经元DVA释放的神经肽[22]。此外，突触后反馈机制导致突触前传递的调节。其中一种机制是通过 microRNA（由 mir-1 编码）介导的，该 microRNA 调节突触后 nAChR 表达，但也调节突触前 ACh 释放;后者涉及突触后神经肽的细胞外切割，该神经肽响应过量的 ACh 信号转导从肌肉表面释放，并抑制突触前 CaV2 通道和 SV 蛋白 RAB-3 的丰度 [23–25]。肌肉如何响应改变的 ACh 信号传导（在这种情况下，胆碱能信号增加）以诱导这些变化尚不清楚，但涉及 MEF-2 转录因子的调节 [23]。肌肉是否以可塑性方式对突触前 ACh 信号传导减少的反应尚不清楚。
光遗传学诱导的 cAMP 信号转导，使用胆碱能神经元中的光激活腺苷酸环化酶 bPAC，导致 SV 融合速率增加，但也增强神经肽的释放 [21]。这些神经肽的主要作用方式是通过 vAChT（由 unc-17 编码）突触前促进 ACh 填充到 SV 中。这在 mPSC 水平上很明显，mPSC 水平表现出 mPSC 速率和振幅增加，并且通过电子显微镜观察到的 SV 大小表明 bPAC 刺激迅速诱导 SV 直径增加。在缺乏致密核心囊泡 （DCV） 融合所需的 CAPS 的 unc-31 突变体中，神经肽的释放在很大程度上被消除，mPSC 振幅的增加不存在，并且这些动物具有较小的 SV 直径。在 unc-31 突变体中，NMJ 的突触传递在很大程度上减少，因为与野生型相比，电或光遗传学诱发的 ePSC 在统计学上显著更小 [26,27]。这与这些动物中的 SV 含有较少 ACh 的想法一致。介导 NMJ 这种调节的神经肽的身份尚不清楚，尽管本体感觉神经元 DVA 释放的 NLP-12 神经肽 [28] 先前已被证明会影响 NMJ 的胆碱能信号传导，并有助于突触前可塑性 [22]。用 AChE 抑制剂涕灭威治疗的动物显示出突触传递的稳态上调，这取决于在胆碱能神经元中表达的神经肽受体 CKR-2。近年来，单细胞 RNAseq 数据鉴定了秀丽隐杆线虫 MN 中表达的神经肽和神经肽受体，以及同源神经肽/神经肽受体对的功能分析 [29–32]。
在这里，我们对候选神经肽进行了功能探测，并分析了神经肽信号传导的缺乏如何影响 NMJ。我们使用行为测定和候选突变体鉴定了几种在胆碱能和 GABA 能 MNs 中表达的神经肽参与 cAMP 调节的胆碱能传递。NLP-9 和 NLP-38 是胆碱能 mPSC 振幅的增强剂，而 FLP-15 和 NLP-15 则传递来自 GABA 能神经元和可能的胆碱能神经元的抑制。我们显示了其他神经肽（和神经肽受体）的参与，这些神经肽依赖于四种前蛋白转化酶 （PC） 中的两种 AEX-5 和 EGL-3 的加工，其中 AEX-5 在 GABA 能神经元中特别需要。缺乏这些神经肽会导致肌肉中 ACh 反应的突触后稳态放大。这不是通过调节 ACh 受体而受到影响，而是通过增加 L 型 VGCC EGL-19/CaV1 的表达而受到影响。神经肽信号的缺乏诱导产生更大的肌肉动作电位 （AP），因此肌肉上调其兴奋性以平衡突触前 ACh 释放减少。
结果
胆碱能和 GABA 能神经元需要 UNC-31/CAPS 在 NMJ 处进行正常的突触传递
为了确定功能上参与 NMJ 传递的 cAMP 调节的神经肽，我们首先测试了不同的方法。我们在野生型 （wt） 和 unc-31 （n1304） 突变动物中使用了行为测定，并结合胆碱能 MN 的光遗传学 bPAC 刺激。首先，我们测定了爬行运动速度 [33]，其次，我们测量了体长作为肌肉张力的读数 [18]，第三，我们量化了 Ca2+突触后肌肉中的瞬变，使用基因编码的荧光 Ca2+RCaMP 指标 [34]（图 1A–1F）。胆碱能 MNs 中 bPAC 的急性激活诱导爬行动物的速度显著增加 [21]（图 1A 和 1B）。在 wt 动物中观察到的速度增加是稳健的，但在 unc-31 中显着更大 （无效等位基因 n1304 和 e928 基本上具有相同的表型）。根据腹侧脊髓胆碱能 MN 中的 bPAC：：YFP 信号判断，unc-31 突变体中的 bPAC 表达不受影响 （S1A 和 S1B 图）。bPAC 激活进一步伴随着轻度的身体收缩（图 1C 和 1D），这可能是由于运动诱导过程中体壁肌肉 （BWM） 的协调活动。在该测定中，unc-31 突变体显示基础运动速度大大降低，正如之前观察到的那样 [35]，这可能是由于整个神经系统神经肽信号传导的一般缺陷。然而，这种表型也可能更具体地是由于 unc-31 突变体在 NMJ 处诱发电调释放的 ACh 减少 [26,27]（S1C 和 S1D 图）。因此，我们预计响应 unc-31 动物 bPAC 激活的运动速度增加幅度较小。然而，出乎意料的是，它们的速度增加了得多（几乎达到了 wt 动物的绝对速度水平;图 1A 和 1B），以及更大的伴随肌肉收缩（图 1C 和 1D）。鉴于 unc-31 动物的诱发电流要小得多，mPSC 也更小（S1C 和 S1D 图），这种速度增加的程度令人惊讶。代偿性变化可能增加了肌肉对胆碱能传递减少的反应，我们之前观察到的影响突触前递质释放的突变体的一种表型 [18]。与行为结果一致，突触前 bPAC 光激活导致肌肉 Ca 更强劲地增加2+水平，通过 unc-31 突变体中的 RCaMP 测量，与 wt 相比（图 1E 和 1F）。这表明 ACh 信号转导减少导致肌肉 Ca 增加2+流入。作为第四种检测方法，为了测试突触后肌肉是否可能通过增加兴奋性来收缩更多 [18]，我们使用了通过 BWM（pmyo-3 启动子）表达的通道视紫红质-2 （ChR2） 的直接光遗传学去极化;ChR2 的表达不受 unc-31 突变的影响;S1E 和 S1F 图）。野生型动物在光刺激下显示身体收缩约体长的 5%（图 1G 和 1H）。事实上，unc-31 突变体 （e1304 和 e928） 显示出统计学上显着增强的身体收缩约 7.5%。为了验证这是由于神经元释放的神经肽丢失所致，我们在 BWM 或泛神经元（prab-3 启动子）中拯救了 UNC-31 [35]。正如预期的那样，UNC-31 功能在神经元中被挽救，但在肌肉中未被挽救（图 1G 和 1H）。
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图 1. UNC-31/CAPS 在胆碱能和 GABA 能神经元中发挥作用，以调节 NMJ 的突触传递。
（一、二）在多蠕虫追踪 （MWT） 设备上测量 bPAC 转基因动物（使用 unc-17 启动子表达胆碱能表达）的爬行速度 [33]。蓝条表示 5 秒的蓝光照明周期。从 50 到 100 s 的平均速度取为基础速度 V0从 100 到 120 秒为 V1.ΔV，如图 B 所示，表示 V 之间的差异0和 V1.比较了 wt （n = 60–80， N = 12）、unc-31 （n1304） （n = 60–80， N = 9） 和 unc-31 （e928） 突变体 （n = 60–80， N = 11）。强度为 70 μW/mm2在整个研究过程中，蓝光用于 bPAC 刺激。（C、D）在胆碱能神经元中 bPAC 激活之前、期间和之后沿单个动物中线测量（诱导的）体长变化。将蠕虫的绝对长度值（以像素为单位）归一化为照明前的平均值（0-4 秒，对每只动物进行归一化）以获得呈现的相对体长。图 D 中的数据表示图 C 所示的整个照明周期 （5–45 s） 的平均值。蓝色条表示 5 至 45 秒的蓝光照明。 unc-31，n = 15）。 （E， F）在体壁肌肉细胞中使用基因编码的荧光指示剂 RCaMP 进行钙成像，通过 bPAC 刺激胆碱能神经元而增加诱发。RCaMP 信号归一化为 ΔF/F0，其中 F0表示蓝光照射前前 40 s 的平均信号，ΔF 表示荧光信号 F 和 F 之间的差异0.最大 ΔF/F0表示 bPAC 刺激后观察到的最大信号。蓝色条表示 45 至 50 秒的蓝光照明。（wt，n = 14;unc-31，n = 9）。 （G-J）使用 0.1 mW/mm 测量肌肉 ChR2 激活诱导的体长2蓝光刺激。通过分别在 unc-31 （n1304） 突变体的肌肉或神经元中特异性表达 UNC-31 进行 unc-31 拯救（G 和 H;每组测试的动物数量分别为：n = 38、21、23、21、15，从左到右），以及胆碱能或 GABA 能神经元，分别在两种神经类型中同时表达（I 和 J;每组测试的动物数量： n = 62、58、21、34、25，从左到右）。蓝条表示 5-15 秒的蓝光照明。（K、L）使用 0.065 mW/mm 测量 UNC-31 耗竭后肌肉 ChR2 激活诱导的体长2蓝光刺激。比较生长素或乙醇处理的动物。每组测试的动物数量：n = 36、40、21、19，从左到右。蓝条表示 5-15 秒的蓝光照明。图 H、J 和 L 中的数据分别代表图 G、I 和 K 中所示的整个照明周期 （5-15 s） 的平均值。所有数据均以均值 ± SEM 表示。分别使用未配对 t 检验和单因素方差分析与 Tukey 校正确定两组数据集和多组数据集比较的统计显着性。*、**、*** 和 **** 分别表示 p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001 和 p < 0.0001。数值数据可以在 S1 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g001
神经肽信号传导影响 NMJ 处的 ACh 释放 [21]。由于 UNC-31 会影响许多（如果不是大多数）神经肽的释放，并且由于 NMJ 上不同的胆碱能 MN 和 GABA 能 MN 类别相互反馈 [2,15–17]，因此影响胆碱能信号传导的特定神经肽的来源可能不是胆碱能神经元。因此，我们确定了 UNC-31 在这种情况下的作用位点。UNC-31 主要在腹侧、背侧和下侧神经索中表达 [35,36]。UNC-31 在胆碱能和 GABA 能神经元中的表达可以部分挽救增强的身体收缩，但只有当它在两种细胞类型中表达时，才能观察到完全挽救（图 1I 和 1J）。这些结果表明，胆碱能和 GABA 能神经肽都有助于 NMJ 的正常信号传导。
为了确认 UNC-31 调节肌肉收缩的必要性，我们使用生长素诱导降解 （AID） 选择性地耗尽了它 [27]。用生长素连续处理的蠕虫显示出与用乙醇（生长素的稀释剂）处理的动物相似的相对体长，光强度为 0.1 mW/mm2： 乙醇： 0.944 vs 生长素： 0.945 （S1I 和 S1J 图）。UNC-31 消耗可能不足，与 unc-31 突变体相比，仅导致收缩适度增加。因此，由于强烈的刺激，任何差异都可能被掩盖了。因此，我们应用了较温和的光刺激 （0.065 mW/mm2).现在，与对照组相比，生长素处理导致 ChR2 诱导的肌肉收缩在统计学上显着增强（图 1K 和 1L）。因此，胆碱能神经元中 unc-31 的缺失可能通过影响突触后兴奋性来增强收缩。观察到的效果可能是在发育过程中对突触前变化的反应引起的，也可能是突触信号改变的更剧烈的影响，这也会出现在发育后。为了区分这些可能性，我们将生长素或乙醇急性施用到成虫身上 5 小时。生长素使 UNC-31 水平在统计学上显着降低，但乙醇暴露没有降低 UNC-31 水平 （S1G 和 S1H 图），但 ChR2 诱导的收缩是正常的 （图 1K 和 1L）。这表明 UNC-31 耗竭后成人的肌肉兴奋性没有改变。总的来说，这些结果表明，胆碱能神经元在发育过程中或 >5 小时内必须不存在 UNC-31 才能诱导增强的肌肉收缩。
AEX-5 和 EGL-3 前蛋白转化酶是 NMJ 神经肽信号转导所必需的
由于 UNC-31/CAPS 是 DCV 胞吐作用所必需的，DCV 可以包含不同类别的神经肽和单胺 [36–38]，因此我们询问是否可能涉及不同的神经肽亚类。不同细胞类型中对不同神经肽前体加工酶的需求可能为哪些神经肽可能参与 NMJ 调节提供线索。神经肽前体被 PC 和羧肽酶加工，以获得成熟和活跃的神经肽 [39–41]。因此，我们比较了四种已知的秀丽隐杆线虫 PC 的 wt 和突变体的诱发肌肉收缩。其中，aex-5/kpc-3、bli-4/kpc-4 和 kpc-1 编码具有切割序列 R-X-X-R 的人 PC1 同源物，而 PC2 同源物 EGL-3/KPC-2 对 RR 或 KR 序列后的切割具有特异性 [42]（S1 表）。在 BWM 的 ChR2 激活期间，与 wt 相比，aex-5/kpc-3 突变体表现出统计学上显着增强的肌肉收缩，而 egl-3/kpc-2 突变体表现出轻微的、不显着的增加，而 kpc-1 和 bli-4/kpc-4 突变体表现出未改变的收缩（图 2A 和 2B）。然而，在同一测定中，AEX-5 突变体不像 UNC-31 突变体那样受到损害。在较温和的刺激下，aex-5 突变体还表现出增强的诱发肌肉收缩 （S2A 和 S2B 图），这可以通过恢复其自身启动子的 aex-5 表达来挽救。我们研究了 aex-5 是否与 egl-3 在调节 NMJ 信号传导中协同作用。aex-5;EGL-3 双突变体显示出加法效应，身体收缩完全概括了 unc-31 突变体表型（图 2C 和 2D），表明两种酶共同处理一组正常 NMJ 信号传导所需的神经肽，其中 aex-5 起主要作用。
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图 2. 前蛋白转化酶 AEX-5 和 EGL-3 是 NMJ 神经肽能信号转导所必需的。
（一、二）使用 0.1 mW/mm 测量肌肉 ChR2 激活诱导的体长2蓝光刺激。照明期间时间段的 SEM 和组数据的平均±。将单个突变体 aex-5 （sa23） （n = 41）、bli-4 （e937） （n = 23）、kpc-1 （gk8） （n = 31）、egl-3 （gk238） （n = 32） 和 unc-31 （n1304） （n = 58） 与 wt （n = 60） 进行了比较。（C， D） 如突变体 aex-5 （n = 12）、egl-3 （n = 15）、unc-31 （n = 22） 和 aex-5 的 （A， B） 中所示;egl-3 （n = 13） 双倍，与 wt （n = 21） 进行了比较。请注意，使用与图 A 中相同的 wt 对照数据。（E-H） 使用 65 μW/mm 测量肌肉 ChR2 激活诱导的体长2蓝光刺激。通过分别在胆碱能神经元和 GABA 能神经元中特异性表达 AEX-5 和 EGL-3 来拯救 aex-5 （E， F） 和 EGL-3 （G， H）。在 E、F 中测试的动物数量：n = 35、24、14、24 和 G、H：n = 40、45、27、29 分别从左到右。在每个面板中，蓝色条表示 5-15 秒的蓝光照明。图 B、D、F 和 H 中的数据分别代表图 A、C、E 和 G 中所示的整个照明周期的平均值。所有数据均以均值± SEM 表示。使用带有 Tukey 校正的单向方差分析确定多组数据集比较的统计显着性。*、** 和 **** 分别表示 P < 0.05、P < 0.01 和 P < 0.0001。数值数据可以在 S2 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g002
