免费医学论文发表-染色质重塑因子 Chd7 在神经嵴中受组织特异性转录因子的发育调节
露丝·威廉姆斯 ，古内什·泰勒，Irving T. C. Ling （欧文 T. C. 凌），伊万·坎迪多-费雷拉，丹尼尔·方丹，莎拉·梅耶斯，Perihan Seda Ateş-Kalkan，朱莉安娜·豪格 （Julianna O. Haug），安德鲁·普莱斯，
抽象
神经方骨病（例如 CHARGE 综合征）是由神经嵴发育异常引起的。很大一部分 CHARGE 病例归因于编码 CHD7 的基因中的致病性变异，CHD7 是重塑染色质的染色质。虽然 CHD7 在神经嵴发育中的作用有据可查，但尚不清楚该因子如何在神经嵴细胞中特异性上调。在这里，我们使用雏鸡和人神经嵴的表观基因组分析来识别一组调节神经嵴细胞和其他组织中 Chd7 表达的增强子。我们在功能上验证了候选增强子处的上游转录因子结合，揭示了神经嵴主调节因子和 Chd7 之间新的上位关系，显示了全局作用的染色质重塑剂的组织特异性调节。此外，我们在人类胚胎表观基因组数据中发现了保守的增强子特征，并验证了人类等效 CHD7 增强子在雏鸡胚胎中的活性。我们的研究结果将 Chd7 嵌入神经嵴基因调控网络中，并为解释没有因果分配的 CHARGE 综合征病例提供了潜在的临床相关元素。
数字
图 4图 1图 2图 3图 4图 1图 2图 3
引文： Williams RM， Taylor G， Ling ITC， Candido-Ferreira I， Fountain DM， Mayes S， et al. （2024） 染色质重塑剂 Chd7 在神经嵴中受组织特异性转录因子的发育调节。公共科学图书馆生物学22（10）： e3002786。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786
学术编辑： Anna Kostadinova Kicheva，奥地利奥地利科学技术研究所
收到： 2024 年 3 月 1 日;接受： 2024 年 8 月 2 日;发表： 10月 17， 2024
版权所有： © 2024 Williams et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 与本研究相关的所有原始和处理数据均已提交给 NCBI 基因表达综合 （GEO），登录号如下：GSE121527（鸡 Capture-C 和颅神经嵴 ATAC-seq），GSE125711（鸡迷走神经嵴 ATAC-seq 和 Tfap2B ChIP-seq），GSE261486（鸡 Sox10 ChIP-seq，Pax7 Cut 和 Run），GSE262042（人胚胎 ATAC-seq）。GSE270155（来自 HH10 雏鸡胚胎的 10X 单细胞 RNA-seq 数据）。
资金： 这项工作得到了 Wellcome Trust （215615/Z/19/Z） 和 Stowers 医学研究所对 TSS 的机构支持。人类胚胎多组数据集是由 DMF 为牛津大学的一项不同研究生成的，并由 CRUK 博士培训计划 （BST00230-H400.01） 资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
缩写： DRG / 背根神经节;gRNA， 引导 RNA;GWAS， 全基因组关联研究;HCR， 杂交链式反应;NEB， 细胞核提取缓冲液;PFA， 拟解甲醛;圆周率 蛋白酶抑制剂;PWM、 位置权重矩阵;红细胞 红细胞;泰德 拓扑关联域;TF / 转录因子;WGCNA， 加权基因共表达网络分析
介绍
神经嵴是一种瞬时和迁移的胚胎祖细胞群，有助于脊椎动物体内的大量神经和间充质组织。神经-神经嵴衍生物包括面部神经节，以及外周和肠道神经系统的神经元和神经胶质细胞。间充质神经嵴衍生物包括颅面软骨和骨骼，以及面部血管的平滑肌、形成心脏流出道和隔膜的横纹肌，以及人体的大部分色素细胞。因此，神经嵴模式、迁移和分化的错误导致广泛的先天性出生异常，统称为神经嵴病。神经嵴病几乎占所有出生缺陷的 1/3 [1]。这些疾病包括CHARGE综合征，可影响眼睛、心脏和面部结构[2,3];先天性巨结肠，其特征是神经嵴衍生的肠神经节缺失 [4,5];Waardenburg 综合征，以耳聋、色素沉着和颅面缺损为特征 [6];以及表现为颅面缺损的Treacher Collins综合征[7,8]。神经嵴病可由主神经嵴调节因子的致病性变异引起，例如先天性巨结肠和Waardenburg综合征中的SOX10 [9–13]或Waardenburg综合征中的PAX3 [14–16]。然而，编码一般细胞机制的基因突变也可能导致神经方动脉病，如RNA聚合酶I.致病性变异引起的Treacher Collins综合征[8]和CHARGE综合征所示，其中检测到染色质重塑因子CHD7（染色质结构域解旋酶DNA结合蛋白7）的杂合突变[17]。
