厦门免费医学论文发表-假结区域和 poly-（C） 束包含组装口蹄疫病毒的重要 RNA 包装信号
克里斯·尼尔 ，约瑟夫·纽曼，尼古拉·斯通豪斯，大卫·罗兰兹，格雷厄姆·贝尔沙姆，托比亚斯·图蒂尔
抽象
病毒组装是完成病毒复制周期的关键步骤。除了确保病毒基因组有效掺入新生病毒粒子外，还需要高特异性来防止宿主核酸的掺入。对于小核糖核酸病毒，包括 FMDV，满足这些要求所需的机制尚不清楚。然而，最近的证据表明，分散在整个小核糖核酸病毒基因组中的特定 RNA 序列参与了包装。在这里，我们已经表明这种序列对于 FMDV RNA 包装是必不可少的，并证明了假结 （PK） 区域和多聚 （C） 束在此过程中的作用，其中发现多聚 （C） 束的长度会影响 RNA 包封的效率。含有较长 poly-（C） 束的亚基因组复制子在反式包装中效率更高，并且发现从含有短 poly-（C） 束的转录本中回收的病毒在细胞中仅传代一次后就具有大大延长的 poly-（C） 束，这表明维持较长的 poly-（C） 束提供了选择性优势。我们还证明了位于假结 （PK） 区域、毗邻多聚 （C） 束的包装信号 （PS） 以及基因组中其他几种非必要但有益的 PS 的关键作用。总的来说，这些 PS 大大提高了包封效率，poly-（C） 束可能有助于附近的 PS 采用正确的构象。利用这些数据，我们提出了一个模型，其中与衣壳前体的相互作用控制两种 RNA 构象之间的转换，指导新生基因组的命运要么被包装，要么作为复制和/或蛋白质翻译的模板。
作者总结
基因组包装，即病毒 RNA 被掺入保护性蛋白衣壳中以产生更多病毒颗粒，是 RNA 病毒生命周期中的关键步骤。这是一个严格的过程，因为只有病毒 RNA 被封装，而细胞 RNA 被排除在外。
这项研究揭示了包装信号在 FMDV RNA 包封中的重要作用，特别是那些在假结区域和可包含 >100 个胞嘧啶的区域（称为多聚 （C） 束）中的信号。我们证明 poly-（C） 束的长度显着影响包装效率;包含较长的 poly-（C） 束的基因组受到青睐。这是 FMDV 中 poly-（C） 束的第一个确定作用。我们还在假结区域发现了一个重要的包装信号，该信号由位于整个基因组中的其他包装信号协助，它们共同促进了 FMDV RNA 的包膜。这些结果为 RNA 包装信号参与 FMDV 组装提供了令人信服的证据。基于此，我们提出了一种简单的 FMDV RNA 包装模型，该模型涉及从基因组复制到基因组包装的转变，并受包装信号控制。这些知识可以为未来针对 FMDV 和其他小核糖核酸病毒的新型抗病毒策略的研发铺平道路。
数字
图 7图8图 9图 1图 2图 3图 4图5图 6图 7图8图 9图 1图 2图 3
引文： Neil C， Newman J， Stonehouse NJ， Rowlands DJ， Belsham GJ， Tuthill TJ （2024） 假结区和多聚 （C） 束包含组装口蹄疫病毒的重要 RNA 包装信号。PLoS 病原体 20（12）： e1012283 号。 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283
编辑 器： Weidong Xiao，印第安纳大学 美国普渡大学印第安纳波利斯分校
收到： 2024 年 5 月 23 日;接受： 2024 年 12 月 4 日;发表： 12月 23， 2024
版权所有： © 2024 Neil 等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 所有数据都在手稿和/或支持信息文件中。
资金： 这项工作由 BBSRC （BB/V008323/1）、TJT 和皮尔布赖特研究所（BBS/E/I/00007034 和 BBS/E/PI/230002A）、丹麦技术大学国家兽医研究所 （DTU） 和哥本哈根大学的内部资助，GJB。实验工作在皮尔布赖特研究所的高度防护设施（BBS/E/I/00007037 和 BBS/E/PI/23NB0004）进行。作者要感谢生物信息学、测序和蛋白质组学部门，并通过核心能力资助 （BBS/E/I/00007039） 提供支持。在 DTU 和 UCPH，作为丹麦食品和农业渔业部与 DTU 以及哥本哈根大学之间委托工作协议的一部分，工作由丹麦兽医和食品管理局 （FVST） 资助。NJS 和 DJR 获得了 BBSRC 的资助（BB/K003801/1 和 BB/T015748/1）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
介绍
口蹄疫病毒（foot-andmouth disease virus， FMDV）是小核糖核酸病毒科口蹄病毒属的一个物种，是偶蹄动物口蹄疫（foot-and-mouth disease， FMD）的病原体[1]。口蹄疫具有极强的传染性，在非洲和亚洲的部分地区流行。在有感染风险的地区，通过接种疫苗来控制口蹄疫，而包括美国、英国、澳大利亚和欧洲大陆大部分地区在内的国家在没有接种疫苗的情况下保持无口蹄疫状态。然而，在通常没有 FMD 的国家暴发该疾病可造成严重的经济损失，并且在流行国家抗击病毒的持续成本很高 [2]。
口蹄疫病毒是一种小的、无包膜的、单链的、正义的RNA病毒，基因组长约8.4 kb，被包装成假性T=3二十面体衣壳[3]。基因组包含一个大的开放阅读框，编码结构蛋白和非结构蛋白。该多蛋白中的第一种蛋白质是 Leader 蛋白酶，其次是衣壳前体 P1-2A 和非结构蛋白 2B、2C、3A、3B[1–3]、3C专业人士和 3D [4]。衣壳前体 P1-2A 被病毒蛋白酶 3C 裂解专业人士转化为 VP0、VP1、VP3 和 2A，其中 VP0、VP1 和 VP3 在原聚体中保持关联 [5]。然后，5 个原聚体组装成一个五聚体，12 个五聚体与一个基因组 RNA 分子结合，形成完整的传染性病毒颗粒。最后，VP0 存在组装依赖性成熟切割成 VP2 和 VP4，在包装 RNA 存在的情况下效率更高，但仍可以独立发生 [6]。尽管这种成熟裂解对于大多数小核糖酵母病毒来说很常见，但它并不普遍。例如，副病毒属的病毒不会经历这一过程，而VP0在成熟病毒中保持完整[7]。除了形成成熟的病毒粒子外，缺乏RNA的衣壳也会组装产生非感染性的空颗粒[8]。
口蹄疫基因组被组织成一个高度结构化的5'-UTR，其中病毒编码肽（VPg）共价结合到RNA的5'末端[9,10]，即开放阅读框;和一个终止于 poly-A 尾部的 3'-UTR。5'-UTR 的关键元件是：S 片段、多聚 （C） 束、假结 （PK） 区、顺式作用复制元件 （cre） 和内部核糖体进入位点 （IRES）。本研究特别感兴趣的是 poly-（C） 束和相邻的 PK 区域，它们都不存在于一些研究更深入的小核糖核酸病毒中，例如肠道病毒。
poly-（C） 束通常由大约 50-200 个胞嘧啶组成 [11]。poly-（C） 束需要超过一定长度与心形病毒和口疮病毒的毒力有关[12,13]。然而，也有相互矛盾的结果报道[14]。部分原因是由于难以克隆如此长的均聚物，以及允许截短的聚-（C）束在传代过程中恢复到wt长度的机制，从而掩盖了潜在的差异[15,16]。但是，已经表明此功能对于复制不是必需的。
PK 区域由 2-4 个序列高度相似的 PK 组成，它们直接跟随 poly-（C） 束。虽然 wt 水平的复制必须至少存在一个 PK，但缺乏所有四个 PK 的 RNA 转录本仍然能够复制。尽管如此，我们已经证明没有 PK 的 RNA 转录本不能作为传染性病毒回收，我们假设这可能是由于包装缺陷 [17]。