AEX-5 在肠道中处理一种肽，该肽被释放以调节排便运动程序 [39,43,44]。据报道，AEX-5 还可调节 NMJ 处 AEX-1 依赖性逆行信号传导 [45]、脂肪代谢 [46] 和病原体回避 [47]。我们确定了 AEX-5 是否也在胆碱能和 GABA 能神经元中发挥作用。通过恢复 AEX-5 在 GABA 能中的表达来挽救 aex-5 突变体的肌肉收缩表型，但在胆碱能神经元中没有挽救（图 2E 和 2F）。此外，我们检测到 GABA 能神经元分泌 AEX-5，这可以在腔细胞中观察到，腔细胞是通过大量内吞作用捕获释放的神经肽和 PC 的清道夫细胞 [44,48]（S2C 图）。这些发现表明，不仅胆碱能而且 AEX-5 依赖性 GABA 能神经肽信号转导也参与调节 NMJ 功能。我们进一步分析了需要 EGL-3 功能的细胞类型。这表明 EGL-3 在胆碱能和 GABA 能神经元中的表达都恢复了 wt 表型，而在胆碱能神经元中的拯救似乎更有效（图 2G 和 2H）。因此，影响 NMJ 信号传导并依赖于 EGL-3 的神经肽可能同时存在于胆碱能和 GABA 能 MN 中。
作用于 NMJ 的神经肽的功能筛选
我们接下来想确定影响胆碱能信号传导和/或突触后对 ACh 释放反应的神经肽。由于效应量大，为此我们选择了运动速度测定 （胆碱能神经元中的 bPAC，探测神经元输出）。我们首先测试了在 egl-3、aex-5 和相应的双突变体中是否也会检测到神经肽亚类的缺失，并将它们与 unc-31 等位基因进行了比较（图 3A 和 3B）。观察到最明显的效果是 aex-5;egl-3 双突变体。EGL-3 突变体与测试的 UNC-31 等位基因一样受到影响，而 AEX-5 具有较温和的表型，但也表现出比 WT 动物明显更大的速度增加。接下来，我们解决了单个神经肽突变体或这些突变体的组合，以及一些神经肽受体。可能的表达模式基于 mRNA，而不是实际的（促）蛋白，是从 scRNAseq 数据库中提取的 [29,30]（S3A 图）。基于这些数据，我们选择了胆碱能 MNs 中 mRNA 含量最高的神经肽，即 FLP-6 （尽管仅在 VC 神经元中表达）、FLP-9、FLP-18、NLP-9、NLP-13、NLP-15、NLP-21 和 NLP-38。我们还包括了在 GABA 能神经元中表达的神经肽，这些神经肽可能同样影响 NMJ 信号传导和/或兴奋/抑制平衡，即 FLP-15，但也包括 FLP-9 和 NLP-15，后者也在胆碱能神经元中表达。此外，我们纳入了在本体感觉尾神经元 DVA 中表达的 NLP-12，因为之前显示这会影响胆碱能 MN 并影响身体弯曲;DVA本身也是胆碱能的[22,28]。有趣的是，FLP-15 在 DVA 中也非常丰富。最后，我们纳入了其中一些神经肽的受体，如括号中所示：DMSR-7 （许多FLP神经肽）、NPR-18 （NLP-9）、SPRR-1 （NLP-42，阴性对照）和SPRR-2 （NLP-38） [31,32,49,50]。我们测试了这些动物的基础运动和对 bPAC 激活的反应（图 3C 、 3D 和 S3B）。unc-31 突变体表现出非常缓慢的运动。同样，其中 9 个突变体的运动明显慢于 wt，而 flp-9 突变体更快，其余 7 个突变体与 wt 没有差异（图 3C）。接下来，我们评估了 bPAC 光活化后的速度增加（图 3D 和 S3B）。与 wt 相比，11 个突变体和 2 个测试的 unc-31 等位基因显示出（统计学上）显着更高的速度增加，而 6 个突变体的速度增加没有显着差异。unc-31 突变体的速度增加非常强烈，flp-6、flp-15、nlp-9、nlp-12、nlp-15、nlp-21、nlp-38 以及几个双重或三重突变体的速度增加在统计学上比 wt 更明显（图 3D 和 S3B).这还包括 NLP-9 神经肽的 NPR-18 受体，但不包括其他神经肽受体。在 GABA 能神经元中高度表达的神经肽中，flp-15 和 nlp-15 以及 flp-15;nlp-15 双突变体表现出更快的速度增加（图 3D 和 S3B），表明这两种神经肽有助于调节 NMJ 传递。总之，我们测试的几种神经肽缺乏部分表型复制的 unc-31 突变体。可能，结合所有这些神经肽突变体可能会完全概括 unc-31 表型。
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图 3. 影响 NMJ 胆碱能传递的神经肽/受体基因的候选筛选。
（公元 - 丁）胆碱能 bPAC 激活诱导的爬行速度的测量。测试前蛋白转化酶突变体 （A、B） 和富含胆碱能的神经肽突变体 （C、D）。平均速度轨迹 （A）、神经肽突变体的基础速度比较 （C） 和速度增加比较 （ΔV = V1− V0） 在指定基因型（WT、Aex-5、EGL-3、Aex-5;EGL-3、UNC-31（N1304）、UNC-31（E928） N = 60–80、N = 18、8、8、7、7、11 in（A、B））的动物中 bPAC 激活 （B、D） 以及 WT、NLP-9、NLP-38、SPRR-2、SPRR-1、FLP-6、NPR-18、NLP-13、NLP-21、NLP-9;NLP-21、FLP-9、FLP-18、UNCP-31（N1304）、NLP-12、UNC-31（E928）、NLP-15、FLP-15、 FLP-15 的;NLP-15 的;NLP-9 的;NLP-21 的;显示了 （C， D） 中的 NLP-38、DMSR-7、n = 60–80、N = 20、8、4、6、6、6、8、5、2、3、5、3、9、6、11、8、10、8、14、8）。有关在 C、D 中产生组数据的平均速度轨迹，请参见 S3B 图 3。蓝色条表示 5 s 蓝光照明，70 μW/mm2.所有数据均以均值± SEM 表示。使用带有 Tukey 校正的单向方差分析确定多组数据集比较的统计显着性。*、**、*** 和 **** 分别表示 p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001 和 p < 0.0001。数值数据可以在 S3 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g003
胆碱能神经元中 NLP-9 和 NLP-38 的缺失会影响胆碱能信号传导
胆碱能神经元中缺乏许多丰富的神经肽具有统计学意义的影响，包括 FLP-6、FLP-9、NLP-9、NLP-12、NLP-15、NLP-21 和 NLP-38。NLP-12 之前已经被研究过 [22]，FLP-6 仅在 VC 神经元中表达。NLP-21 被广泛用作胆碱能细胞中 DCV 的标志物 [21,48]。因此，由于 NLP-9 受体已知 （NPR-18），我们专注于更详细地测试 NLP-9、NLP-21 和 NLP-38 神经肽在胆碱能传递中的参与。首先，我们旨在证明这些神经肽对整体胆碱能输出的充分性。在 nlp-38 和 nlp-9 突变体中夸大的 bPAC 诱导的速度增加（约 unc-31 突变体速度增加的 50%）通过它们自己的启动子的表达得到挽救（图 4A 和 4B）。接下来，我们使用 ChR2 更直接地测试肌肉激活。使用 0.1 mW/mm 的光强度2，nlp-9 突变体显示出与 wt 相似的相对体长（S4A 和 S4B 图）。我们推断，wt 和 nlp-9 突变体之间的差异可能由于强烈的刺激而被掩盖，如生长素实验中观察到的那样（S1I 和 S1J 图）。因此，我们应用了较温和的刺激 （0.065 mW/mm2），因为我们之前观察到 snb-1 突变体在这种强度下的肌肉收缩显著增强 [18]。在这些条件下，nlp-9 突变体表现出增强的肌肉收缩 （wt 0.965 相对体长与 nlp-9 为 0.93，图 4C 和 4D）。因此，我们将这种刺激条件应用于所有其他突变体分析。与 wt 相比，nlp-38 突变体也显示出增强的肌肉收缩（图 4C 和 4D），这也在 nlp-9、nlp-21、nlp-38 三重突变体中观察到。然而，在收缩试验中，三重突变体的影响不如 unc-31 突变体（取决于刺激强度;S4A 和 S4B 图），而在速度增加试验中，它与 nlp-21 一起是最强的突变体（图 3D 和 S3B）。这表明这些神经肽的功能之间存在复杂的相互作用，而不仅仅是加法。
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图 4. 胆碱能神经元中 NLP-9 的缺失诱导增强的诱发肌激活。
（一、二）在指定的基因型中比较胆碱能 bPAC 激活诱导的爬行速度。蓝色条表示 5 秒蓝光照明 （70 μW/mm）2).NLP-9 和 NLP-38 突变体拯救是通过在它们自己的启动子下特异性表达 NLP-9 和 NLP-38 来实现的。每组测试的动物数量分别为：n = 60-80，n = 16、8、5、8、6、4，从左到右。 （C、D）身体收缩，由 muscle：：ChR2 激活诱导，使用 65 μW/mm2在指定的基因型 （WT、NLP-9、NLP-38、NLP-9;NLP-38、NLP-9;NLP-21、NLP-38、UNC31、N = 53、57、38、25、27、26）中比较蓝光刺激。（E， F）如 （C， D），对于指定的基因型。通过在胆碱能和 GABA 能神经元中特异性表达 NLP-9 来挽救 NLP-9 突变体。每组测试的动物数量：n = 20、22、18、22，从左到右。（G、H）如 （C， D），对于指定的基因型 （wt， nlp-9， npr-18， nlp-9;npr-18， unc-31， n = 57， 63， 60， 41， 26）。（我，J）除胆碱能神经元外，在 GABA 能神经元中表达的候选神经肽的评估方式为 （C， D）：flp-15 （n = 45） 和 nlp-15 （n = 47）、flp-15;nlp-15 （n = 25）、unc-31 （n = 22） 与 wt （n = 45） 相比。蓝条表示 5-15 秒的蓝光照明。图 D、F、H 和 J 中的数据分别代表图 C、E、G 和 I 中所示的整个照明周期的平均值。所有数据均以均值± SEM 表示。使用带有 Tukey 校正的单向方差分析确定多组数据集比较的统计显着性。**、*** 和 **** 分别表示 p < 0.01、p < 0.001 和 p < 0.0001。数值数据可以在 S4 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g004
细胞类型特异性拯救实验表明，NLP-9 足以用于胆碱能 MN 的正常诱发肌肉收缩，但不是 GABA 能 MN 的正常诱发肌肉收缩（图 4E 和 4F;肌肉收缩;S4C 和 S4D 图;bPAC 诱导的速度增加）;对于 NLP-38，在测试 bPAC 诱导的速度增加后，我们没有观察到细胞类型特异性的拯救（S4E 和 S4F 图）。我们评估了两个神经肽前体基因的表达模式。虽然 NLP-9 与囊泡 ACh 转运蛋白 （vAChT） UNC-17 的表达模式完全重叠（S5A 图），但 nlp-38 转录仅在胆碱能 MNs 的一个子集中显示出更受限的模式（S5B 图）。据报道，NPR-18 是 NLP-9 调节趋化行为的受体 [49,51]。与 nlp-9 突变体一样，npr-18 突变体表现出增强的诱发肌肉收缩（图 4G 和 4H），而 nlp-9;npr-18 双突变体没有表现出加性效应，表明它们在同一途径中起作用。npr-18 的 mRNA 表达模式尚无定论：scRNAseq 数据表明它在一小部分胆碱能神经元 VC4 和 5 中表达，这些神经元支配外阴肌肉，而不是 BWM。总之，nlp-9 在胆碱能神经元中是必需的，但在 GABA 能神经元中不需要正常的胆碱能诱发行为，并且可能被 NLP-18 受体检测到。
我们还测试了在 GABA 能神经元中表达的神经肽 FLP-15 和 NLP-15。诱发的肌肉收缩在两种突变体中均具有统计学意义，但不如 unc-31 动物多。flp-15;nlp-15 双突变体显示出不太明显的效果，尽管在统计学上仍比 wt 动物多（图 4I 和 4J）。这些非累加效应表明功能相互作用，这可能取决于这些神经肽的受体表达位置。例如，在许多神经元中表达的 NPR-3 是一种 FLP-15 受体，而 NLP-15 的受体尚不清楚 [30–32]。
NLP-9 神经肽从胆碱能神经元释放
接下来，我们想评估 NLP-9 从胆碱能神经元的释放。为此，我们在胆碱能神经元中表达了 NLP-9 前蛋白的 mCherry 标记版本，并对腔细胞进行了成像，即从体液中吸收蛋白质和其他物质的细胞（图 5A）。在这些清道夫细胞中可以观察到荧光蛋白，并且在 unc-31 突变体背景下腔细胞荧光水平强烈降低，证实了胆碱能神经元释放 NLP-9 是 unc-31 依赖性的（图 5B 和 5C）。此外，bPAC 激活导致胆碱能 NLP-9 的释放在统计学上显着增加，支持其在胆碱能信号传导调节中的作用（图 5B 和 5C）。
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图 5. NLP-9 以 cAMP 依赖性方式从胆碱能神经元中释放。
（A） 由胆碱能 MN 表达的 mCherry 标记的 NLP-9 前蛋白（使用 acr-2 启动子）分泌到体液中产生的内吞清道夫细胞（腔细胞）的荧光。比例尺 20 μm。（B） 代表性图像显示来自指定基因型的体腔细胞中的 NLP-9：：mCherry 荧光，并且有或没有蓝光刺激。比例尺 10 μm。（C） 显示每只动物中所有腔细胞的荧光定量，标准化为以 wt 为单位的信号，适用于指定的基因型，有或没有蓝光刺激。单个数据点表明单个腔细胞。测试的动物数量 n = 15、8、17、19、24，从左到右。所有数据均以均值± SEM 表示。使用带有 Tukey 校正的单因素方差分析确定统计显着性比较。* 和 *** 分别表示 P < 0.05 和 P < 0.001。数值数据可以在 S5 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g005
神经肽信号传导影响 NMJ 的 ACh 输出
接下来，我们分析了那些在 cAMP 刺激测定 （NLP-9、NLP-15、NLP-21、NLP-38、FLP-15） 中显示出显着差异的神经肽信号传导，以及影响神经肽加工的突变（AEX-5 和 EGL-3 的组合）是否影响突触输出。为此，我们记录了突触后电流 （PSC），并分析了胆碱能 MNs 的 5 s bPAC 光刺激之前、期间和之后记录的事件的频率和幅度。和以前一样，我们观察到 wt 动物中 PSC 事件的频率强劲增加，因为更多的 SV 被启动，并且振幅增加，因为 SV 充满了更多的 ACh;不过，释放仍然取决于内在的活动模式[21]（图6A-6C）。在 egl-3;aex-5 双突变体中，大多数相关神经肽似乎缺失，SV 的释放频率显着增加（每个突变体都由单个 PSC 报告;图 6A 和 6B）。然而，与 wt 相比，这有所降低，并且没有统计学意义（图 6H）。虽然 wt 动物在刺激开始后 5-10 秒内表现出 PSC 振幅的强劲增加，达到约 150%，但我们仅观察到 egl-3;AEX-5 双突变体（约 110%）（图 6A、6C、6I、S6A 和 S6B）。一些增加可能是由于（未解决的）多泡融合事件;我们仍然将这些称为 mPSC，因为潜在的 SV 融合不是由 bPAC 刺激诱发的，而是诱导的 cAMP 信号传导会影响 SV 的启动和动员速率。因此，神经元的内在活动导致每次更多的 SV 融合。在 nlp-9 突变体中，与光脉冲之前相比，振幅减小但仍明显增加。在 nlp-38 突变体以及 nlp-9、nlp-21、nlp-38 三重突变体中，振幅进一步减小，并且三重突变体没有明显加剧单个突变体的表型。总体而言，nlp-9 和 nlp-38 突变体表现出统计学上显着不同的行为 （没有振幅增加和低于 wt 的频率增加;图 6A、6D、6E、6H、6I、S6C 和 S6D）。因此，NLP-9 和 NLP-38 似乎是主要贡献者。总之，这些发现确定了 NLP-9 和 NLP-38 是 NMJ 胆碱能信号转导的调节因子，可能是通过控制 SV 的 ACh 含量 [21]。NLP-9 （很可能是 NLP-38） 以 cAMP 依赖性方式从胆碱能神经元中释放。因此，NLP-9 和 NLP-38 （以及其他神经肽） 的缺失可能会诱导代偿性变化，就像在 unc-31 突变体中一样，导致对（诱发的）ACh 释放的行为反应增强。