CHARGE 综合征 （OMIM 214800） 个体表现为眼缺损、心脏畸形、后鼻孔闭锁、生长迟缓、生殖器发育不全和耳部异常。CHD7 的 500 多种不同致病性变异已被报道，占 CHARGE 综合征病例的 >90% [18,19]。然而，在常规临床筛查中，仅在 32%-41% 的疑似 CHARGE 病例中检测到 Chd7 突变 [18]。在整个 CHD7 基因体中都有致病性变异的报道，表明该蛋白的过早终止对 CHD7 功能显著有害 [18–22]。CHD7 以 ATP 依赖性方式催化核小体重新定位，从而影响基因调控 [18,23] [24]。为了与这种调节作用保持一致，CHD7 与携带小鼠胚胎干细胞中稳定增强子特征的 H3K4me1 染色质修饰的远端调节位点相关 [25]。
先前的研究表明，CHD7 功能对于正常的神经嵴发育和迁移至关重要。在人神经嵴细胞的细胞模型中，CHD7 占据了神经嵴转录因子 SOX9 和 TWIST1 的远端调节元件 [26]。在小鼠中，Chd7杂合子表现出CHARGE综合征样特征[27–29]，而躯干神经嵴细胞需要Chd7来维持其多能性[30,31]。在非洲爪蟾中，Chd7 突变胚胎降低了 Sox9、Twist1 和 Snai2 的表达，并表现出 CHARGE 综合征样特征 [26]。最近在鸡神经嵴方面的研究采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）分析[32]，表明Chd7表达与神经嵴调节因子（Sox5、Sox9、Zeb2和NeuroD4）、其他染色质重塑因子（Kdm1B、Kdm2A、Kdm3B、Kdm7A）和信号素（Sema3A、Sema 3E、 Sema4D、Sema6D），这些药物先前已被证明在小鼠中受 Chd7 调节 [33]。总的来说，这些发现为将 Chd7 定位在神经嵴基因调控网络中提供了强有力的证据。然而，尚未研究控制神经嵴中 Chd7 上调的调节机制。由于 CHD7 是一般细胞表观遗传机制的一个组成部分，并且在多种胚胎组织中广泛表达，因此可以假设其表达受基础近端增强子的控制;然而，CHARGE 综合征的临床特征清楚地表明 CHD7 具有组织和发育阶段特异性作用 [3]。
在这里，我们确定了在发育中的雏鸡胚胎中驱动 Chd7 表达的多种新型增强子。我们在体内验证增强子活性，并在功能上确定介导神经嵴中 Chd7 增强子活性的关键上游转录因子。使用人类胚胎染色质可及性数据，我们发现神经嵴特异性 CHD7 增强子高度保守。此外，我们证明人类增强子在鸡胚胎发育中很活跃，这表明增强神经嵴中 Chd7 的组织特异性调节机制在鸡和人之间是保守的。我们的研究结果提供了一种潜在的机制来解释 CHARGE 综合征的病因，其中 Chd7 基因本身不受干扰。最后，我们证明了组织特异性转录因子对染色质重塑剂的上游调节是确保增强发育中的神经嵴中染色质重塑活性的重要机制。
结果
Chd7 在雏鸡早期发育过程中的表达
先前显示 Chd7 在来自鸡颅神经嵴细胞的大量 RNA-seq 数据中富集 [32]，在那里它与其他神经嵴基因共表达，并与迁移前神经嵴标志物聚集 https://livedataoxford.shinyapps.io/Chick_NC_GRN-TSS-Lab/。在这里，我们使用荧光原位杂交（杂交链反应，HCR）[34] 来解析发育中的鸡胚中的时空 Chd7 表达。Chd7 首次在颅神经管和迁移前神经嵴细胞内的 HH8 [35] 处检测到，与神经嵴标志物 Sox10 共定位，并且在周围神经外胚层中处于较低水平（图 1A）。Chd7 转录本在 HH9/10 的分层和迁移神经嵴细胞中继续与 Sox10 重叠，并且在 HH9 到 HH15 的迷走神经水平的神经外胚层、前脑和神经管中也被检测到（图 1A 和 1B）。在后期 （HH13—HH15），Chd7 表达更广泛，转录本分布在头部区域 （中脑和后脑），包括三叉神经节、发育中的面部间充质、眼睛和耳囊以及一些迷走神经嵴细胞。此外，在 HH15 时，咽弓和背根神经节细胞也呈 Chd7 阳性（图 1B）。对 Chd7 转录本的 HCR 信号进行定量显示，大约 85% 的 DAPI 阳性细胞表达 Chd7，而 Chd7 和 Sox10 双阳性细胞的表达率为 10%（图 1C）。