小核糖核酸病毒 RNA 被认为在衣壳组装过程中被包膜，尽管尚未建立明确的机制来实现这一目标，但最近的工作强调了 RNA 包装信号 （PS） 在此过程中的作用。其他 RNA 病毒使用 PS 将病毒 RNA 掺入衣壳中，噬菌体 MS2 被视为 PS 介导的包装模型系统 [18]。此外，在其他小核糖核酸病毒中也发现了 PS，尤其是爱知病毒、人副埃可病毒 1 型和肠道病毒-E [19–25]。在这些系统中，多个小的、低亲和力的 PS 分散在病毒基因组中，它们协同工作，更有效地将基因组包装到病毒衣壳中 [26]。这些 PS 可能各自在哈密顿途径中依次募集一个衣壳亚基，例如小核糖核酸病毒五聚体 [27]。整个基因组中 PS 的排列，每个 PS 对衣壳亚基具有不同的亲和力，可以通过最初与亲和力最强的 PS 结合，然后募集低亲和力的 PS 来完成衣壳结构来协调组装过程。对于某些病毒，PS的存在对于衣壳的形成至关重要，例如MS2 PS外壳蛋白的相互作用是外壳蛋白构象变化所必需的，从而实现高效组装[28]。尽管 FMDV 五聚体可以在没有 RNA 的情况下组装成空衣壳（因此 PS 对于衣壳形成不是必需的），但这些 PS 可以促进和稳定该过程，使组装更高效并防止衣壳过早解离。此外，关于小核糖核酸病毒的其他研究描述了包膜的替代机制。例如，对于肠道病毒脊髓灰质炎病毒 （PV），基因组的所有非必要部分要么被删除，要么被广泛突变，同时保持编码的蛋白质序列，或者与其他小核糖核糖核酸病毒的片段交换而不影响病毒活力，这表明 PV RNA 包膜不仅仅依赖于 PS [29–32].作为 RNA PSs 的替代品，2C（一种参与 RNA 复制的病毒蛋白）和衣壳蛋白 VP3 之间的相互作用被认为是复制和包膜之间的联系 [33]。然而，最近的研究已经确定了整个PV基因组中的PS基序[25]，这表明小核糖核酸病毒在包膜过程中可能同时利用蛋白质-蛋白质相互作用和RNA-蛋白质相互作用。
FMDV packaging appears to be extremely stringent since only genomic RNA (or FMDV replicon RNA) is packaged into virus capsids [34]. Additionally, we have previously identified functional PSs dispersed across the FMDV genome [35]. The 5’-most PS identified is located in the PK region, and deletion of sequences within this region prevented virus recovery [17].
许多因素会影响传染性病毒的组装，包括蛋白质和 RNA 合成的相对速率，这些因素使小核糖核酸病毒中基因组包膜的研究变得复杂，特别是 FMDV。当病毒组装的最终测定是病毒活力的测量时，这一点尤其重要。识别小核糖核酸病毒包装信号的方法有助于确定病毒组装过程中 RNA-衣壳相互作用的作用 [24,25\u201235]，但即使是这些方法也受到依赖病毒活力进行验证的限制，需要更直接的方法来评估组装和包膜。为此，基于Barclay等人和McInerney等[30,34]进行的分析，开发了一种旨在观察表达GFP的复制子在反式细胞中的相对包封效率的分析方法。该测定表明，脊髓灰质炎病毒复制子可以反式包装到脊髓灰质炎病毒衣壳中，但当使用 FMDV 时，该测定的效率明显较低。
在这里介绍的工作中，我们进一步优化了反式包膜测定，以便能够研究 FMDV RNA 包装，解决了复制子反式包膜效率低下的问题。然后，我们使用该测定法来证明 PK 区域中的多 （C） 束和相邻的 PSs 对 RNA 包装的重要性，并提出了一个依赖于分散在基因组中的 PS 的 FMDV 包装模型。
方法
细胞系
婴儿仓鼠肾 21 （BHK-21） 细胞系购自皮尔布赖特研究所的中央服务单位 （CSU）。该细胞系用于所有细胞培养实验。细胞在格拉斯哥的最低必需培养基（GMEM、Merck）和 10% 胎牛血清 （FBS;Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺 （Merck）、100 单位/L 青霉素、100 μg/mL 链霉素 （Merck） 和 5% 胰蛋白胨磷酸盐肉汤 （Gibco）。对于病毒感染，使用病毒生长培养基 （VGM），其成分相同，但含有 1% 或 5% FBS。
用于转染和/或感染的细胞在前一天使用合适的稀释度接种，以在实验开始时达到 80% 汇合度。
质 粒
使用三种质粒作为本文所述工作的基础：O1 Kaufbeuren （O1K） FMDV ΔP1 ptGFP 复制子，包含前导蛋白酶编码区，但用 ptGFP 编码区取代了衣壳编码区 [36];O1K aqGFP 无领导 （ΔLb） 感染性拷贝质粒 （ΔLb.GFP.FMDV），不包含前导蛋白编码区，但包含 aqGFP 编码区 [37];以及O1K FMDV的全长感染拷贝pT7S3[38]。这些如图 1 所示。
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图 1. 病毒中选定特征的示意图，ΔP1 GFP 复制子和 ΔLbdcap GFP 复制子。
（A） 病毒、（B） ΔP1 GFP 复制子（包括 ΔPK34、ΔPK234、C11 和 C11 ΔPK1234 版本）和 （C） ΔLbdcap GFP 复制子（包括 wt C35、C29、C11、C39 ΔPK1 和 C40 ΔPK2 版本）的代表。替换标记在各自位置的上方（VP2/VP3 和 VP3/1 3C专业人士切割位点）和包装信号（由 Logan 等人描述）在上面用橙色箭头标记。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.g001
这里使用了 ΔP1 GFP 复制子的四种变体：C11、ΔPK1234、ΔPK234、ΔPK34 和 C11，我们之前已经描述过 [17]。本研究通过连接来自含有替代长度 poly-（C） 束的 GeneArt 合成 DNA 来制备另一个变体 C29。
通过改变编码的 3Cpro 切割位点来阻止 P1-2A 加工，将 ΔLb.GFP.FMDV 感染性拷贝质粒修饰为制造复制子。该复制子称为无领导缺陷衣壳 GFP 复制子 （ΔLbdcap GFP 复制子）。编码 VP2/VP3 连接的序列从 GAGGGA 更改为 GCTGCT （PSKE/GIFP 更改为 PSKA/AIFP），编码 VP3/VP1 连接的序列从 GAAACC 更改为 GCCGCA （ARAE/TTSA 更改为 ARAA/ATSA），通过引入 GeneArt 的合成 DNA 片段，VP0 肉豆蔻酰化位点序列中的密码子从 GGG 更改为 GCC （VP0 G1A）。再次通过掺入 GeneArt 的合成 DNA 对 ΔLbdcap GFP 复制子进行变异，以制备：C11、C29、C39 ΔPK1 和 C40 ΔPK2 ΔLbdcap GFP 复制子。
含有截短的 poly-（C） 束的 pT7S3 质粒是通过用合适的限制性内切酶消化相应的 ΔLbdcap GFP 复制子并在含有 poly-（C） 束的片段中连接以替换 pT7S3 的等效区来制备的。
所有限制性内切酶消化均使用来自 New England Biolabs （NEB） 的酶根据产品方案进行。用适当的限制性内切酶消化后，使用 rAPid 碱性磷酸酶 （Roche） 对载体部分进行去磷酸化。然后使用 DNA 电泳分离片段，使用 Monarch DNA 凝胶提取试剂盒 （NEB） 纯化，并使用 T4 DNA 连接酶 （Invitrogen） 连接。
体外转录