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图 6. NLP-9 与 NLP-38 一起影响 ACh 输出。
（A） 从指定基因型的动物的体壁肌肉中记录的 mPSC，响应胆碱能神经元的 bPAC 光刺激。显示了来自指定基因型的 mPSCs 的代表性痕迹。蓝条表示 5 秒蓝光刺激。（B-G）标准化（到光刺激前 5 秒）mPSC 速率（每秒;B、D、F） 和振幅 （pA;C、E、G），平均在 1 秒的区间中。（H， I）非归一化数据的分组数据，如 S6A–S6F 图 1 所示。显示了光刺激前 （1-30 s） 和刺激后 （31-55 s） mPSC 速率 （H） 和振幅 （I） 的平均值。请注意，在面板 B、D、F 和 C、E、G 中使用相同的 wt 对照数据。动物编号 n = 19、7、13、8、7、7，分别在 wt、aex-5;EGL-3、nlp-9、nlp-38、nlp-9、nlp-21、nlp-38 和 flp-15;nlp-15 中测试。所有数据均以均值± SEM 表示。使用双向方差分析和 Fisher 检验确定统计显着性比较。*、**、*** 和 **** 分别表示 p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001 和 p < 0.0001。数值数据可以在 S6 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g006
我们还测试了缺乏在 GABA 能（和胆碱能）神经元中表达的神经肽的动物，即 flp-15;nlp-15 双突变体。这些突变体与其他突变体的不同之处在于，它们在光脉冲之前显示出统计学上显着较大的振幅（图 6A、6F、6G、6H、6I、S6E 和 S6F）。不过，bPAC 刺激仅略微增加了振幅。这些发现表明，NLP-15 和/或 FLP-15 的活性可能正在减少正常量的 ACh 释放，或者，它们有助于胆碱能神经元释放的 ACh 水平上调和下调的正常平衡。
响应胆碱能输出量减少的突触后代偿
bPAC 光刺激和诱导的 cAMP 信号传导导致递质输出增加，基于 SV 的动员及其额外的 ACh 填充 [21]。然而，在未刺激的动物中，unc-31 突变体显示微型 PSC 振幅降低，尽管它们与 wt 动物没有显着差异（S7A 和 S7B 图），表明它需要增强的神经元活性来观察 ACh 输出的变化。如果 unc-31 和神经肽信号的缺失影响了 ACh 输出的程度，那么可以预期突触前去极化的结果也会在 unc-31 突变体中受到影响。为了研究这一点，我们使用 ChR2 光激活刺激胆碱能 MNs。先前的报道表明，与 wt 相比，unc-31 突变体中 ChR2 诱发的 [27] 和电刺激诱发的 ePSC [26] 显着降低。我们证实了这一发现，即 ChR2 在肌肉中诱发了大大减少的 ePSC（S1C 和 S1D 图）。ChR2 本身的表达不受 unc-31 突变的影响（S7C 和 S7D 图）。然而，与 bPAC 激活诱导的行为结果相反，我们与 wt 相比，观察到 ChR2 激活后 unc-31 突变体的肌肉收缩在统计学上显着增强（图 7A 和 7B）。此外，肌肉 Ca2+unc-31 突变体的增加要大得多（图 7C 和 7D）。基于这些观察结果，我们提出 unc-31 突变体中胆碱能传递的减少会诱导肌肉中的突触后代偿机制，导致肌肉收缩增强，从而增加诱发 ACh 释放的效果。因此，unc-31 突变体中较小的突触前输出可以诱导更强的肌肉反应，以稳态维持突触强度。
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图 7. unc-31 突变体中胆碱能传递减少会诱导突触后代偿。
（一、二）由胆碱能神经元中 ChR2 激活诱导的 wt （n = 17） 和 unc-31 （n1304） 突变体 （n = 10） 的体长变化。（C、D）wt （n = 12） 和 unc-31 （n1304） 突变体 （n = 11） 的 BWM 细胞中的 RCaMP 钙成像，ChR2 刺激胆碱能神经元诱发的信号增加。最大 ΔF/F0表示 ChR2 刺激后观察到的最大信号。（E， F）肌肉中 ChR2 激活诱导的 wt （n = 20） 、cha-1 （p1152） （n = 20） 和 unc-31 （n1304） 突变体 （n = 26） 的体长变化。（G、H）使用荧光电压指示剂 QuasAr 进行电压成像，在 wt （n = 13） 和 unc-31 突变体 （n = 12） 的 BWM 细胞中表达，在 ChR2 刺激胆碱能神经元诱发去极化之前、期间和之后。QuasAr 荧光信号归一化为 ΔF/F0，其中 F0是蓝光照射前前 5 秒的平均信号，ΔF 是荧光信号 F 和 F 之间的差值0.AUC （7-10 s） 表示第一个峰值 （H） 之后的刺激期间曲线下面积。有关第一个峰的分析，请参见 S7E 图 3。（我，J）从 wt （n = 10） 和 unc-31 突变体 （n = 9） 的 BWM 细胞记录的 ACh 诱发电流。显示了代表性迹线 （I） 和峰值电流 （J） 的组数据。（K、L）wt （n = 20） 和 unc-31 突变体 （n = 23） 的 BWM 细胞中的 RCaMP 钙成像，肌肉 ChR2 刺激诱发的信号。最大 ΔF/F0，ChR2 刺激后的最大信号。（M， N）在指定的基因型中比较肌肉 ChR2 激活诱导的身体收缩。n = 14、19、17、24 只动物分别对 WT、UNC-31、ACE-1、ACE-2 和 UNC-31、ACE-1、ACE-2 动物进行测试。在除 （I， J） 之外的所有实验中，使用 65 μW/mm 激活 ChR2（在胆碱能神经元或肌肉中）2蓝光照明。图 B、F 和 N 中的数据分别代表图 A、E 和 M 中显示的整个照明周期的平均值。所有数据均以均值 ± SEM 表示。两组数据集和多组数据集比较的统计显着性分别使用未配对 t 检验和单向方差分析和 Tukey 校正确定。*、** 和 **** 分别表示 P < 0.05、P < 0.01 和 P < 0.0001。数值数据可以在 S7 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g007
为了探讨这一假设是否正确，我们在胆碱乙酰转移酶 CHA-1 的功能减少突变体中重复了 bPAC 刺激实验。预计这种突变体的神经元会释放大量 ACh [52,53]。cha-1 （p1152） 动物表现出与 unc-31 突变体相同的收缩程度，表明神经元的 ACh 输出减少可以诱导肌肉的代偿性变化，从而导致突触后对去极化的反应增加（图 7E 和 7F）。测试功能增强的肌肉收缩和 Ca2+UNC-31 突变体的活性是由于膜兴奋性增加，我们使用基因编码的电压指示剂 QuasAr [54,55] 应用肌肉电压成像（图 7G、7H 和 S7C）。作为对胆碱能 ChR2 刺激的反应，与 wt 相比，肌肉中的电压依赖性荧光信号显示 unc-31 突变体的第一个峰值在统计学上显着降低（图 7G 和 S7C）。这与突触前 ChR2 或电诱发的肌肉 ePSC 振幅降低一致（S1B 图）[26,27]。然而，在剩余的刺激期 （7-10 s） 中，unc-31 突变体表现出电压变化增加（图 7G 和 7H），表明 BWM 质膜在突触前刺激期间变得更加去极化，这与增强肌肉兴奋性的想法一致。
BWM 去极化涉及两类烟碱乙酰胆碱受体 （nAChR） 的激活：异聚体、左旋咪唑敏感的 L-AChR 和同型五聚体、尼古丁敏感的 N-AChR[56]。它们被 ACh 激活触发去极化和 Ca2+通过 VGCC EGL-19 进入 [57\u201259]。可能还有 T 型 Ca2+频道 CCA-1 [57] 做出贡献。unc-31 突变体中增强的肌肉兴奋性可能不发生在 nAChRs 水平。由于 unc-31 突变体中基础 mPSC 振幅没有显着改变 [21]（S7A 和 S7B 图），这表明肌肉细胞中 nAChRs 对 ACh 的敏感性保持不变。此外，当我们将外源性 ACh 应用于 BWM 时，wt 和 unc-31 动物中诱发的（AChR 介导的）突触后电流 ePSC 无法区分（图 7I 和 7J），表明 nAChR 的表达和/或膜递送，以及它们的功能特性，保持不变。总之，unc-31 动物肌肉兴奋性的代偿性增加不是在 nAChRs 水平上诱导的。
因此，增强的肌肉兴奋性应该是在 nAChR 激活的下游引起的，这与使用 ChR2 直接肌肉兴奋的实验一致。肌肉 ChR2 激活诱发的肌肉收缩在统计学上显着增加（图 1G 和 1H）和 Ca2+与 wt 相比，unc-31 突变体的增加（图 7K 和 7L）。因此，肌肉 Ca2+作为兴奋性的代理，内流似乎在 UNC-31 突变体中增强，可能是对胆碱能传递减少的反应。为了进一步验证胆碱能传递减少和肌肉兴奋性增强之间的因果关系，我们对 unc-31 突变体中的突触前 ACh 水平进行了基因作。由 ace-1 和 ace-2 编码的 AChEs 分解突触间隙中的 ACh。因此，AChE 突变体应导致胆碱能突触中的 ACh 积累，先前的分析表明运动缺陷 [60,61]。介绍 ace-1;unc-31 背景中的 ace-2 双突变确实将增加的肌肉兴奋性恢复到 UNC-31 的 WT 水平;王牌-1;ace-2 三重突变体显示出与 wt 相似的肌肉收缩程度（图 7M 和 7N）。然而，ace-1;ace-2 双突变体与 wt 相比没有显示出显着不同的肌肉收缩，表明突触前 ACh 水平升高，与其降低相反，不会改变诱发的肌肉收缩。这与早期的报道相反，该报道描述了药理学 AChE 阻断后 ACh 输出上调 [22]。然而，这些研究人员使用了急性测定法，而在我们的实验中，使用了可能已经适应的突变体。总的来说，我们的结果表明，由于 unc-31 突变体中突触前 ACh 输出减少，肌肉兴奋性稳态增加。
突触后补偿涉及 EGL-19/CaV1 L 型 VGCC
肌肉稳态如何响应神经肽能调节的丧失？由于我们排除了 nAChRs 参与稳态机制（图 7I 和 7J），我们接下来评估了 EGL-19 L 型 VGCC。EGL-19 在突触前末梢调节自发释放的功能 [24,62]。在肌肉中，它调节 Ca2+依赖性 AP 和兰尼碱受体 UNC-68 以及肌肉收缩装置的触发 [57,58]。由于 egl-19 无效突变体是不可存活的，因此我们急性应用特异性拮抗剂 nemadipine 来抑制 egl-19 的功能 [63]。Nemadipine 治疗在统计学上显着降低了由肌肉 ChR2 激活引起的 wt 和 unc-31 突变体的肌肉收缩（图 8A 和 8B）。更重要的是，线地平处理后，unc-31 突变体表现出与 wt 的肌肉收缩没有显着差异。我们进一步证实了 egl-19 通过 RNA 干扰 （RNAi） （部分）敲低 egl-19 在调节肌肉兴奋性中的作用 [64,65]。特异性 egl-19 RNAi 消除了 wt 和 unc-31 突变体之间肌肉收缩的差异（图 8C 和 8D）。总之，这些结果表明 egl-19 可能是 unc-31 突变体中增强肌肉兴奋性所必需的，尽管这种解释很复杂，因为 EGL-19 也是肌肉收缩的主要介质。Nemadipine 治疗还减少了 wt 和 aex-5 突变体之间肌肉收缩的差异，表明 AEX-5 参与调节肌肉兴奋性 （S8A 图 和 图 8B）。最后，当我们用 ChR2 刺激突触前胆碱能神经元时，在 unc-31 突变体中观察到的增强的身体收缩被 egl-19 RNAi 降低到 wt 水平（图 8E 和 8F）。总之，我们的结果表明，神经肽能调节丧失诱导的增强肌肉兴奋性是由 EGL-19 介导的。
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图 8. EGL-19 CaV1 介导突触前 ACh 释放减少的突触后代偿。
（公元 - 丁）使用 1.1 mW/mm 的肌肉 ChR2 激活诱导的身体收缩2在指定的基因型和治疗中比较蓝光刺激。显示了应用 EGL-19 CaV1 特异性抑制剂线地平 （A、B） 和特异性 EGL-19 喂养 RNAi （C、D） 处理后的相对体长。使用 DMSO 处理的动物和喂食空载体 L4440 的动物作为对照。请注意，在我们研究的早期阶段，我们使用 30 mW/mm 的饱和光强度施加了 35 秒（1.4-35 秒）的刺激2.然而，由于蠕虫在 1 s 刺激后已经达到最大肌肉收缩，因此我们将刺激时间缩短到 10 s （5-15 s），使我们能够优化实验效率。此外，我们将刺激强度降低到 0.065 mW/mm2以更好地揭示较温和突变体的较小差异。（E， F）胆碱能神经元中 ChR2 激活诱导的身体收缩，使用 65 μW/mm2在指定的基因型或 RNAi 处理中比较蓝光。显示了特异性 egl-19 RNAi 处理后的相对体长。在 （B） 中测试的动物数量 n = 12， 12， 11， 12;（D） n = 19， 21， 25， 27;（F） n = 16、15、16、16，分别从左到右。图 B、D 和 F 中的数据分别代表图 A、C 和 E 中所示的整个照明周期 （5–35 s） 的平均值。所有数据均以均值± SEM 表示。使用带 Tukey 校正的单因素方差分析和带 Sidak 多重比较检验的双向方差分析确定统计显着性。*、*** 和 **** 分别表示 P < 0.05、P < 0.001 和 P < 0.0001。数值数据可以在 S8 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g008
EGL-19 表达在 unc-31 突变体中上调并促进突触后兴奋性
为了研究 EGL-19 通道如何响应神经肽的丢失而受到调节，并作为实现稳态补偿的一种手段，我们首先研究了它在 wt 和 unc-31 突变体中的表达水平。使用分裂的 mCherry 互补系统（Joshua M. Kaplan 的礼物）标记肌肉细胞中的内源性 EGL-19 [66–68]。我们观察到 unc-31 突变体中 mCherry 荧光的统计学显着增加，表明 EGL-19 的表达水平上调（图 9A 和 9B）。我们进行了两个额外的实验：首先，我们询问胆碱能神经肽 NLP-9 的缺乏是否足以影响肌肉 EGL-19 表达水平。然而，情况并非如此（S9A 和 S9B 图），认为它需要缺乏多种神经肽来诱导突触后改变。其次，我们询问 unc-31 对肌肉 EGL-19 水平的影响是细胞自主的，还是普遍影响 egl-19 基因表达。因此，我们量化了 EGL-19 在胆碱能和 GABA 能 MNs 中的表达。有趣的是，我们观察到胆碱能神经元中 EGL-19 水平的统计学显着上调（S9C 和 S9D 图）。相比之下，我们没有观察到 GABA 能神经元的任何变化。这些发现意味着 NMJ 的 unc-31 表型可能包括突触前和突触后成分。先前显示，胆碱能神经元中 EGL-19 水平降低会影响胆碱能 SV 融合的速率，但不会影响胆碱能 mPSC 的振幅 [62]。因此，胆碱能神经元中 EGL-19 的上调可能会增加 mPSC 率。然而，我们之前发现 unc-31 突变体的 SV 融合率降低 [21]。此外，突触后兴奋性增加可能是由于 EGL-19 上调。