使用适当的限制性内切酶（基于 ΔP1 ptGFP 的复制子为 AscI，所有其他复制子为 HpaI）对质粒进行线性化。然后使用Monarch PCR和DNA清理试剂盒（NEB）纯化DNA，并使用MEGAscript T7转录试剂盒（Invitrogen）根据制造商指南从纯化的DNA中合成RNA。使用试剂盒中包含的 Turbo 消化起始 DNA。使用 MEGAclear 试剂盒 （Invitrogen） 纯化 RNA，并根据制造商的方案使用 Qubit RNA BR 检测试剂盒 （Invitrogen） 和 Qubit 荧光计 4 进行定量。
BHK 细胞转染
根据制造商的方案 （Invitrogen），使用 Lipofectamine 2000 用 RNA 转染 BHK 细胞。将 RNA 与 Opti-Mem （Gibco） 混合，加入 1 μg（适用于 24 孔转染）至 50 μL。将 Lipofectamine 2000 在 Opti-Mem 中以 1：10 的比例稀释，制成等体积的 Lipofectamine 2000-Opti-Mem 混合物（每个 RNA 样品）。每组在室温下孵育 5 分钟，然后将 RNA/Opti-Mem 溶液与等体积的 Lipofectamine 2000/Opti-Mem 溶液混合，并在室温下再孵育 15 分钟。从细胞单层中吸出培养基，并替换为 RNA 转染混合物，以及足够的 Opti-Mem 以覆盖细胞并防止细胞干燥。2 小时后，用适当体积的 1% VGM 更换培养基。当复制抑制剂与转染复制子一起使用时，这是通过在转染培养基和 VGM 中加入终浓度为 3 mM 的盐酸胍 （GuHCl） 来实现的。
Trans-encapsidation assay
在第一轮测定中，将 BHK-21 细胞接种在多孔板（6 孔、12 孔或 24 孔，科学实验室用品）中，并用适量的复制子 RNA 转录物（分别为 4、2 和 1 μg）转染。如果使用感染性克隆转录本（如 C11 转录本）作为辅助基因组，则将其与 RNA-Opti-Mem 混合物一起加入复制子 RNA 进行共转染（使用的 Lipofectamine 2000 的最终体积或量没有变化）。如果使用辅助病毒，则在转染后 1 小时将其添加到细胞中。转染后 2 小时，用适当体积的含 1% 血清的 VGM 替换培养基以覆盖细胞。将转染 ΔP1 GFP 复制子的细胞孵育至转染后 5 小时，而转染 ΔLbdcap GFP 复制子的细胞在转染后 7 小时孵育，均在 37°C 下孵育，然后在 -20°C 下冷冻过夜。平行制备重复板，并使用 Incucyte® S3 活细胞分析系统进行分析，该系统使用相位光每小时对细胞进行成像并检测荧光（发射波长 524 nm，激发波长 460 nm）。分析图像以计算存在的表达 GFP 的细胞数量，并确定平均荧光强度 （MFI） 作为复制子复制的量度。
对于第二轮分析，将细胞解冻并沉淀，并在室温下用每 100 μL 上清液 1 μL （10 μg） RNase A（ThermoFisher Scientific）处理含有包膜 RNA 的上清液 10 分钟，以去除输入转录本。然后用 50、100 或 200 μL 上清液（分别为 24、12 和 6 孔板）接种新鲜细胞，并上样到 Incucyte® S3 中，使用相位光和荧光检测进行每小时成像（如上所述）。每个孔拍摄了几张图像，这些图像实时分析了细胞覆盖的孔的比例（汇合度%）、每个孔的荧光对象数量（每孔的 GFP 对象数）和/或孔的 MFI（如果相关）。根据真正的 GFP 表达细胞的特征调整分析参数，以优化表达 GFP 的细胞的检测并最大限度地减少背景自发荧光，其中包括为 GFP 的强度和病灶的面积设置最小阈值。典型阈值包括：阈值为 1.0 GCU（绿色校准单位）;最大面积为 1000 μm2;最大偏心率为 0.7;和最小积分强度 （GCU x μm2） 的 2000 年。所有其他参数通常保留为默认设置。通常读取板 24 小时或直到 GFP 对象计数开始减少。
CPE 开发试验
CPE （细胞病变效应） 发育测定是通过用病毒感染性克隆质粒制成的 RNA 转录本转染 BHK-21 细胞的 96 孔板来进行的。将板加载到 Incucyte® S3 活细胞分析系统中，每四小时使用一次相位光成像，直到达到完全 CPE 或仅细胞阴性对照变得不健康。每个孔拍摄多张图像，实时分析这些图像以确定细胞中覆盖孔的比例，从而计算细胞单层的汇合度。调整分析参数以优化对健康细胞的检测，与不健康细胞相比，以更好地观察获救病毒通过培养物的传播。
RNA 提取和消化
将 RNA 转录本转染到 BHK21 细胞中，让细胞产生 CPE。在完全 CPE 时，通过冻融裂解细胞，并通过离心澄清裂解物。然后将一部分澄清的裂解物加入含有 VGM 的新鲜 BHK21 细胞中，并再次放置细胞直至达到完全 CPE。此时，使用 Qiagen RNeasy 试剂盒 （74004） 处理细胞以提取 RNA。然后用 RNase T1 （ThermoFisher Scientific） 消化纯化的 RNA 样品以释放 poly-（C） 束;向 RNA 中加入 2 μL （2000 U） RNase T1，并将样品在 37°C 下孵育 30 分钟。
自动电泳
使用 Agilent 4200 Tapestation（Tapestation D1000 高灵敏度 DNA 试剂盒和 Tapestation RNA ScreenTape 试剂盒，安捷伦）或 Agilent 2100 生物分析仪（DNA 12000 试剂盒，安捷伦）分析 DNA 和 RNA 样品。对于 DNA 试剂盒，将 2 μL 质粒 DNA （0.1–50 ng/μL） 添加到 2 μL 样品缓冲液中，以 2000 rpm 的转速涡旋混合 1 分钟，然后上样到 Tapestation/生物分析仪中。对于 RNA 试剂盒，将 1 μL 细胞 RNA （25–200 ng/μL） 添加到 5 μL 样品缓冲液中，在热循环仪中加热至 72°C 3 分钟，冷却至 4°C 2 分钟，以 2000 rpm 离心涡旋 1 分钟，然后上样到 Tapestation 中。
RT-qPCR 检测
使用基于染料的 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒 （NEB） 和针对 FMDV 3D 的引物 （ACT GGG TTT TAC AAA CCT GTG A 正向，GCG AGT CCT GCC ACG GA 反向），通过 RT-qPCR 分析提取的 RNA。将总共 1 μL RNA 添加到 19 μL 预混液中，并按以下条件上样到热循环仪中：55°C 10 分钟，95°C 1 分钟，95°C 45 个循环 10 秒，然后在 60°C 下 30 秒。根据 FAM 的设置读取荧光团。
结果
一种研究 FMDV RNA 包装的新型反式包膜检测
反式包膜测定涉及将两种 RNA 转录本共转染到细胞中：表达 GFP 的复制子，它不能产生功能性衣壳，而是作为基因组供体;以及作为衣壳供体的感染性副本转录本。当这些 RNA 在同一细胞中复制时，感染拷贝产生功能性衣壳亚基，该亚基可以与顺式感染拷贝衍生的病毒 RNA 或反式复制子 RNA 组装在一起。然后，包含感染基因组或复制子 RNA 的后代颗粒可以感染新细胞，被反式包膜复制子 RNA 感染的细胞可通过 GFP 表达进行定量。因此，可以通过比较感染第一轮转染细胞裂解物的细胞单层细胞中的 GFP 表达来测量可能影响包膜的复制子的相对 tran 包膜效率（图 2）。在第二轮中表达 GFP 的细胞数量反映了反式包封复制子的包装效率。所用复制子的转染效率和复制动力学可以通过第一轮测定中产生的 GFP 计数和平均荧光强度 （MFI） 来评估，以确保它们具有可比性。如果复制子之间存在显着差异，则这些被纳入从实验中得出的结论中。
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图 2.