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图 9. EGL-19 CaV1 在 unc-31 突变体中上调，导致突触后兴奋性增强。
（一、二）EGL-19 在肌肉细胞中的内源性表达以 wt （n = 12） 和 unc-31 突变体 （n = 16） 进行定量。代表性图片 （A;比例尺 20 μm）和摘要数据 （B）。（C、D）肌肉 ChR2 激活诱导的身体收缩，使用 65 μW/mm2蓝光刺激。比较了 wt （n = 12） 和肌肉特异性 EGL-19 过表达 （OEx） 动物 （n = 11）。图 D 中的数据表示图 C 中所示的整个照明周期 （5-15 s） 的平均值。（E-I） 在指定的基因型中比较了电流阶跃诱导的 BWM 膜电位变化。显示了 SEM 膜电位变化的平均± （E） 和汇总数据 （F）、从当前注射开始到达到峰值电位的平均时间 （G）、诱导动作电位的持续时间 （H） 和曲线下面积（250 ms 时间窗口，以峰值为中心） （I）。在 （F-I） n = 15、15、14 中测试的动物数量，从左到右分别。所有数据均以均值± SEM 表示。分别使用未配对的 t 检验、单向方差分析与未校正的 Fisher LSD 检验或 Kruskal-Wallis 检验与 Dunn 比较确定两组数据集和多组数据集比较的统计显着性。*、** 和 **** 分别表示 P < 0.05、P < 0.01 和 P < 0.0001。数值数据可以在 S9 数据中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g009
为了进一步证实 EGL-19 调节诱发的肌肉收缩，我们在肌肉中过表达它，并测量了 ChR2 激活在肌肉中诱发的体长变化。与 wt 相比，EGL-19 过表达的动物在 ChR2 激活期间表现出统计学上显着更强的身体收缩，证实 EGL-19 水平升高会诱导更高的肌肉兴奋性（图 9C 和 9D）。EGL-19 调节肌肉中的 AP [57–59]。如果 EGL-19 表达在 unc-31 突变体中上调，我们预计 AP 也会增强。与这一想法一致，为了响应膜片钳肌肉细胞中注射电流步骤 （20 pA， 50 ms），与 wt 相比，unc-31 突变体中诱导的 AP 的振幅更高（图 9E、9F 和 S9G-S9I）。然而，在过表达 EGL-19 的动物中，情况并非如此。然而，EGL-19 过表达导致肌肉对电流步骤的反应不同：电压增加开始得非常晚（图 9E、9G 和 S9G-S9I），并且 AP 持续时间更长（图 9E、9H 和 S9G-S9I）。这导致 EGL-19 过表达动物中 AP 的曲线下面积更大（图 9E、9I 和 S9G-S9I）。综上所述，这些结果表明 egl-19 可能在介导突触后代偿中发挥重要作用，突触后代偿是由突触前神经肽能调节的丧失触发的。
讨论
化学突触传递的神经肽能调节可能是一种广泛存在的现象，并且鉴于神经肽/神经肽受体系统的种类繁多，可能存在许多机制。在这里，我们分析了线虫秀丽隐杆线虫的 NMJ 如何使用神经肽来调节 ACh 的输出，可能还有 GABA，以微调传输，但也可能通常设置传输输出水平。在没有神经肽的情况下，或者当本研究中鉴定的特定神经肽种类缺失时，递质输出减少，这导致突触后收缩上调，作为肌肉兴奋性的代表。我们表明，这可能是通过 CaV1 VGCC EGL-19 的表达增加发生的。这样，神经肽的缺乏通过减少 ACh 信号传导 [21] 导致肌肉产生更大的 AP，以平衡缺失的胆碱能输入。目前尚不清楚如何实现 CaV1 的上调。它可能涉及先前发现的肌肉调节兴奋性的途径[23–25]，尽管这些途径涉及nAChRs的表达水平，我们没有发现nAChR的表达水平上调。然而，由 MEF-2 转录因子介导的基因表达也可能影响 EGL-19 表达。我们提出神经肽以自分泌方式调节突触前 ACh 输出，但是，它们也可能具有突触后作用。然而，后者似乎不太可能，除非这些肽对 （egl-19） 基因表达起抑制作用。同样，我们不知道胆碱能神经元中的自分泌神经肽信号传导如何影响 vAChT 的功能，也不知道神经肽从 GABA 能神经元到胆碱能神经元的旁分泌信号传导如何降低其活性。然而，这可能不是通过降低 cAMP 水平 （GαI/O信号传导），就像在我们的 bPAC 刺激实验中一样，胆碱能神经元中的 cAMP 水平强烈增加。
胆碱能 MN 和 GABA 能 MN 都参与 NMJ 的神经肽能调节，因为只有当 CAPS 蛋白在两种细胞类型中都表达时，才能完全挽救 unc-31 缺失。此外，仅在 GABA 能神经元中观察到 PC AEX-5 拯救。因此，NMJ 的神经肽能调节可能存在复杂的相互作用 [32]。有趣的是，双突变体 flp-15;nlp-15 除了胆碱能神经元外，还影响 GABA 能神经元中表达的神经肽，突触后 mPSC 表现出统计学上显着增加，表明它们介导抑制作用，最有可能发生在胆碱能 MN 上。MN 类别的神经肽能相互作用表现为在不同 MN 类型中表达的大量神经肽以及神经肽受体 [29,30]。其中几种神经肽（NLP-9、-12、-15、-21、-38、FLP-6、-9、-15、-18）和 NPR-18 受体的缺失影响（光遗传学诱导的）运动或肌肉收缩。对于 NLP-9 和 NLP-38，我们可以通过电生理学证明 cAMP 诱导的 mPSC 振幅增加被消除。其中一些神经肽可能是自分泌反馈回路（NLP-9、-12、FLP-6、-9、-15、-18）的一部分，因为它们与它们的同源受体一起在MNs中表达[31,32]。然而，这些肽或作为单个前体蛋白一部分的一些肽通常与许多不同的受体结合，这些受体也在神经系统的其他部分表达，这使得对结果的解释变得复杂。我们测试了 NPR-18 （NLP-9 的推定受体） 、 SPRR-1 和 SPRR-2 （NLP-38 受体） 突变的影响。只有 NPR-18 具有与 NLP-9 效应一致的效应。然而，NPR-18 mRNA [30] 的表达仅在不支配体壁肌肉的 VC4 和 VC5 神经元中发现。SPRR-2 在胆碱能神经元中也不明显表达。然而，NLP-12、CKR-1和CKR-2的受体[22,31,69]几乎在所有类别的胆碱能MN中都表达。正如我们之前所展示的，胆碱能神经元释放的神经肽（可能包括 DVA，释放 NLP-12）会影响胆碱能 SV 的充盈状态 [21]。在这里，我们鉴定了这些神经肽，因此现在可以解决神经肽受体（以及哪些）的激活如何通过 vAChT UNC-17 调节 SV 的填充。此外，我们确定了 PC AEX-5 和 EGL-3 对神经肽加工的要求。对我们研究的神经肽中预期切割位点的评估预测仅在 NLP-12 的情况下需要 AEX-5，而所有其他都需要 EGL-3 （S1 表）。然而，预计 NLP-12 不会由 GABA 能神经元表达。因此，需要更多的工作来澄清这些细节。然而，单个神经肽前体的切割特异性和对特定转化酶的需求应通过对相应突变体的蛋白质组学分析来确认[39]。
在没有神经肽的情况下，我们在肌肉中观察到的突触后代偿似乎是通过 CaV1 VGCC EGL-19 的上调发生的。与此一致，unc-31 突变体显示 AP 振幅增加。我们探索了这是否可以通过过表达 EGL-19 来模拟。虽然我们观察到肌肉收缩增加，就像在 unc-31 突变体中一样，但我们没有观察到 AP 振幅增加。然而，AP 持续时间更长，起效延迟且 AP 积分更大，表明 EGL-19 的表达水平会影响肌肉兴奋性。然而，神经肽能调节 （或不存在神经肽能调节） 可能会诱导 CaV1 通道的其他调节模式，而不是通过其过表达来模拟。此外，其他通道也可能有所贡献，例如 AP 向下冲程所需的电压门控钾通道（SHK-1、SLO-2;[57,58]），而由 unc-68 编码的 ER 驻留兰尼碱受体可能会影响 Ca 的增加2+水平。egl-19 RNAi 或线地平治疗相对温和的效果可能是由于 EGL-19 是必不可少的，因此完全敲低的动物会死亡，并且被检测的个体可能只表现出轻度消耗。以前的工作在解剖动物中使用了线虫地平[62]，显示线虫平几乎完全消除了电流和突触活动。然而，我们可能无法在完整动物中达到相当的浓度，或者必须增加量以使 DMSO 载体本身变得有毒。
总之，我们的数据与以下观点一致：胆碱能神经元和 GABA 能神经元释放的神经肽，至少部分地在胆碱能神经元中以自分泌方式起作用，但也可能存在从 GABA 能神经元到胆碱能神经元的反馈回路，以影响 ACh 的输出（图 10）。缺乏这种信号传导似乎会导致 ACh [21] 的 SV 填充减少，从而减少 unc-31 突变体中的 ACh 输出。ACh 输出减少，从而肌肉去极化减少，似乎导致 EGL-19 CaV1 表达的代偿性上调，导致更多的 Ca2+尽管来自 nAChR 的初始去极化信号较少，但仍进入。这种机制在其他动物中是否保守，将有待证明。最近，我们研究了斑马鱼幼鱼 NMJ，其中通过 bPAC 光遗传学诱导的 cAMP 增加也会导致运动行为的激活 [70]。有趣的是，缺乏羧肽酶 E 的神经肽加工突变体也显示出对光遗传学刺激的反应增加。然而，与秀丽隐杆线虫不同，这似乎受到肌肉细胞中 nAChR 表达水平的影响，而 CaV1 通道的作用尚未分析。
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图 10. 秀丽隐杆线虫 NMJ 的自分泌和旁分泌神经肽能信号传导影响胆碱能传递。
秀丽隐杆线虫的神经肌肉接头，具有胆碱能和 GABA 能运动神经元，如标记的那样，分别支配背肌和腹肌。胆碱能神经元与 GABA 能神经元和肌肉的二元突触。请注意，相同的神经支配模式存在于不同的 MN 集，但具有倒置拓扑（未在此图中表示）。还显示了本体感觉神经元 DVA，它沿着腹侧神经索支配胆碱能神经元（为简单起见，绘制得更背侧）。左侧显示了相关的离子通道和受体（NPR：神经肽受体）。在 wt （A） 中，DVA 将 NLP-12 神经肽释放到胆碱能神经元上，由 CKR-1 和 CKR-2 受体检测 （1）。（2） 胆碱能神经元（可能）以自分泌方式释放 ACh（绿云）和神经肽 FLP-6、NLP-9、NLP-21 和 NLP-38，（可能）以自分泌方式释放到胆碱能神经元上的 NPR-18 和其他未知神经肽受体上。这些受体的激活会诱导 SV 的额外 ACh 填充（弯曲的黑色箭头）。（3） 肌肉上的 ACh 释放导致去极化和 Ca2+通过 CaV1 通道和 ER 流入胞质溶胶（通过 UNC-68 兰尼碱受体，本图中未表示）;ACh 释放还激活 GABA 能神经元。（4） GABA 和神经肽 FLP-15 和 NLP-15 在肌肉和胆碱能神经元上释放，并被 GABA 检测一个（肌肉）和 GABAB受体（胆碱能神经元），以及未知神经肽受体;向 ACh 神经元发出信号是旁分泌的。在 unc-31 （CAPS） 或 egl-3;aex-5 （pro-protein convertases， PCs） 双突变体 （B） 中，没有成熟的神经肽被释放或形成，因此不存在神经肽诱导的信号步骤。因此，（5） 较少的 ACh 填充到 SV 中并从胆碱能神经元中释放。作为回应，补偿性上调通过提供更多的 Ca 来确保稳态 NMJ 信号转导2+内流，从而使肌肉细胞去极化。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.g010
材料和方法
蠕虫和维护
如前所述，秀丽隐杆线虫菌株在 20 °C 下在接种大肠杆菌菌株 OP50 的线虫生长培养基 （NGM） 平板上培养 [71]。生成或使用的 Strauns 如下：
EG5027： oxIs353[myo-3p：：ChR2：：mCherry; unc-54UTR; lin-15（+）] V， EN8636： kr462[daf-2：：linker：：AID：：linker：：mNeonGreen] III; krSi234[Punc-17：：TIR1：：BFP：：unc-54 3′ UTR]， KP9876： egl-19（nu674[EGL-19 GFP11 knock-in]）; nuSi250[punc-129：：GFP1−10：：SL2：：UNC-57：：mCherry]， KP11046： egl-19（nu674[EGL-19 GFP11 knock-in]）; nuSi285[punc-47：：GFP1-10：：SL2：：UNC-57：：mCherry]， KP10154： EGL-19（nu698[EGL-19 mCherry11 敲入]） IV;nuTi335[ppat-10：：sfCherry1-10]， RJP5269： rp166（unc-31-linker-GFP-TEV- AID-FLAG） IV， ZX460： zxIs6[punc-17：：chop-2（H134R）; lin-15+]， ZX1460： zxIs53[punc-17：：bPAC：：YFP; pmyo-2：：mCherry]， ZX1659： zxIs52[pmyo-3：：RCaMP35]; zxIs6， ZX1869： zxIs53; zxIs6; zxIs52， ZX1870： unc-31（n1304） IV; zxIs53， ZX2482： zxEx1139[pmyo-3：：QuasAr;pmyo-2：：CFP];zxIs5[punc-17：：chop-2（H134R）; lin-15+]， ZX2640： nlp-21（tm2569） III; zxIs53， ZX2684： flp-18（gk3063） X; zxIs53， ZX2719： unc-31（n1304） IV; zxIs6; zxIs52， ZX2720： unc-31（n1304） IV; zxIs53; zxIs6; zxIs52， ZX2771： unc-31（n1304） IV; oxIs353， ZX2772： UNC-31（n1304） IV;zxEx1139[pmyo-3：：QuasAr;pmyo-2：：CFP];zxIs5[punc-17：：chop-2（H134R）; lin-15+]， ZX2851： flp-9（ok2730） IV; zxIs53， ZX2852： nlp-38（ok2330） I; zxIs53， ZX2870： flp-6（ok3056） V; zxIs53， ZX2877： npr-18（ok1388） X; zxIs53， ZX2879： sprr-1（tm3658） X; zxIs53
ZX2881： nlp-9（tm3572） V; zxIs53， ZX2932： nlp-38（ok2330） I; zxEx1538[pnlp-38：：nlp-38：：SL2：：mCherry， pmyo-2：：CFP]; zxIs53， ZX2933： sprr-2（ok3290） X; zxIs53， ZX2981： nlp-13（sy1453） V; zxIs53， ZX2982： nlp-9（tm3572） V; zxEx1535[pnlp-9：：nlp-9：：SL2：：mCherry， pmyo-2：：CFP]; zxIs53， ZX3039： zxEx1537[pacr-2：：nlp-9：：mCherry; pmyo-2：：CFP]; zxIs53， ZX3045： nlp-9（tm3572） V; oxIs353， ZX3099： nlp-9（tm3572） V; nlp-21（tm2569） III; zxIs53， ZX3119： zxEx1537[pacr-2：：nlp-9：：mCherry; pmyo-2：：CFP]， ZX3248： nlp-9（tm3572） V; nlp-21（tm2569） III; nlp-38（ok2330） I; oxIs353， ZX3258： unc-31（n1304） IV; zxIs6， ZX3260： nlp-38（ok2330） I; oxIs353， ZX3303： zxIs170[pmyo-3：：ChR2， pmyo-3：：RCaMP35]， ZX3305： unc-31（n1304） IV; egl-19（nu698[EGL-19 mCherry11 knock-in]） IV; nuTi335[ppat-10：：sfCherry1-10]， ZX3314： unc-31（n1304） IV; zxEx1534[punc-17β：：unc-31：：SL2：：mCherry+ punc-47：：unc-31：：SL2：：mCherry]; oxIs353， ZX3322： unc-31（n1304） IV; zxIs170， ZX3333： unc-31（n1304） IV; zxEx1533[punc-47：：unc-31：：SL2：：mCherry]; oxIs353， ZX3338： npr-18（ok1388） X; oxIs353， ZX3373： kpc-1（gk8） I; oxIs353， ZX3374： bli-4（e937） I; oxIs353， ZX3534： aex-5（sa23） I; zxIs170， ZX3535： egl-3（gk238） V; zxIs170， ZX3536： aex-5（sa23） I; egl-3（gk238） V; zxIs170， ZX3553： aex-5（sa23） I; zxEx1445[paex-5：：aex-5：：SL2：：GFP]; zxIs170， ZX3594： unc-31（n1304） IV; zxEx1528[pmyo-3：：unc-31：：SL2：：GFP]; oxIs353， ZX3595： unc-31（n1304） IV; zxEx1529[prab-3：：unc-31：：SL2：：GFP]; oxIs353， ZX3787： ace-1（ok663） X; ace-2（ok2545） I; oxIs353， ZX3788： ace-1（ok663） X; ace-2（ok2545） I; unc-31（n1304） IV; oxIs353， ZX3854： aex-5（sa23） I; zxEx1511[punc-47：：aex-5：:P 2A：：GFP]; zxIs170， ZX3855： zxEx1512[pmyo-3：：egl-19b：:P 2A：：GFP];zxIs170， ZX3896： nlp-9（tm3572） V; zxEx1520[punc-17：：nlp-9：：SL2：：mCherry]; oxIs353， ZX3897： nlp-9（tm3572） V; zxEx1521[punc-47：：nlp-9：：SL2：：mCherry]; oxIs353， ZX3922： nlp-9（tm3572） V; npr-18（ok1388） X; oxIs353， ZX3923： aex-5（sa23） I; zxEx1539[punc-17：：aex-5：:P 2：：GFP]; zxIs170， ZX3924： flp-9（ok2730） IV; oxIs353， ZX3925： FLP-15（GK1186） III;oxIs353， ZX3926： nlp-15（ok1512） I; oxIs353， ZX3927： unc-31（n1304） IV; zxEx1537[pacr-2：：nlp-9：：mCherry; pmyo-2：：CFP]， ZX4002： nlp-9（tm3572） V; nlp-21（tm2569） III; nlp-38（ok2330） I; zxIs53， ZX4003： egl-3（gk238）V; aex-5（sa23） I; zxIs53， ZX4004： flp-15（gk1186） III; zxIs53， ZX4005： nlp-15（ok1512） I; zxIs53， ZX4006： FLP-15（GK1186） III;NLP-15（OK1512）我;zxIs53， ZX4007： unc-31（e928） IV; zxIs53， ZX4008： unc-31（e928）IV; oxIs353， ZX4009： krSi234[Punc-17：：TIR1：：BFP：：unc-54 3′ UTR]; rp166（unc-31-linker-GFP-TEV- AID-FLAG） IV; oxIs353， ZX4010： nlp-9（tm3572）V; egl-19（nu698[EGL-19 mCherry11 knock-in]） IV; nuTi335[ppat-10：：sfCherry1-10]， ZX4011： UNC-31（n1304） IV;EGL-19（nu674[EGL-19 GFP11 敲入]）;nuSi285[punc-47：：GFP1-10：：SL2：：UNC-57：：mCherry]， ZX4012： unc-31（n1304） IV; egl-19（nu674[EGL-19 GFP11 knock-in]）; nuSi250[punc-129：：GFP1-10：：SL2：：UNC-57：：mCherry]， ZX4035： egl-3（gk238） V; zxEx1558[punc-17：：egl-3：] :P 2A：：gfp， pmyo-2：：mCherry]; zxIs170， ZX4036： egl-3（gk238） V; zxEx1559[punc-47：：egl-3：:P 2A：：gfp， pmyo-2：：mCherry]; zxIs170， ZX4040： cha-1（p1152） IV;oxIs353
分子生物学
这项工作中生成或使用的质粒列在 S2 表中，使用的引物列在 S3 表中。
救援构造
通过 PCR 从 KG#121 扩增 unc-31 cDNA，KG#121 是 Kenneth Miller 的礼物（Addgene 质粒 # 110879;http://n2t.net/addgene:110879;RRID： Addgene_110879），并使用 HiFi 组装 （NEB） 插入到分别含有 rab-3 启动子（泛神经元拯救）、unc-17 启动子（胆碱能拯救）、unc-47 启动子（GABA 能拯救）和 myo-3 启动子（肌肉拯救）的表达载体中。
通过 PCR 从 pJH2124 中扩增 egl-3 gDNA，pJH2124 是美珍的礼物（Addgene 质粒 # 178791;http://n2t.net/addgene:178791;RRID： Addgene_178791），并分别插入到含有 unc-17 启动子和 unc-47 启动子的表达载体中。
通过 PCR 从 N2 基因组 DNA 中扩增 aex-5 、 NLP-9 和 NLP-38 基因组序列，并分别插入表达载体中。
通过 PCR 从 N2 基因组 DNA 中扩增 aex-5 （2 kb）、nlp-9 （2.8 kb） 和 nlp-38 （2 kb） 起始密码子上游的基因组片段作为启动子。
EGL-19 系列核糖核酸
从 N2 基因组 DNA 中扩增 1.5 kb 的 egl-19 基因组片段 [65]，并通过 HindIII 和 NheI 的限制性消化插入质粒 L4440 中。该构建体在大肠杆菌菌株 HT115 中转化 [72]。如前所述进行 dsRNA 诱导 [73]。细菌在含有 LB-氨苄青霉素的琼脂培养皿上生长过夜。挑选菌落并在 37 °C 和 180 rpm 下在 5 ml LB-氨苄青霉素补充培养基中培养过夜。用 200 μl 培养物/板接种 NGM 氨苄青霉素板，并在 37 °C 下孵育过夜。第二天，通过施用 150 μl 异丙基-β-d-硫代半乳糖-吡喃糖苷 （IPTG） 储备液 （100 mM） 诱导 egl-19 RNAi 喂养细菌合成 dsRNA，然后将 15 只 L4 动物转移到这些平板上。第二批 NGM-氨苄青霉素板接种 egl-19 RNAi 饲养菌株。第二天用 150 μl （100mM） 含有全反式视黄醛 （ATR;4 μl 100 mM 储备液） 的 IPTG 原液诱导这些，并将来自各自第一个培养皿的 10 只成年动物转移到新的培养皿上，它们的后代培养 4 天。
生长素诱导型 degron （AID） 测定
使用 AID 的 UNC-31 胆碱能神经元特异性耗竭菌株是通过将 N 端 GFP-AID-FLAG-UNC-31 敲入菌株（RJP5269，[27]，由 Roger Pocock 友情提供）与在胆碱能神经元中表达 TIR1 的菌株（EN8636，由 Florence Solari 友情提供;[74]。
如前所述制备含有生长素或乙醇的 NGM 板 [27]。为了获得一致的 UNC-31 去除，将 L4 动物在生长素或乙醇-NGM 平板上培养过夜，然后转移到新鲜的生长素或乙醇-NGM 平板上。使用下一代动物进行测量。对于急性 UNC-31 耗竭，在实验前，将第 1 天的成年动物在生长素或乙醇 NGM 平板上培养 5 小时。
EGL-19 过表达
通过 PCR 从 KP#2460 扩增 egl-19b cDNA（由 Joshua M. Kaplan 友情提供）。将 cDNA 插入到包含肌肉表达启动子 myo-3 的表达载体中。
转基因和种系转化
通过显微注射各种 DNA 构建体与共注射标记物 （pmyo-2：：mCherry （2 ng/μl）、pmyo-2：：CFP （2 ng/μl） 或 pttx-3：：mScarlet （30 ng/μl） ）来产生转基因菌株。通过组蛋白-miniSOG 诱导诱变获得整合菌株 [75]，然后与 N2 异交至少 4 次。
行为检测
在多蠕虫跟踪器（MWT）平台[33]中进行爬行速度测定，由LED模块ALUSTAR（Ledxon GmbH，Geisenhausen，Germany）以70 μW/mm的功率照明2，如前所述[76,77]。由于 bPAC 的高灵敏度，所有处理表达 bPAC 菌株的实验都在暗室中进行，并在红色滤光下对动物进行作 [21]。MWT上的红外背光是由WEPIR3-S1红外功率LED Star红外（850纳米）3W（Winger Electronics GmbH & Co. KG，Dessau，Germany）驱动的，由LCM-40恒流LED驱动器供电，并由电位计（Vishay Intertechnology， Inc.，Malvern，PA，USA）进行调节，以避免bPAC预激活。为了同步蠕虫，将大约 15 只妊娠动物转移到 OP50 种子的 NGM 平板上，让其产卵 6-8 小时，然后取出。3-4 天后，使用 M9 缓冲液收集约 80 只第 1 天成虫，并转移到普通 NGM 板上进行测量。
在蔡司 Axiovert 40 显微镜（蔡司，德国）中进行身体收缩测定，用 50 W HBO 汞灯的蓝光照射，通过 GFP 激发滤光片 （450-490 nm） 以 1.1、0.1 和 65 μW/mm 过滤2强度如相应图例所示，在 10× 目标下。将 L4 幼虫转移至新鲜接种的 ATR 平板上（用 300 μl OP50-1 培养物接种，与 0.6 μl 溶于乙醇的 100 mM ATR 原液混合），并将单个第 1 天成虫置于普通 NGM 平板上进行测量。体长如前所述确定[78]。
在所有记录之前，将动物在黑暗中保持 15 分钟。在 2-3 个不同的实验日重复测量。
荧光成像
对于钙成像，结合光遗传学刺激，将 RCaMP35- [34] 和表达 ChR2 的动物安装在载玻片上，并用聚苯乙烯珠（直径 0.1 μm，2.5% w/v，Sigma-Aldrich）固定。使用配备 Kinetix22（Teledyne Photometrics，图森，亚利桑那州，美国）相机、Prior Lumen LED（Prior Scientific，英国剑桥）和 RCaMP 滤光片立方体（双波段激发滤光片 479/585 nm、647 nm 发射滤光片和 605 nm 分豆器，分别为 F74-423、F37-647 和 F38-605）拍摄图像;AHF Analysentechnik，德国），具有 20× 物镜，470 nm 照明光在规定时间内激活 ChR2,590 nm 激发光用于 RCaMP 信号记录。
如前所述进行电压成像 [55]。简而言之，用聚苯乙烯珠固定表达 QuasAr 的动物，并在配备 40× 油浸物镜（蔡司 EC Plan-NEOFLUAR ×40/NA 1.3，油 DIC ∞/0.17）、激光分束器（HC BS R594 lambda/2 PV flat，AHF Analysentechnik）和伽利略扩束器（BE02-05-A，Thorlabs）上成像。用 1.8 W/mm 的 637 nm 激光器（OBIS FP 637LX，相干）激发 QuasAr 的电压依赖性荧光2并在 700 nm 处成像，而 ChR2 由 300 μW/mm 的光栅 （Polychrome V） 激活2.
如前所述进行体腔细胞测定[48]。简而言之，将表达 NLP-9：：mCherry 融合蛋白的动物安装在载玻片上并用四咪唑固定。图像是使用蔡司观察器 Z1 拍摄的，物镜为 40×，照明为 590 nm，带有 RFP 滤光片立方体（例如 580/23 nm，em. 625/15 nm）。对每只动物内的所有腔细胞进行成像以进行定量。对于 bPAC 菌株，用 35 μW/mm 的蓝光照射蠕虫2成像前 15 分钟。
使用蔡司 LSM780 显微镜和 63× 油物镜 （Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil DIC） 在 488 和 543 nm 处分别用于 GFP 和 mCherry 激发，获取 nlp-9 和 nlp-38 转录报告基因构建体的代表性表达模式图像以及用于定量的 EGL-19：：mCherry 图像。
对斐济进行背景减影和量化 [79]。
电生理学
如前所述，在解剖的成虫中对体壁肌肉细胞进行电生理记录 [18]。用组织丙烯酸 L 胶 （B. Braun Surgical， Spain） 固定动物，并做一个侧切口以沿前腹神经索进入 NMJ。用 0.5mg/ml 胶原酶酶促去除覆盖体壁肌肉的基底膜 10 s （C5138， Sigma-Aldrich， Germany）。通过 DIC 显微镜目视检查压载物和神经索的完整性。使用配备 Patchmaster 软件（HEKA，德国）的 EPC-10 放大器在 20-22 °C 下以全细胞膜片钳模式获取 BWM 的记录。将载物台连接到用于火焰抛光硼硅酸盐移液器的标准 HEKA 移液器支架（1B100F-4，美国伍斯特理工学院），电阻为 4–10 MΩ。细胞外浴液 （CRG） 由 150 mM NaCl、5 mM KCl、5 mM CaCl 组成2，1 毫米氯化镁2，10 mM 葡萄糖、5 mM 蔗糖和 15 mM HEPES，pH 7.3，含 NaOH，∼330 mOsm。内部贴片移液器溶液由葡萄糖酸钾 115 mM、KCl 25 mM、CaCl 组成20.1 毫米，氯化镁25 毫米，BAPTA 1 毫米，HEPES 10 毫米，钠2ATP 5 毫米，钠2GTP 0.5 mM，cAMP 0.5 mM 和 cGMP 0.5 mM，pH 7.2，KOH，∼320 mOsm。