转包膜检测概述 （A） 在第一轮检测中，用 GFP 复制子转录本转染细胞，并用 wt 病毒感染或与感染性拷贝转录本共转染，因此复制子和病毒/感染性拷贝转录本在同一细胞中复制。这导致产生后代 wt 病毒和后代反式包膜病毒颗粒，其中 GFP 复制子包装到 wt 病毒提供的衣壳中。表达 GFP 的细胞比例与转染效率相对应。（B） 然后使用含有后代 wt 病毒和反式包膜病毒颗粒的细胞裂解物感染第二轮新鲜细胞。用反式包膜的 GFP 复制子感染的细胞表达 GFP，与标准 GFP 复制子样品相比，表达 GFP 的细胞的比例代表了突变型 GFP 复制子的相对反式包膜效率。
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我们假设病毒 RNA 包装的效率与 PS 的数量相关。为了测试这一点，在反式包膜测定中使用了两种类型的复制子 RNA，具有正常或减少的 PS：具有较少 PS 的 GFP 复制子（由于用 GFP 报告序列替换了大部分 P1 衣壳编码区，称为 ΔP1 GFP 复制子）;和一个无领导 （ΔLb） GFP 复制子，包括衣壳编码区和相关的 PS，尽管在 3C 处有替换专业人士阻止衣壳加工和组装的切割位点，称为无领导缺陷衣壳 （ΔLbdcap） GFP 复制子。这些结构的示意图如图 1 所示。
由于 ΔP1 GFP 复制子包含一个 GFP 编码区而不是衣壳编码区，因此它无法产生感染性病毒粒子。虽然这不会影响 RNA 复制和翻译，但衣壳编码区的缺失也会去除该区域内包含的任何 PS，包括 Logan 等人鉴定的四个 PS。al.： PS3， PS4， PS5 以及大多数 PS2 [35]。
因此，设计了一种具有最大 PS 数量的替代复制子，并假设它在反式包封测定中会更有效地包装。这种替代复制子保留了衣壳编码区和相关的 PS。然而，将两个衣壳与GFP报告基因一起包含使得基因组太大而无法包装[39]。因此，使用 ΔLb GFP 病毒，其中 Leader 编码区的 Lb 部分缺失为基因组中的 GFP 报告基因提供了容量。该区域不包含任何目前已鉴定的 PS，如果 Lab 的其余部分仍然存在，则对 BHK-21 细胞的活力影响不大 [37]。3C 中的换人专业人士引入衣壳序列内的切割位点以防止衣壳蛋白被加工，从而防止在没有辅助病毒的情况下衣壳组装。
在第一轮反式包膜测定中，与 ΔP1 GFP 复制子相比，来自 ΔLbdcap GFP 复制子的 GFP 信号表达速度较慢（图 3A）。这表明 ΔLbdcap 复制子的动力学速度较慢，但对于平均荧光强度（图 3A）和 GFP 对象计数（代表 GFP 阳性细胞的数量）（图 3B），它都达到了相同的峰值信号。第一轮的 GFP 表达，包括 GFP 对象计数和 GFP MFI，用于确定复制子复制的适应性。GFP 表达取决于 RNA 复制能力和翻译水平，因此当突变体构建体中的 GFP 表达与 wt 构建体相当时，表明 RNA 复制和翻译均未明显受损。两个样品均在 GFP 表达峰值点（ΔP1 和 ΔLbdcap GFP 复制子分别为 5 小时和 7 小时）收获，以确保在生命周期的等效时间点收获。当用 3 mM 盐酸胍 （GuHCl）（一种 RNA 复制抑制剂）处理时，两个复制子的单独输入 RNA 翻译衍生的 GFP 表达相当。此外，它低于复制子的 GFP 表达，表明 GFP 表达依赖于 RNA 复制和翻译，并支持我们使用 GFP 表达作为监测两个过程变化的方法（S1 图）。
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图 3. 封装信号的存在提高了反式包封效率。
用 ΔP1 GFP 复制子和 ΔLbdcap GFP 复制子转染细胞，有和没有病毒共感染，以及未感染的 ΔLbdcap GFP 复制子转染对照。（A） 显示了反式包膜测定的第一轮 MFI 和 （B） 第一轮和 （C） 第二轮的 GFP 计数。“GFP 对象”是 GFP 阳性焦点，位于分析设置中定义的参数范围内。显示的数据来自单个实验，代表多个实验，误差线表示根据 （A-B） 5 和 （C） 12 张图像计算的 SEM。
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第二轮反式包膜测定显示，与 ΔP1 GFP 复制子相比，ΔLbdcap GFP 复制子的包装效率提高了 25%（图 3C）。这表明，加入额外的 PS 为反式包封带来的好处超过了删除前导蛋白 （Lb） 编码序列所产生的适应成本。当在 GuHCl 存在下进行第一轮时，发生的反式包膜水平可以忽略不计（S1 图）。
poly-（C） 束的长度会影响包膜
PK 区和 PS1 紧邻 poly-（C） 束（图 1），出于实际原因，用于改变 PK 区的 DNA 片段包含合成的 poly-（C） 束，该束比亲本复制子中的多 （C） 束短。为了研究多聚 （C） 束长度对包装的可能影响，使用分别含有 11 nt 和 29 nt 多聚 （C） 束长度的合成 DNA 序列生成 ΔLbdcap GFP 复制子的两种变体，以便与具有大约 35 个胞嘧啶的 wt ΔLbdcap 复制子进行比较。此外，应该注意的是，由于难以在质粒中克隆和维持较长的 poly-（C） 束，这些多聚 （C） 束都比拯救病毒中存在的约 50-200 nt 短。
通过在限制性位点消化质粒以切除含有 316 个碱基对 （bp） 的片段和多聚 （C） 束，并使用电泳分析每个 DNA 片段的大小，验证每个构建体的多聚 （C） 束长度（图 4）。虽然分辨率不足以确定多个实验中 poly-（C） 束的确切长度，但可以在每次分析中近似计算出长度。还比较了每个实验中的片段大小，以确定三个样品之间多聚 （C） 束长度的相对差异，以确认每个实验中的 wt 最大，正如预期的那样，其次是 C29 复制子，然后是 C11 复制子。C11 poly-（C） 束始终短于来自其他两个复制子的束，估计含有 9 到 12 个胞嘧啶。C29 和 wt 复制子的大小似乎相似，wt 复制子看起来略大或相同大小，与预期长度的微小差异一致。据估计，两者的长度都在 30 到 36 个胞嘧啶之间。
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图 4. C11 ΔLbdcap GFP 复制子中的多聚 （C） 束比 C29 和 C35 ΔLbdcap GFP 复制子中的多聚 （C） 束短。
使用 XbaI 和 NheI 消化质粒，凝胶纯化以获得含有 poly-（C） 束的 300 bp 片段，并使用生物分析仪进行分析。分子量标准（以 bp 为单位）显示在泳道 1 中，C11 复制子显示在泳道 2 中，C29 复制子显示在泳道 3 中，wt C35 复制子显示在泳道 4 中。所示的单个分析代表了三个实验。感兴趣的片段在右侧由箭头表示。来自 C11 复制子的片段估计为 325-328 bp （C9-12），而 C29 和 C35 wt 复制子片段估计为 347-352 bp （C30-36）。预期大小分别为 327 、 345 和 351 bp。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.g004
然后在上述反式包膜测定中测试来自这些质粒的 RNA 转录物。在第一轮中，无论是通过 GFP 计数还是 GFP 对象的 MFI，都没有观察到这些复制子的复制差异（图 5A 和 5B），表明多 （C） 束截断对复制子复制动力学没有可测量的影响，因此不会对 RNA 复制或翻译产生不利影响。然而，在第二轮中，反式包封效率与 poly-（C） 束的长度相关;具有最长多聚 （C） 束的 wt C35 复制子在 16 小时时具有最大的峰值 GFP 计数，为 5700，而 C11 和 C29 复制子的峰值计数在 16 小时时分别达到 1500 +/- 50（wt 的 26%）和 4000 +/- 150（wt 的 71%）（图 5C）。所有差异均显著 （p < 0.0001）。
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图 5. 具有较短 poly-（C） 束的转录本在包封过程中竞争性较低。
在反式包封试验中比较具有不同长度多聚 （C） 束的复制子，并根据 （A） 第一轮 GFP 对象计数、（B） 第一轮绿色 MFI 和 （C） 第二轮 GFP 对象计数进行评估。（D） 比较含有等效 poly-（C） 束的病毒转录物的 CPE 发展速度和 （E） 它们在反式包膜测定中用作衣壳供体时与标准复制子竞争包装资源的能力;高复制子反式包封效率相当于衣壳供体在与复制子竞争方面较差。显示的数据表示在收获点 （A-B） 或具有峰值 GFP 表达的时间点（C 和 E）一式三份孔的平均值，误差线表示根据 5 （A-B）、12（C 和 E）和 15 （D） 图像计算的 SEM。使用单向方差分析（**** p < 0.0001）将样品彼此比较以及 wt 复制子与仅转染复制子对照之间的显着性。使用每个样本之间的 Wilcoxon 检验计算 D 中的显着性，但没有一个显着 （p < 0.001）。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.g005
如果 poly-（C） 束的长度至少为 6 个核苷酸，则以前没有报道过 poly-（C） 束截断对包封效率的影响，也未观察到病毒活力的差异 [16]。我们还发现，对 RNA 复制或从多聚 （C） 束中具有 11 个胞嘧啶的感染性全基因组 RNA 转录物中拯救病毒的能力没有影响 [17]。为了扩展这些观察结果，我们调查了多 （C） 束截断在感染性病毒初始 growth 率背景下的影响。为此，我们生成了一个额外的含有 29 个胞嘧啶的感染性拷贝质粒，用于与 C11 和 C35 （wt） 版本进行比较。这些感染性拷贝包含完整的 FMDV 基因组序列，包括 Leader 和衣壳编码区，但不编码 GFP。
从这些质粒制备 RNA 转录本，并在 CPE 发育测定中转染到细胞中，以研究这些截断对病毒拯救、CPE 发育和细胞间传播的影响（图 5D）。然而，没有观察到明显的差异，尽管 C11 转录本最初诱导的 CPE 似乎略低于其他两种转录本，但这在统计学上并不显著。因此，在反式包膜测定中观察到的受损包膜并未反映在感染性病毒的恢复中。
这些感染性拷贝 RNA 转录本随后在“反向”反式包膜测定中用作衣壳供体，在每种情况下都使用 wt ΔLbdcap（缺乏功能性衣壳的复制子）作为基因组供体。在这种情况下，预计衣壳供体 RNA 在包装时越有竞争力，可用于复制子 RNA 包装的资源就越少，从而导致反式包封效率降低。为了支持这一预测，当使用具有较长 （C29， C35） 多 （C） 束的衣壳供体感染性拷贝转录本时，基因组供体复制子的反式包膜效率降低，而当使用具有较短 （C11） 多 （C） 束的衣壳供体感染性拷贝转录本时，复制子反式包膜效率增加。尽管使用 C29 衣壳供体转录物而不是 wt 衣壳供体转录物时，复制子反式包膜也略有增加，但这在统计学上并不显着（图 5E）。这与前面描述的使用 poly-（C） 束修饰的复制子的标准反式包封测定的结果一致。
总之，这些发现表明，较长的 poly-（C） 束具有更好的包装效率。这代表了 FMDV 基因组的这一特征在病毒生命周期中的第一个明确作用。
由于包封的选择压力，poly-（C） 束迅速延伸
在 wt 病毒基因组中，FMDV poly-（C） 束的长度通常为 >100 胞嘧啶 [11]，这比本研究中使用的 RNA 转录本中存在的 poly-（C） 束长得多。只有在感染性拷贝质粒中才能始终保持约 35 nt 的 poly-（C） 束长度，这就是为什么我们构建体的 poly-（C） 束长度比在 wt 病毒基因组中发现的 poly-（C） 束短得多的原因。然而，如果它们大于最小长度，则没有报道短于 wt 的 poly-（C） 束会影响复制、翻译、病毒活力或基因组包装。即使从 C11 转录本和 C35 转录本中回收病毒，救援速度也没有明显差异（图 5D）。然而，据报道，在病毒生长过程中，短的 poly-（C） 束恢复到 75-100 nt. 的 wt 长度，从而掩盖了截断可能对病毒产生的影响 [15， 16]。为了确定 poly-（C） 束的这种延伸是否足够快以解释具有严重截断的 poly-（C） 束的转录物的明显 wt 活力，我们将源自三种感染性构建体 C11、C29、C35 （wt） 的 RNA 转录物中 poly-（C） 束的长度与存在于回收病毒中的那些进行了比较。通过用转录本 RNA 转染细胞来回收病毒，然后在新细胞上进行一次传代，直到形成完全的 CPE（约 24 小时）。这确保了用于分析的大部分病毒 RNA 来自初始转染期间产生的病毒粒子，因此至少通过了一次包装瓶颈。
用RNase T1消化转录本或回收的RNA，并通过自动电泳分析得到的RNA片段，以评估每种情况下RNase T1抗性poly-（C）束的长度[40]。在原始修饰质粒衍生的转录本的消化物中观察到 ~25 nt 的宽峰（图 6A），而在转染后单次传代后回收的病毒的 RNA 消化物中观察到 ~70 nt 处的主要和类似的宽峰（图 6B），正如新回收的多聚 （C） 束所预期的那样 [16].这些峰的宽度表明，每个种群中多 （C） 束的长度是不同的，但聚集在规定的长度附近，这是意料之中的，并且与不同准物种的存在一致。虽然这使我们无法确定每个构建体的确切 poly-（C） 束长度，但分辨率仍然足以显示从原始转录本到回收病毒的增加。这表明 poly-（C） 束长度的快速恢复掩盖了 CPE 发育测定中三种病毒之间的差异，并阻碍了包膜的研究。
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图 6. 截短的 poly-（C） 束在第一次传代期间延伸到接近 wt 的长度。
使用 Agilent 4200 Tapestation 对 RNase T1 消化物进行电泳分析;（A） 来自体外转录反应的 RNA 样品和 （B） 转染转录本并传代回收病毒后相应的提取 RNA。每个泳道 1 包含 RNA 分子量标准;泳道 2 为 C11 样品，泳道 3 为 C29 样品;泳道 4 为 wt C35 样品。对于回收的病毒 RNA，仅细胞对照显示在泳道 5 中。下限标记为 25 nt。包含 poly-（C） 束的片段由右侧的箭头表示。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.g006
包封至少需要一个假结
我们之前对 PK 区域的研究表明，PK 缺失不会阻止 RNA 复制，但似乎对病毒组装有害，这从缺乏病毒恢复可以推断 [17]。为了研究与 PK 缺失相关的假设包装丢失，我们在反式包膜测定中使用了修饰的复制子。
这些复制子在 PK 区域内包含不同的缺失，每个缺失都在 ΔP1 GFP 复制子骨架内，即：ΔPK34，其中 PK 3 和 4 缺失;ΔPK234，PK 2、3 和 4 缺失;和 ΔPK1234，所有四个 PK 均缺失（图 1）。由于 PK 区靠近 poly-（C） 束引起的克隆困难，ΔPK1234 复制子仅包含 11 个胞嘧啶的 poly-（C） 束，而其他复制子质粒的 poly-（C） 束中存在大约 35 个胞嘧啶。我们在转染后 6 小时在 GuHCl 存在下使用病毒 RNA 的 RT-qPCR 分析验证了细胞中相应 RNA 转录物的稳定性是相当的（S2 图）。
为了区分对截短的 poly-（C） 束复制的影响与完全 PK 区缺失的影响，我们之前制作了一个 C11 复制子，其中所有四个 PK 都存在，但包含一个带有 11 个胞嘧啶的截短的 poly-（C） 束。该 C11 复制子在这里用于反式包封实验，以阐明包装缺陷是由于 PK 区的缺失、poly-（C） 束的截短还是两者的结合。