电压钳位实验在 −60 mV 的保持电位下进行。使用 LED 灯（KSL-70，Rapp OptoElectronic，德国汉堡;470 nm，8 mW/mm）进行光激活2） 并由 Patchmaster 软件控制。使用 Picospritzer III（Parker，美国）进行 ACh（CRG 中 500 μM）的吹吹施用 （80 ms） 以记录 ACh 诱发电流。随后使用 Patchmaster 和 Origin （Originlabs） 进行分析和绘图。使用 MiniAnalysis（Synaptosoft，Decatur，GA，USA，版本 6.0.7）进行 mPSC 分析。BWM 细胞中的膜电位和 AP 以电流钳模式记录。为了诱导 AP，通过 Patchmaster 软件在 10.01 秒时注入 +20 pA （50 ms） 的额外电流脉冲，持续 50 毫秒。为了进行数据分析，电压走线与 AP 的峰值对齐，并重新绘制，因此看起来相对于电流脉冲发生了偏移。
统计分析
除非另有说明，否则所有定量数据均显示为平均值，± s.e.m. n 表示动物数量，N 表示具有不同动物种群的生物学重复/测量会话。双尾学生 t 检验（两组比较）、单向 AVOVA（多组比较）、Bonferroni 或 Tukey 多重比较检验或 Fisher 检验或双向方差分析（多组比较）后数据集之间的显着性，如每个图例所示。在 GraphPad Prism（GraphPad 软件，版本 8.02）或 OriginPro 2024（64 位;SR1 10.1.0.178;Origin Lab Corporation 的 Origin Lab Corporation）。
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S1 图 与图 1 相关。
（一、二）定量 wt （n = 28） 和 unc-31 突变体 （n = 19） 的腹侧神经脊髓胆碱能神经元中的 bPAC：：YFP 信号。代表性图片 （A;比例尺 10 μm）和汇总数据 （B）。（C、D）胆碱能 ChR2 激活诱发 wt （n = 7） 和 unc-31 突变体 （n = 7） 中的突触后电流。显示了代表性迹线 （C） 和峰值电流 （D） 的组数据。（E， F）定量 wt （n = 48） 和 unc-31 突变体 （n = 34） 的体壁肌肉中的 ChR2：：mCherry 信号。代表性图像 （E;比例尺 10 μm）和摘要数据 （F）。（G、H）与对照动物 （n = 16，无处理） 相比，乙醇 （n = 15） 或生长素 （n = 15） 暴露 5 小时后神经环中 GFP-AID-UNC-31 强度的定量。代表性图像 （G;比例尺 10 μm）和摘要数据 （H）。（我，J）使用 0.1 mW/mm2 蓝光刺激测量 UNC-31 耗竭后肌肉 ChR2 激活诱导的体长。比较生长素或乙醇处理的动物。每组测试的动物数量：分别为 n = 12、13。蓝条表示 5-15 秒的蓝光照明。图 J 中的数据表示图 I 所示的整个照明周期的平均值。数据以均值± SEM 表示。两组数据集和多组数据集比较的统计显着性分别使用非配对 t 检验和单向方差分析与 Tukey 校正确定。** 和 **** 分别表示 P < 0.01 和 P < 0.0001。数值数据可以在 S1 数据集中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s001
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S2 图 与图 2 相关。
（一、二）使用 65 μW/mm 测量由肌肉 ChR2 激活诱导的体长变化2蓝光刺激。AEX-5 基因组拯救是通过在自己的启动子下特异性表达 AEX-5 来完成的。测试的动物数量 n = 46、24、22，从左到右。图 B 中的数据表示图 A 所示的整个照明周期 （5-15 s） 的平均值。（C） AEX-5 从 GABA 能神经元中释放。腔细胞荧光，使用 unc-47 启动子表达，以及 GABA 能神经元分泌 mCherry 标记的 AEX-5。白色箭头表示动物中部和前部的腔细胞。白色箭头表示腹侧脊髓 GABA 能神经元。比例尺 100 μm。数据以均值± SEM 表示。使用带有 Tukey 校正的单因素方差分析确定统计显着性。** 和 **** 分别表示 P < 0.01 和 P < 0.0001。数值数据可以在 S1 数据集中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s002
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S3 图 与图 3 相关。
（A） 以 MNs 表达的神经肽的表达数据摘要。代表不同神经元类型中神经肽 mRNA 表达模式和水平的热图由 CeNGENApp （https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/） 生成。裁剪初始导出的图以显示胆碱能神经元、 GABA 能神经元和胆碱能中间神经元 DVA。缩放的 TPM （每百万转录本数） 和比例数据是指秀丽隐杆线虫的所有神经元，而不仅仅是显示的子集。（B） 胆碱能神经元中 bPAC 刺激后的平均速度轨迹，图3C和3D中所示的动物，并产生图3C和3D的组数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s003
（TIF）
S4 图 与图 4 相关。
（一、二）使用 100 μW/mm 测量肌肉 ChR2 激活诱导的体长2WT （n = 11）、NLP-9、NLP-21、NLP-38 （n = 14）、NLP-9 （n = 13） 和 UNC-31 突变体 （n = 9） 中的蓝光刺激。图 B 中的数据表示图 A 中所示的整个照明期 （5-10 s） 的平均值。（C-F） 在指定的基因型中比较了胆碱能 bPAC 激活诱导的爬行速度。nlp-9 （C， D） 和 nlp-38 拯救 （E， F） 是通过特异性表达来自胆碱能启动子 unc-17 的 NLP-9 和 NLP-38 来完成的。分别在 （D） n = 60-80、N = 12、16、8 个实验和 （F） n = 60-80、N = 8、6、6 个实验中从左到右测试的动物数量。所有数据均以均值± SEM 表示。分别使用未配对 t 检验和单向方差分析与 Tukey 校正确定两组数据集和多组数据集比较的统计显着性。和 **** 分别表示 P < 0.001 和 P < 0.0001。数值数据可以在 S1 数据集中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s004
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S5 图 与图 4 相关。
（一、二）nlp-9 和 nlp-38 的解剖表达模式。nlp-9 和 nlp-38 转录报告基因分别驱动来自 nlp-9 和 nlp-38 启动子的 mCherry 荧光的代表性图像，以及它们与 YFP 荧光的共定位，使用 unc-17 启动子在胆碱能神经元中表达。白色箭头表示表达 nlp-9 或 nlp-38 的神经元和腹侧脊髓胆碱能 MN 的细胞体共定位。比例尺分别为 100 和 20 μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s005
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S6 图 与图 6 相关。
（A-F）数据如图 6B-6G 所示，但未归一化。分析 bPAC 刺激胆碱能神经元诱导的体壁肌肉细胞中的 （m） PSC 速率和振幅。从成虫解剖体壁肌肉中记录的 ± mPSC 平均值，包括 wt （n = 19）、aex-5;egl-3 （n = 7）、nlp-9 （n = 13）、nlp-38 （n = 8）、nlp-9;nlp-21;nlp-38 （n = 7） 和 flp-15;nlp-15 （n = 7） 突变体。蓝色条表示胆碱能神经元中 bPAC 的刺激。请注意，图 A、C、E 和 B、D、F 中使用相同的 wt 对照数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s006
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S7 图 与图 7 相关。
（一、二）从 wt （n = 8） 和 unc-31 突变体 （n = 9） 中成虫的解剖 BWM 细胞中记录的基础、未刺激的 mPSC。显示了 mPSC 的代表性迹线 （A） 和 mPSC 振幅 （B） 的汇总数据。（C、D）wt （n = 31） 和 unc-31 （n = 24） 突变体腹侧神经索中胆碱能 ChR2 ： GFP 强度的定量。代表性图像 （C;比例尺 10 μm）和汇总数据 （D）。（E） 在胆碱能神经元的 ChR2 刺激诱发的去极化过程中，使用荧光电压指示剂 QuasAr 进行电压成像，在 wt （n = 13） 和 unc-31 突变体 （n = 12） 的 BWM 细胞中表达，如图 7G 和 7H 所示。第一个峰值 ΔF/F0是在 ChR2 刺激期间观察到的初始最大信号。所有数据均以均值± SEM 表示。使用未配对的 t 检验确定统计显着性比较。ns = 不显著。数值数据可以在 S1 数据集中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s007
（TIF）
S8 图 与图 8 相关。
（一、二）aex-5 突变体中增加的诱发肌肉收缩被 CaV1 阻滞逆转。肌肉 ChR2 激活诱导的身体收缩，使用 65 μW/mm2在指定的基因型和治疗中比较蓝光刺激。显示了用 CaV1 特异性抑制剂 nemadipine 处理后的相对体长。测试的动物数量，n = 14、14、14、15，分别从左到右列。图 B 中的数据表示图 A 中显示的整个照明周期 （5-15 s） 的平均值。数据以 SEM ±平均值表示。使用双向方差分析和 Sidak 多重比较检验确定统计显着性比较。* 和 **** 分别表示 P < 0.05 和 P < 0.0001。数值数据可以在 S1 数据集中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s008
（TIF）
S9 图 与图 9 相关。
（一、二）比较 EGL-19 在肌肉细胞中 wt （n = 14） 和 nlp-9 突变体 （n = 14） 的内源性表达水平。代表性图片 （A;比例尺 20 μm）和摘要数据 （B）。（C-F）以 wt （分别为 n = 28 和 22） 和 unc-31 突变体 （分别为 n = 29 和 25） 定量胆碱能 （C、D） 和 GABA 能神经元 （E、F） 中内源性 GFP 标记的 EGL-19 的表达。代表性图像 （C， E;比例尺 20 μm）和汇总数据 （D、F）。（G-I）unc-31 突变体中 AP 振幅增强;过表达 EGL-19 CaV1 的动物的延迟和延长的 AP。显示了在 10.01 秒诱导 20 pA 电流步长后 BWM 细胞记录的膜电位变化的个体（灰色）和平均（红色）痕迹，以重量 （G）、unc-31 （H） 和 EGL-19 过表达 （OEx） 动物 （I） 为单位，分别来自 n = 15、15 和 14 只动物。请注意，迹线与峰值振幅的时间对齐，并重新绘制，因此它们似乎转移到了更早的时间。所有数据均以均值 ± SEM 表示。使用未配对的 t 检验确定具有统计学意义的比较。表示 P < 0.001。数值数据可以在 S1 数据集中找到。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s009
（TIF）
S1 表。 本研究中研究的神经肽前体序列，以及 AEX-5 和 EGL-3 前蛋白转化酶的推定切割位点。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s010
（DOCX）
S2 表。 这项工作中生成的质粒。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s011
（DOCX）
S3 表。 这项工作中使用的引物。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s012
（DOCX）
S1 数据。 与图 1 相关的数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s013
（XLSX）
S2 数据。 与图 2.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s014
（XLSX）
S3 数据。 与图 3 相关的数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s015
（XLSX）
S4 数据。 与图 4 相关的数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s016
（XLSX）
S5 数据。 与图 5 相关的数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s017
（XLSX）
S6 数据。 与图 6.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s018
（XLSX）
S7 数据。 与图 7 相关的数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s019
（XLSX）
S8 数据。 与图 8 相关的数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s020
（XLSX）
S9 数据。 与图 9 相关的数值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s021
（XLSX）
S1 数据集。 与 S1–S9 相关的数值数据 Figs.
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3003171.s022
（XLSX）
确认
我们要感谢 Gottschalk 实验室的成员支持这项研究。我们特别感谢 Franziska Baumbach 和 Katharina Kuhlmeier 的出色技术支持，以及 Ichiro Aoki 对手稿的批判性阅读和评论。我们感谢 Kenneth Miller、Roger Pocock、Florence Solari、Stephen Nurrish 和 Joshua Kaplan 提供的试剂和菌株。一些菌株来自隐杆红发遗传学中心 （CGC），该中心由 NIH 研究基础设施计划办公室 （P40 OD010440） 资助。其他菌株来自日本国家线虫生物资源计划，该项目由日本医学研究开发机构 （AMED） 资助。
引用