在这个反式包封实验中（如图 2 所示），C11、ΔPK34 和 ΔPK234 复制子的复制动力学在第一轮测定中的 GFP 表达方面相似。这是从 GFP 对象计数（图 7A）和 MFI（图 7B）评估的，GFP 对象计数表示 GFP 复制子复制的细胞数，根据分析中定义的参数。这表明 RNA 复制和翻译都没有受损。这允许在评估包封效率的第二轮测定中直接比较这些构建体。然而，C11 ΔPK1234 复制子产生的 GFP 病灶明显减少且强度较低（图 7A 和 7B），与我们之前的观察结果一致 [17]。当通过 RT-qPCR 测试时，观察到 C11 ΔPK1234 复制子在收获时的 Ct 值大于其他复制子的值，表明 RNA 复制确实受损（S2 图）。尽管复制动力学减少，但仍在第二轮测定中对其进行了测试，但在得出结论时考虑了 C11 ΔPK1234 复制子的减少 RNA 复制对包膜的影响。
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图 7. 缺乏假结和多聚 （C） 束的复制子不是反式包膜的。
在 PK 区和/或 poly-（C） 束中含有缺失的复制子用于反式包膜测定。显示了第一轮的 （A） GFP 对象计数和 （B） 绿色 MFI，以及第二轮的 （C） GFP 对象计数。显示的数据表示一式三份孔的平均值，误差线表示 12 张图像的 SEM。使用单向方差分析 （**** p < 0.0001） 显示与 wt GFP 复制子相比的显着性。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.g007
在第二轮中，很明显，与它们的亲本复制子相比，所有三个 ΔPK 突变转录物在反式中的包装效率较低 （wt GFP 复制子与 ΔPK34 和 ΔPK234 复制子相比，C11 GFP 复制子与 ΔPK1234 复制子相比）（图 7C）。C11 复制子的反式包封效率也降低，与本研究中的先前发现一致（图 4）。
最值得注意的是，与 C11 复制子相比，C11 ΔPK1234 转录本的包装严重减少，每孔 GFP 阳性细胞的数量减少了 12 倍。相比之下，与 wt 复制子相比，ΔPK234 和 ΔPK34 复制子的峰值水平仅分别降低了 2.5 倍和 3.3 倍（图 7C）。尽管 C11 ΔPK1234 的复制效果不如其他转录本（如上所述以及图 7A 和 7B），但这种减少被认为不足以解释我们之前研究中看到的几乎完全包膜丢失和病毒恢复完全丢失 [17]。解释这些结果的一个警告是，使用 C11 ΔPK1234 构建体观察到的复制水平降低表明，与其他复制子相比，它可能产生更少的复制子 RNA 用于包装。
因此，仅从这些数据来看，尚不确定 C11 ΔPK1234 复制子包装如此糟糕的确切原因。这可能是因为 PK1（如果不是特别的 PK1，则至少是一个 PK）是必需的;或者它可能是由于两个突变的影响而导致的复合结果，除了复制子的复制不良之外，这两个突变对包装有害。尽管包装似乎需要 PK，但尚不清楚 PK1 是否是高效反式包埋所必需的，或者是否有任何 PK 就足够了。
PK 1 是包封的 wt 水平所必需的
为了测试 PK1 缺失是否单独归因于反式包膜效率的损失，或者是否是多个有害突变的结果，将单个 PK 缺失引入复制子并在测定中进行测试。所有四个 PK 都具有极其相似的序列，这表明每个 PK 都可能能够在功能上替代 PK1 以促进包装。PK1 和 PK2 特别相似，仅在 5' 端的 11 nt 区域内有所不同（图 8A）。因此，PK1 和 PK2 在 ΔLbdcap GFP 复制子中被单独删除（图 1），并在反式包膜测定中被测试（图 2）。由于 DNA 合成准确性的限制，两种构建体的 poly-（C） 束长度相差一个胞嘧啶;根据制造商的说法，ΔPK1 复制子在该区域具有 39 nt （C39 ΔPK1 GFP ΔLbdcap），ΔPK2 复制子在该区域具有 40 nt （C40 ΔPK2 GFP ΔLbdcap）。不可能通过 poly-（C） 束进行 Sanger 测序，因此我们通过使用电泳分析质粒的 DNA 片段长度来验证 poly-C 束长度（图 8F），发现 C39 ΔPK1 GFP ΔLbdcap 和 C40 ΔPK2 GFP Δlbdcap 复制子都比 wt 短 40 nt， 与 poly-（C） 束中 4 （ΔPK1） 和 5 （ΔPK2） nt 增加以及 PK 缺失导致 44 （ΔPK1） 和 43 （ΔPK2） nt 减少一致。与 wt ΔLbdcap 复制子 poly-（C） 束中估计的 35 个胞嘧啶相比，两个 poly-（C） 束的长度都更大。这些构建体被认为在多聚 （C） 束长度上足够接近，以便能够可靠地比较它们的反式包封效率。
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图 8. 缺乏 PK1 的复制子降低了反式包封效率。
（A） ΔPK1 和 ΔPK2 缺失突变体的 PK 区 5'-末端的比对，使用红色表示 PK2 特有的核苷酸（在 ΔPK1 中，上图），或绿色表示 PK1 特有的核苷酸（在 ΔPK2 中，下图）。在反式包膜测定中测试含有这些突变体的复制子，并报告 （B） 第一轮 GFP 对象计数，（C） 第一轮绿色 MFI 和 （D） 第二轮 GFP 对象计数。（E） 使用含有缺失的转染病毒转录本的 CPE 发育测定。显示的数据表示一式三份孔的平均值，误差线表示 12 张图像的 SEM。使用单向方差分析 （BD） 或通过在样品和 wt 转录本 （E） 之间使用 Wilcoxin 检验显示与 wt GFP 复制子相比的显着性 （**** p < 0.0001）。（F） 使用 XbaI 和 NheI 消化质粒，目标凝胶片段纯化并在 Tapestation 上通过电泳分析。分子量标准显示在泳道 1 中，C35 wt 复制子质粒显示在泳道 2 中，C39 ΔPK1 质粒位于泳道 3 中，C40 ΔPK2 质粒位于泳道 4 中。显示了一个实验，代表三个实验重复。在本实验中，来自 C35 wt 质粒的片段估计为 395 nt（预期大小为 351 nt），C39 ΔPK1 和 C40 ΔPK2 片段估计分别为 355 nt 和 357 nt（预期大小为 311 nt 和 313 nt）。虽然估计的长度与预测的长度不同，但正如从序列中预测的那样，wt 和 ΔPK 片段之间的差异为 40 nt。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.g008
在第一轮反式包膜测定中，PK1 或 PK2 的缺失并没有显着降低每个复制子的复制水平;尽管与 WT 复制子相比，两者的 GFP 对象计数更高，但这些差异并不显著（图 8B）。此外，C39 ΔPK1 ΔLbdcap GFP 复制子表达 GFP 的强度水平与 wt 复制子相似，而 C40 ΔPK2 ΔLbdcap GFP 复制子产生的 GFP 荧光明显比其他两个中的任何一个都强（图 8C）。这些复制子复制的相似性使得在第二轮反式包膜测定中的直接比较成为可能。
在第二轮中，两种复制子的峰值 GFP 计数在等效时间达到，但值显著不同;ΔPK1 的包封效果不如 wt 复制子 （43%），而 ΔPK2 复制子的包封效率明显高于 wt 复制子 （127%）。然而，这可能是由于复制能力的差异，第一轮的 GFP 信号证明了这一点（图 8D）。
为了通过病毒活力分析来加强反式包膜测定的结果，还将单个 PK 缺失引入感染性拷贝质粒中，然后将 RNA 转录本转染到细胞中进行 CPE 发育测定。这些转染后感染性病毒的恢复和 CPE 的形成基于单层汇合;汇合度的降低代表 CPE 通过细胞变圆和细胞裂解/死亡的进展，这两者都导致感染细胞占据的区域减少。因此，CPE 开发用于确定转染后通过细胞单层感染进展的相对速率。
转染后，ΔPK1 病毒在细胞中扩散，导致 CPE 的速度比 wt 或 ΔPK2 病毒慢，两者彼此相当（图 8E）。病毒传播的延迟可归因于在反式包膜测定中的等效构建体中观察到的包膜缺陷（图 8D），包膜速率的降低延迟了后代病毒粒子的产生。
讨论
在早期发表的工作中，据报道 FMDV 中的反式包膜效率低下，尤其是与 PV 相比 [34]。据推测，这可能是由于偏好将 FMDV 基因组包装成顺式中提供的衣壳蛋白，或者偏好包装全尺寸基因组而不是较小的复制子，但这些假设均未得到验证。
目前的研究表明，先前发表的 FMDV 反式包膜测定的一个主要问题是复制子 RNA 的包装被 wt 辅助病毒 RNA 竞争。这部分是由于复制子中缺乏衣壳编码区，因此该区域不存在 PS [35]。然而，早期的 PV 复制子反式包膜研究表明，尽管 PV 衣壳区域等效缺失，但反式包膜反应相对有效 [25]。肠道病毒同样包含分散在整个基因组中的PSs，包括衣壳编码区[25]，这表明FMDV复制子中衣壳编码区的缺失不太可能是反式包膜效率低下的唯一原因。
这种低效率可以部分通过降低衣壳供体的竞争力来克服。至关重要的是，通过与经过修饰以包含比复制子中的更短的 poly-（C） 束的病毒 RNA 转录本竞争，复制子的包封效率要高得多。考虑到该检测的先前迭代都使用 wt 病毒作为衣壳供体，并且 wt 病毒通常包含一个具有超过 100 个胞嘧啶的 poly-（C） 束 [11]，先前观察到的降低的反式包膜效率可能与所用衣壳供体中 poly-（C） 束的长度直接相关。PV 不包含多聚 （C） 束，因此该特征无法解释 PV 和 FMDV 复制子反式包膜的差异。为了解决 FMDV 中的这个问题，我们使用了带有截短的 poly-（C） 束的转录本作为衣壳供体。这减少了 FMDV 复制子面临的竞争，使反式包膜测定成为一种灵敏、特异性和可重复的方法，用于确定各种突变对 FMDV 基因组包装的影响。
反式包膜测定使我们能够确认 PSs 在 FMDV 包膜中起重要作用。然而，并非基因组中的所有 PS 都具有相同的效果。Logan 等人对 PS 进行了功能测试。[35]，即 PS2、PS3 和 PS4，与 wt 病毒相比，累积导致病毒活力下降，但病毒仍然能够包装和传播。同样，使用 ΔLb GFP 病毒作为受体将 PS3-5 重新引入 GFP 复制子，与 ΔP1 GFP 复制子相比，导致包封效率增加，尽管 ΔP1 GFP 复制子仍然被包装，表明这些单独的 PS 显然不是必需的。
相比之下，与衣壳编码区中的 PS（s） 相比，PK 区中的 PS（s） 似乎对包装更为重要。删除 PK 区域几乎消除了复制子反式包膜化，虽然 C11 ΔPK1234 中的缺失也影响了复制子复制动力学，但这不足以解释反式包膜化的减少。
仅删除 PK 区域的一部分也严重阻碍了包封，但不会影响复制或翻译。PK1 似乎特别重要，因为删除它严重减少了包膜，而 PK2 的等效缺失似乎增加了包膜，尽管这可能是由于与 wt 复制子 （C35） 相比 （C40） 该转录本中多聚 （C） 束的长度增加，或者是由于在第一轮测定中从 GFP MFI 观察到的复制子复制能力的增加。PK1 也对应于 Logan 等人具有最大约束的推定 PS。[35] 确定，支持该位置的 PS 对 FMDV 包膜特别重要的假设。然而，当单独删除 PK1 时，仍然会发生相当多的包封，表明 PK1 本身并不是必需的。从 PK1 和 PK2 的排列中可以看出对此的解释（图 8A）;除了 5' 末端附近的一段核苷酸外，序列几乎相同，因此 PK2 可能能够承担 PS 的作用。这种相似性确实包括 PK3 和 PK4，尽管后两个 PK 的序列确实差异略大。当 ΔPK234 和 ΔPK34 中 PK 区的大部分被删除时，反式包膜同样减少。这种减少可归因于 PK1 中破坏 PS 的“场外”效应或活性 PS 的缺失。如果是后者，则 PK 的冗余可能是因为多个 PS 可能会协同作用以加强 PS 相互作用，其中最 5' 的 PS （PK1） 尤为重要。
由于 PK 区域及其包含的 PS（s） 对包膜的重要性，我们假设 poly-（C） 束对包膜的影响是由于它靠近 PK1 和 PS1。poly-（C） 束本身不是 PS，而是充当 PK 区和高度结构化的 S 片段之间的间隔区，使 PS 能够独立于上游组分折叠。要实现这一目标，可能需要最少数量的胞嘧啶，最佳数量可能约为 100 个，如 wt 病毒 [11]。这一要求可以解释为什么具有截短的 poly-（C） 束的病毒会迅速恢复其 poly-（C） 束，以及为什么所有 FMDV 菌株都包含这种不寻常的特征，因为它们是在包封瓶颈期间被选择的。
由于两个原因，poly-（C） 束在包封中的作用可能仍未被发现。首先，poly-（C） 束可以从截断中迅速恢复。据报道，在多聚-（C） 束中留下至少 6 个核苷酸的截断会恢复到 wt 长度 [16]，在这里，我们证明了 11 个核苷酸的多聚-（C） 束在一次传代后也是如此。这使得对其作用的调查变得困难，因为长度是如此可变。因此，必须在转染后直接评估构建体，而不是使用回收的病毒，因为挽救病毒的过程允许多聚 （C） 束延伸并可能抵消原始质粒构建体内截断的影响。其次，结果以前可能由于缺乏来自更具有包装能力的结构的竞争而被掩盖。在这里，我们已经表明，尽管包含较长 poly-（C） 束的基因组被优先包装，但在没有竞争的情况下，从具有不同长度的 poly-（C） 束的构建体中回收病毒的速率是无法区分的。
应该注意的是，含有仅两个核苷酸 （C2） 的 poly-（C） 束的病毒已被证明可以感染小鼠并在细胞培养物中生长，但滴度明显低于 wt 病毒 [16]，这可能是由于包膜受损。从这种 C2 构建体中回收的病毒通常具有 42 nt 缺失，对应于 PK1，我们将其强调为重要的 PS [35]。我们已经表明，仅缺乏 PK1 的构建体仍然能够封装在反式中，尽管效率低下，这表明其他 PK 中的类似序列能够作为替代品，尽管效率降低。然而，只有当 PK1 存在可以帮助其折叠成正确 PS 确认的 poly-（C） 束时，这种效率降低可能才会发生。因此，当与严重截短的 poly-（C） 束结合时，这会阻止 PK1 正确折叠，PK1 的缺失可能是有益的，并在包膜过程中被选择。
基于这些结果的潜在包装模型提出 PK 区域可以采用两种替代构象;第一个是典型的 PK 区，由四个假结组成，第二个是包装能力构象，其中 PS 暴露并能够与衣壳前体结合并启动包膜（图 9）。这将使 RNA 能够遵循两种途径之一，具体取决于所采用的构象;以打包为重点的途径和以复制为重点的途径。这种在两种 RNA 构象之间控制病毒生命周期不同方面的转变是在其他 RNA 病毒家族中观察到的一种机制 [41–43]。
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图 9. 衣壳组装模型。
负链 RNA（蓝色）作为形成相应正义链 RNA 分子（棕色）的模板，当 RNA 从复制复合物中出现时，PS1 形成茎环。（A） 如果新生的 PS1 遇到五聚体，则相互作用会稳定茎环构象中的 RNA。随着 RNA 继续从复制复合物中出现，随后的包装信号形成，这些信号与其他五聚体相互作用，形成衣壳组装的“细胞核”。一旦完成，基因组就完全封装在新的病毒粒子中。（B） 如果没有稳定 PS1 的五聚体，RNA 茎环塌陷成假结构象，完成的正义链用于翻译和/或进一步的 RNA 复制。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.g009
在这个拟议的模型中，当新复制的正链 RNA 分子从复制复合物中出现时，PK1/PS1 区域的 RNA 最初采用显示“初级”PS PS1 的瞬时构象。在这种新生状态下，PS1 与五聚体亚基结合，以稳定 PS1 的包装构象并启动包封。然后，这种 RNA-五聚体复合物可以作为衣壳组装的成核位点，新兴的复制 RNA 通过“二级”PS 参与额外的五聚体，并将它们战略性地排列在组装衣壳内。这可能有助于根据 PS 与附近五聚体的相互作用，将 FMDV 基因组折叠成具有小流体动力学半径的紧凑构象。所得颗粒通过 VP0 成熟裂解成 VP2 和 VP4 转化为感染性病毒。或者，如果从复制复合物中出现的 RNA 未能与衣壳前体相互作用，则瞬时 PS 构象塌陷为能量更有利的 PK 构象，并且 RNA 用作进一步复制和/或翻译的模板。