1.Marder E， Bucher D. 中央模式生成器和节奏运动的控制。Curr Biol. 2001 年;11（23）：R986-96。PMID：11728329
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
2.Zhen M，塞缪尔 ADT。秀丽隐杆线虫运动：小回路，复杂功能。Curr Opin 神经生物学。2015;33:117–26.PMID：25845627
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
3.苏德霍夫 TC.神经递质释放：突触小泡生命中的最后一毫秒。神经元。2013;80(3):675–90.PMID：24183019
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
4.Nanou E， Catterall WA.钙通道、突触可塑性和神经精神疾病。神经元。2018;98(3):466–81.PMID：29723500
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
5.Zucker RS，Regehr WG。短期突触可塑性。Annu Rev Physiol. 2002;64:355–405.PMID：11826273
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
6.卡瓦拉利 ET.自发性神经递质释放的机制和功能。Nat Rev 神经科学。2015;16(1):5–16.PMID：25524119
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
7.Zhang W， 江 H-H， 罗 F. 突触前活性区电压门控钙通道的多样化组织。前突触神经科学。2022;14:1023256.PMID：36544543
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
8.Silva M， Tran V， Marty A. 突触小泡的钙依赖性对接。趋势神经科学。2021;44(7):579–92.PMID：34049722
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
9.Reshetniak S， Rizzoli SO.囊泡簇是短期和长期突触组成的主要组织者。Curr Opin 细胞生物学 2021;71:63–8.PMID：33706235
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
10.Davis GW. Homeostatic signaling and the stabilization of neural function. Neuron. 2013;80(3):718–28. pmid:24183022
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
11.Orr BO, Fetter RD, Davis GW. Retrograde semaphorin-plexin signalling drives homeostatic synaptic plasticity. Nature. 2017;550(7674):109–13. pmid:28953869
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
12.Orr BO, Fetter RD, Davis GW. Activation and expansion of presynaptic signaling foci drives presynaptic homeostatic plasticity. Neuron. 2022;110(22):3743-3759.e6. pmid:36087584
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
13.Orr BO, Gorczyca D, Younger MA, Jan LY, Jan Y-N, Davis GW. Composition and control of a Deg/ENaC channel during presynaptic homeostatic plasticity. Cell Rep. 2017;20(8):1855–66. pmid:28834749
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
14.Turrigiano GG， Leslie KR， Desai NS， Rutherford LC， Nelson SB. 新皮层神经元量子振幅的活动依赖性缩放。自然界。1998;391(6670):892–6.PMID：9495341
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
15.Von Stetina SE， Treinin M， Miller DM 第 3 名。电机电路。Int Rev 神经生物学。2006;69:125–67.PMID：16492464
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
16.Schultheis C， Brauner M， Liewald JF， Gottschalk A. 秀丽隐杆线虫运动神经元中 GABAB 受体信号传导的光遗传学分析。神经生理学杂志。2011;106(2):817–27.PMID：21613582
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
17.迪特曼 JS，卡普兰 JM。神经递质激活的 G 蛋白偶联受体的行为影响：毒蕈碱和 GABAB 受体调节秀丽隐杆线虫的运动。神经科学杂志。2008;28(28):7104–12.PMID：18614679
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
18.Liewald JF、Brauner M、Stephens GJ、Bouhours M、Schultheis C、Zhen M 等人。突触功能的光遗传学分析。Nat 方法。2008;5(10):895–902.PMID：18794862
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
19.Kittelmann M、Liewald JF、Hegermann J、Schultheis C、Brauner M、Steuer Costa W 等人。光遗传学过度刺激后的体内突触恢复。美国国家科学院院刊 2013 年;110（32）：E3007-16。PMID：23878262
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
20.Liu Q， Hollopeter G， Jorgensen EM.秀丽隐杆线虫神经肌肉接头处的分级突触传递。美国国家科学院院刊 2009 年;106(26):10823–8.PMID：19528650
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
21.Steuer Costa W， Yu SC， Liewald JF， Gottschalk A. 通过神经肽信号和囊泡负载对神经传递的快速 cAMP 调节。Curr Biol. 2017;27(4):495–507.PMID：28162892
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
22.胡 Z， 皮姆心电图， 巴布 K， 瓦什利山·默里 AB， 卡普兰 JM.神经肽介导的牵张反应将肌肉收缩与神经递质释放的变化联系起来。神经元。2011;71(1):92–102.PMID：21745640
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
23.Simon DJ、Madison JM、Conery AL、Thompson-Peer KL、Soskis M、Ruvkun GB 等。microRNA miR-1 调节神经肌肉接头处的 MEF-2 依赖性逆行信号。细胞。2008;133(5):903–15.PMID：18510933
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
24.Tong XJ、López-Soto EJ、Li L、Liu H、Nedelcu D、Lipscombe D 等人。逆行突触抑制是由 α-neurexin 与 N 型钙通道的 α2δ 亚基结合介导的。神经元。2017;95（2）：326-340.e5。PMID：28669545
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
25.胡 Z、Hom S、Kudze T、Tong X-J、Choi S、Aramuni G 等人。Neurexin 和 Neuroligin 介导秀丽隐杆线虫的逆行突触抑制。科学。2012;337(6097):980–4.PMID：22859820
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
26.Gracheva EO， Burdina AO， Touroutine D， Berthelot-Grosjean M， Parekh H， Richmond JE.Tomosyn 负向调节秀丽隐杆线虫突触处的 CAPS 依赖性肽释放。神经科学杂志。2007;27(38):10176–84.PMID：17881523
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
27.Cornell R， Cao W， Liu J， Pocock R. UNC-31/CAPS 的条件性降解能够对神经肽功能进行时空分析。神经科学杂志。2022;42(46):8599–607.PMID：36302635
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
28.李 W， 冯 Z， Sternberg PW， 徐 XZS.由机械敏感的 TRP 通道同源物揭示的秀丽隐杆线虫拉伸受体神经元。自然界。2006;440(7084):684–7.PMID：16572173
View ArticlePubMed/NCBIGoogle Scholar
29.Smith JJ、Taylor SR、Blum JA、Feng W、Collings R、Gitler AD 等。成年秀丽隐杆线虫运动神经元的分子图谱揭示了由保守转录因子代码描绘的古老多样性。Cell 报告。2024;43(3):113857.电子版印刷 2024/02/29。PMID：38421866;PMCID：PMC11091551。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
30.Taylor SR、Santpere G、Weinreb A、Barrett A、Reilly MB、Xu C 等人。整个神经系统的分子拓扑图。细胞。2021;184（16）：4329-4347.e23。PMID：34237253
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
31.Beets I、Zels S、Vandewyer E、Demeulemeester J、Caers J、Baytemur E 等人。秀丽隐杆线虫中肽-GPCR 相互作用的系统范围图谱。Cell 报告。2023;42(9):113058.电子版印刷 2023/09/01。PMID：37656621;PMCID：PMC7615250。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
32.Ripoll-Sanchez L、Watteyne J、Sun H、Fernandez R、Taylor SR、Weinreb A 等人。秀丽隐杆线虫的神经肽能连接组。神经元。2023;111（22）：3570–89 e5。电子版印刷 2023/11/08。PMID：37935195。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
33.Swierczek NA， Giles AC， Rankin CH， Kerr RA.秀丽隐杆线虫的高通量行为分析。Nat 方法。2011;8(7):592–8.PMID：21642964
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
34.Akerboom J、Carreras Calderón N、Tian L、Wabnig S、Prigge M、Tolö J 等人。用于多色神经活动成像并与光遗传学相结合的基因编码钙指示剂。前 Mol 神经科学。2013;6:2.PMID：23459413
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
35.Charlie NK、Schade MA、Thomure AM、Miller KG。突触前 UNC-31 （CAPS） 是激活秀丽隐杆线虫突触信号网络的 G α（s） 通路所必需的。遗传学。2006;172(2):943–61.PMID：16272411
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
36.Speese S， Petrie M， Schuske K， Ailion M， Ann K， Iwasaki K， et al. UNC-31 （CAPS） 是秀丽隐杆线虫中致密核心囊泡所必需的，但不是突触囊泡胞吐作用所必需的。神经科学杂志。2007;27(23):6150–62.PMID：17553987
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
37.Hammarlund M， Watanabe S， Schuske K， Jorgensen EM.CAPS 和 Syntaxin 将致密的核心囊泡对接到神经元的质膜上。细胞生物学杂志 2008;180(3):483–91.PMID：18250196
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
38.Berwin B， Floor E， Martin TF.CAPS （哺乳动物 UNC-31） 蛋白定位于参与致密核心囊泡胞吐作用的膜。神经元。1998;21(1):137–45.PMID：9697858
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
39.Husson SJ， Clynen E， Baggerman G， Janssen T， Schoofs L. 缺乏前蛋白转化酶 2 （KPC-2/EGL-3） 的秀丽隐杆线虫神经肽前体的加工缺陷：质谱法突变体分析。神经化学杂志。2006;98(6):1999–2012.PMID：16945111