在这个模型中，我们将 PS 分为两类——一类是单一的初级 PS，我们假设它对基因组包封至关重要，并充当包封引物;和次级 PS，它们单独不是必需的，但每个都有助于对包封的累积效应。该模型涉及 PSs 和五聚体亚基浓度之间的相互作用，可以解释小核糖核酸病毒包膜的高度特异性以及为什么它只涉及主动复制 RNA [44]。它还提供了一种机制，用于优化从复制和转换到打包的过渡时间。
此外，该模型与先前提出的封装模型兼容。例如，在 PV 中，早期研究表明蛋白质-蛋白质相互作用是包膜的关键 [4,33]，而 RNA PS 的重要性较低 [45]。然而，此后在整个 PV 基因组中发现了推定的 RNA PS [25]，这表明 PV 包封可以利用蛋白质-蛋白质相互作用和 RNA-蛋白质相互作用。即使基因组的大部分已被重新编码，由于二级 PS 提供的个体贡献相对较低，任何剩余的二级 PS 的存在可能足以实现包封，二级 PS 系统中具有冗余元素。PS 的结构也被认为相当简单，由一个小的茎环组成，在环的远端有一个嘌呤堆栈，因此在重新编码过程中添加等效的茎环也是可行的，这有助于促进包封。
我们提出蛋白质-蛋白质和 RNA-蛋白质相互作用可以在我们的模型中协同作用，其中蛋白质-蛋白质相互作用促进衣壳前体募集到小核糖核酸病毒中的复制复合物中，为 RNA 和衣壳前体相互作用提供机会。正如我们的模型所建议的那样，在这个定位之后，初级 PS 启动包膜，而分散在整个基因组中的次级 PS 促进 RNA 包封过程。
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S1 图
（A） 复制子 GFP 表达和反式包膜效率在 RNA 复制抑制剂存在下。将 ΔP1 和 ΔLbdcap GFP 复制子转染到存在 （绿色和橙色线） 和不存在 （紫色和黑色线） GuHCl（一种复制抑制剂）的细胞中。使用 Incucyte® S3 活细胞成像仪随时间读取绿色 MFI，以测量复制 RNA 和仅起始翻译的 GFP 表达水平。显示的数据表示一式三份孔的平均值，误差线表示 12 张图像的 SEM。（B） 在 RNA 复制抑制剂存在下复制子 GFP 表达和反式包封效率。当第一轮在存在或不存在 GuHCl 的情况下进行时，通过计数 GFP 病灶的数量来测量第二轮反式包膜测定的读数。显示的数据表示一式三份孔的平均值，误差线表示 12 张图像的 SEM。（C、D）S1 的平均和标准误差数据图 A 和 B。（E） 使用 Incucyte 软件分析的代表性图像，以获得： 收获点的 MFI 数据： （i-vi） S1 图 A ΔP1 和 ΔLbdcap GFP 复制子，在存在和不存在 GuHCl 的情况下，以及仅细胞和仅衣壳供体对照;和 （vii-xii） S1 图 B ΔP1 和 ΔLbdcap GFP 复制子的峰值 GFP 对象计数数据，在存在和不存在 GuHCl 以及仅细胞和仅衣壳供体对照的第一轮测定中转染后。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.s001
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S2 图
（A） 转染复制子 RNA 在细胞中的相对稳定性和复制能力。将复制子 RNA 转录本转染到细胞中，在 15 分钟后洗涤，并在转染后 15 分钟或 6 小时后（相当于转包膜测定的收获时间点）在存在或不存在 3 mM GuHCl 的情况下收获。提取 RNA 后，根据 Ct 值通过 RT-qPCR 评估相对 RNA 产量。实验一式三份进行，平均值和标准误差在此处显示。在 PK 缺失的构建体与 wt 复制子的等效样品之间未观察到显著差异 （P < 0.005），也未观察到每个构建体存在或不存在 GuHCl 的明显差异。虚线表示截断点。（B） S1A 的 RNA 丰度值，包括平均值和标准误差数据。根据 ct 值（假设 100% 聚合酶效率）计算值并乘以 10^12 以提高量表，以便于解释。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.s002
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S3 图
（A-C）图 3A-3C 的平均误差和标准误差数据。（D） 使用 Incucyte 软件分析的代表性图像，以获得：图 3A 和 3B 收获时的 GFP 对象计数和 MFI 数据 （i） ΔP1 GFP 复制子，（ii） ΔLbdcap GFP 复制子，（iii） 仅细胞和 （iv） 仅衣壳供体;以及图 3C （v） ΔP1 GFP 复制子、（vi） ΔLbdcap GFP 复制子和 （vii） 仅转染复制子的 GFP 对象计数峰值数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.s003
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S4 图
（A-E）图 5A-5E 的均值和标准误差数据。（F） 使用 Incucyte 软件分析的代表性图像，以获得：（i-iv） 图 5A 和 5B ΔP1 C11、C29 和 C35 GFP 复制子和仅细胞对照在收获时的 GFP 对象计数和 MFI 数据;图 5C ΔP1、C11、C29 和 C35 GFP 复制子和仅转染复制子对照的 GFP 对象计数峰值数据;（ix-xx） 单层汇合度，用于测量 C11、C29 和 C35 IC 的 CPE，并且仅在 0、12 和 24 小时（对于 图 5D）细胞对照;图 5C 的 ΔP1、C11、C29 和 C35 GFP 复制子的 （xxi-xxiv） 和峰值 GFP 对象计数数据，以及图 5E 的转染复制子仅对照。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.s004
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S5 图
（A-C）图 7A-7C 的平均误差和标准误差数据。（D） 使用 Incucyte 软件分析的代表性图像，以获得：（i-vi） 图 7A 和图 7B ΔP1 wt、C11、ΔPK34、ΔPK234 和 C11 ΔPK1234 GFP 复制子和仅细胞对照的 GFP 对象计数和 MFI 数据;以及图 7C （vii-xii） ΔP1 wt、C11、ΔPK34、ΔPK234 和 C11 ΔPK1234 GFP 复制子和仅转染复制子对照的峰值 GFP 对象计数数据。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.s005
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S6 图
（A-D）图 8B-8E 的平均误差和标准误差数据。（E） 使用 Incucyte 软件分析的代表性图像，以获得：（i-iv） 图 8B 和 8C wt、C39 ΔPK1 和 C40 ΔPK2 ΔLbdcap GFP 复制子和仅细胞对照的收获点的 GFP 对象计数和 MFI 数据;图 8D （v-viii） wt、C39 ΔPK1 和 C40 ΔPK2 ΔLbdcap GFP 复制子和仅转染复制子对照的峰值 GFP 对象计数数据;和 （ix-xx） 单层汇合度，用于 wt、C39 ΔPK1 和 C40 ΔPK2 IC 的 CPE 测量，以及 0、12 和 24 小时仅电池对照。
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012283.s006
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确认
作者还要感谢 Stephen Curry 教授在攻读博士学位期间作为 CN 导师提供的支持。
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