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
40.Canaff L、Bennett HP、Hendy GN。肽激素前体加工：分选？Mol 细胞内分泌。1999;156(1–2):1–6.PMID：10612417
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
41.Li C， Kim K. 神经肽。在：社区 TCeR，编辑。蠕虫书;2008. https://doi.org/10.1895/wormbook.1.142.1： http://www.wormbook.org
42.洪 WL， 王 Y， Chitturi J， 甄 M.秀丽隐杆线虫的发育决定需要胰岛素信号介导的神经元-肠道通讯。发展。2014;141(8):1767–79.PMID：24671950
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
43.托马斯 JH。秀丽隐杆线虫排便的遗传分析。遗传学。1990;124(4):855–72.PMID：2323555
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
44.Mahoney TR、Luo S、Round EK、Brauner M、Gottschalk A、Thomas JH 等人。GABA 能神经元的肠道信号传导调节秀丽隐杆线虫的节律行为。美国国家科学院院刊 2008 年;105(42):16350–5.PMID：18852466
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
45.Doi M， Iwasaki K. 新型 C2 结构域蛋白 AEX-1 对神经肌肉接头逆行信号的调节。神经元。2002;33(2):249–59.PMID：11804572
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
46.Sheng M， Hosseinzadeh A， Muralidharan SV， Gaur R， Selstam E， Tuck S. 排便运动程序缺陷的秀丽隐杆线虫突变体的异常脂肪代谢。公共科学图书馆一号。2015;10（4）：e0124515。PMID：25849533
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
47.Singh J， Aballay A. 肠道感染通过神经内分泌信号传导调节行为和学习。Elife 的。2019;8：e50033.PMID：31674907
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
48.西伯斯 D，麦迪逊 JM，卡普兰 JM。PKC-1 调节神经肽的分泌。国家神经科学。2007;10(1):49–57.PMID：17128266
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
49.Harris G、Shen Y、Ha H、Donato A、Wallis S、Zhang X 等人。剖析食物气味识别和偏好的信号机制。神经科学杂志。2014;34(28):9389–403.PMID：25009271
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
50.Peymen K， Watteyne J， Borghgraef C， Van Sinay E， Beets I， Schoofs L. 肌抑制肽信号传导调节秀丽隐杆线虫的厌恶味觉学习。PLoS 基因。2019;15（2）：e1007945。PMID：30779740
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
51.Mills H、Wragg R、Hapiak V、Castelletto M、Zahratka J、Harris G 等人。单胺和神经肽相互作用以抑制秀丽隐杆线虫的厌恶行为。EMBO J. 2012 年;31(3):667–78.PMID：22124329
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
52.兰德 JB。Caenorhabditis中cha-1-unc-17基因复合物的遗传分析。遗传学。1989;122(1):73–80.PMID：2731735
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
53.Cornell R， Cao W， Harradine B， Godini R， Handley A， Pocock R. 神经肠道乙酰胆碱信号调节秀丽隐杆线虫的线粒体应激反应。Nat Commun.2024;15(1):6594.PMID：39097618
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
54.Bergs ACF、Liewald JF、Rodriguez-Rozada S、Liu Q、Wirt C、Bessel A 等人。全光学闭环电压钳，用于精确控制活体动物的肌肉和神经元。Nat Commun.2023;14(1):1939.PMID：37024493
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
55.Azimi Hashemi N、Bergs ACF、Schüler C、Scheiwe AR、Steuer Costa W、Bach M 等人。基于视紫红质的电压成像工具，用于秀丽隐杆线虫的肌肉和神经元。美国国家科学院院刊 2019 年;116(34):17051–60.PMID：31371514
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
56.Richmond JE，Jorgensen EM。一个 GABA 和两个乙酰胆碱受体在秀丽隐杆线虫神经肌肉接头处发挥作用。国家神经科学。1999;2(9):791–7.PMID：10461217
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
57.刘 P， 葛 Q， 陈 B， Salkoff L， Kotlikoff MI， 王 Z-W.秀丽隐杆线虫体壁肌肉细胞中全或全无动作电位的离子电流的遗传解剖。生理学杂志 2011;589（第 1 部分）：101-17。PMID：21059759
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
58.Gao S， Zhen M. 动作电位驱动秀丽隐杆线虫的体壁肌肉收缩。美国国家科学院院刊 2011 年;108(6):2557–62.PMID：21248227
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
59.Lainé V， Frøkjær-Jensen C， Couchoux H， Jospin M.alpha1 亚基 EGL-19、alpha2/δ 亚基 UNC-36 和 β 亚基 CCB-1 是秀丽隐杆线虫横纹肌中电压依赖性钙电流的基础。J Biol Chem. 2011 年;286(42):36180–7.PMID：21878625
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
60.兰德 JB。乙酰胆碱。WormBook 的 WormBook 中。2007;:1–21.PMID：18050502
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
61.FMRFamide 神经肽和乙酰胆碱协同抑制秀丽隐杆线虫产卵。国家神经科学。2008;11(10):1168–76.PMID：18806786
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
62.Liu H， Li L， Wang W， Gong J， Yang X， 胡 Z. 自发性囊泡融合在胆碱能突触和 GABA 能突触处受到差异调节。Cell Rep. 2018;22(9):2334–45.PMID：29490270
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
63.Kwok TCY、Ricker N、Fraser R、Chan AW、Burns A、Stanley EF 等人。秀丽隐杆线虫中的小分子筛选产生一种新的钙通道拮抗剂。自然界。2006;441(7089):91–5.PMID：16672971
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
64.Fraser AG， Kamath RS， Zipperlen P， Martinez-Campos M， Sohrmann M， Ahringer J. 通过系统 RNA 干扰对秀丽隐杆线虫 I 染色体进行功能基因组分析。自然界。2000;408(6810):325–30.PMID：11099033
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
65.Mariol MC， Ségalat L. 在没有抗肌萎缩蛋白的情况下的肌肉变性是一个钙依赖性过程。Curr Biol. 2001 年;11(21):1691–4.PMID：11696327
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
66.Gao L， Zhao J， Ardiel E， Hall Q， Nurrish S， Kaplan JM.Shank 通过将 BK 通道募集到钙微结构域来促进动作电位复极化。Elife 的。2022;11：e75140.PMID：35266450
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
67.赵 J， 高 L， 努里什 S， 卡普兰 JM.突触后 GABAA 受体通过募集 CaV2 通道到其输入来增强传递。细胞代表 2023;42(10):113161.PMID：37742192
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
68.Feng S、Varshney A、Coto Villa D、Modavi C、Kohler J、Farah F 等人。亮裂红色荧光蛋白，用于内源性蛋白和突触的可视化。公报生物学 2019;2：344。PMID：31552297
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
69.Ramachandran S、Banerjee N、Bhattacharya R、Lemons ML、Florman J、Lambert CM 等人。保守的神经肽系统连接头部和身体运动回路以实现适应性行为。Elife 的。2021;10：e71747.PMID：34766905
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
70.Dill H， Liewald JF， Becker M， Seidenthal M， Gottschalk A. 斑马鱼幼鱼神经肌肉信号传导的神经肽能调节改变了游泳行为和突触传递。iScience的。2024;27(9):110687.PMID：39252958
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
71.布伦纳 S.秀丽隐杆线虫的遗传学。遗传学。1974;77(1):71–94.PMID：4366476
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
72.Timmons L， Fire A. 摄入的 dsRNA 的特异性干扰。自然界。1998;395(6705):854.PMID：9804418
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
73.Wabnig S， Liewald JF， Yu SC， Gottschalk A. 秀丽隐杆线虫突触传递和突触囊泡再循环的高通量全光学分析。公共科学图书馆一号。2015;10（8）：e0135584。PMID：26312752
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
74.Roy C， Molin L， Alcolei A， Solyga M， Bonneau B， Vachon C， et al. DAF-2/胰岛素 IGF-1 受体通过整合来自肌肉和神经元组织的相反信号来调节衰老过程中的运动。老化细胞。2022;21（8）：e13660。PMID：35808897
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
75.Noma K， Jin Y. 秀丽隐杆线虫的光遗传学诱变。Nat Commun.2015;6:8868.PMID：26632265
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
76.Vettkötter D、Schneider M、Goulden BD、Dill H、Liewald J、Zeiler S 等人。通过突触小泡聚集对突触传递进行快速和可逆的光遗传学沉默。Nat Commun.2022;13(1):7827.PMID：36535932
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
77.Aoki I、Golinelli L、Dunkel E、Bhat S、Bassam E、Beets I 等人。在单个神经元对中表达的功能拮抗神经肽的分层调控。Nat Commun.2024;15(1):9504.PMID：39489735
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
78.Seidenthal M、Vettkötter D、Gottschalk A. WormRuler：一种跟踪体长的软件，用于表征秀丽隐杆线虫中的超级红移通道视紫红质。MicroPubl 生物学 2022;2022：10.17912/micropub.biology.000607。PMID：35903772
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
79.Schindelin J、Arganda-Carreras I、Frise E、Kaynig V、Longair M、Pietzsch T 等人。斐济：用于生物图像分析的开源平台。Nat 方法。2012;9(7):676–82.PMID：22743772
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
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