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图 1. Chd7 在雏鸡早期发育过程中的表达。
（一、二）使用 HCR 测定体内 Chd7 表达（绿色）。Sox10 （洋红色） 用作神经嵴标记物。（A） Chd7 在神经嵴细胞和整个神经管中表达，以及 HH8-10 的周围外胚层和底层中胚层。（B） Chd7 在 HH13-HH15 处更广泛地表达，包括头部和后脑结构。从 HH13 到 HH15，在耳囊泡 （ov）、三叉神经节 （tg） 眼和迷走神经嵴 （vNC） 中检测到 Chd7 的表达。在 HH15 处，Chd7 也在咽弓 1-4 （pa1-4） 和背根神经节 （drg） 中表达。（C） 对 HH10 期鸡胚胎中 Chd7 和 Sox10 转录本的 HCR 信号进行定量 （n = 4）。（D） 5,669 个单细胞的 UMAP 表示，基于共享的转录身份解析为 12 个簇。（E） Chd7 和 Sox10 在 scRNA-seq 簇中表达的特征图。（F） 在 scRNA-seq 簇中表达的选定染色质重塑因子和转录因子的小提琴图。HCR，杂交链式反应。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786.g001
为了测量整个胚胎中单个细胞中 Chd7 表达的动力学，我们使用 10X Genomics 3' scRNA-seq 平台进行了单细胞 RNA-seq。我们解剖了 10 个 HH10 雏鸡胚胎的前半部分（图 1D），获得了 5,669 个单细胞转录组，分解成 12 个簇（图 1E）。在所有簇中检测到 Chd7 表达（图 1F），与其他染色质重塑因子相当（图 1G 和 S1A），与真实转录因子的簇特异性表达（图 1F、1H 和 S1B）相反。至关重要的是，这表明控制组织特异性转录因子和更广泛表达的染色质调节因子动态表达的调节机制存在内在差异。
Chd7 基因座的表观基因组注释可识别许多增强子元件
Chd7 在雏鸡早期发育过程中广泛表达，与其作为染色质重塑剂的功能一致;然而，Chd7 转录本在发育中的神经嵴中显着富集，这与它在 CHARGE 综合征中的已知作用一致。接下来，我们询问了这种普遍存在的因子是否可以在神经嵴中以组织特异性方式进行调节。为此，我们探索了神经嵴特异性表观基因组特征，这些特征描绘了与 Chd7 启动子相互作用的推定增强子。我们首先使用下一代 Capture-C [36] 确定了 Chd7 拓扑关联结构域 （TAD），这是一种适用于低细胞数的高分辨率靶向 3C 方法。使用来自 HH8-10 雏鸡胚胎的解剖背神经管组织和来自 10 日龄雏鸡胚胎的分化红细胞 （RBC） 作为对照，我们分辨出了一个约 1.1 Mb 的广泛神经嵴特异性 TAD，跨越 Chd7 启动子上游约 85 Kb，下游约 1 Mb，包括整个基因体（图 2A）。
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图 2. 来自神经嵴 Capture-C 和 ATAC 数据的 Chd7 增强子预测。
（一、二）galGal5 中小鸡 Chd7 位点的 UCSC 基因组浏览器视图。（A） 来自 HH10 和对照 RBC 的颅神经嵴的 Capture-C 轨迹，显示 Chd7 TAD。使用 DESeq2 确定差分交互作用，使用 Wald 检验检验假设，并使用 Benjamin-Hochberg 方法针对多重检验进行校正。Wald 统计轨迹 （stat， in pink） 表示 LogFoldChange 值及其标准误差的比率。（B） FACS 分别使用 FoxD3 增强子 NC1（颅骨）和 FoxD3/Ednrb 增强子 NC2/E1 收集的来自 HH10 颅骨 [32] 和 HH18 迷走神经 [37] 神经嵴细胞和非神经嵴对照细胞的 ATAC-seq 数据。Chd7 TAD 中推定的增强子用灰色框表示。（C） 用于递送增强子报告基因构建体的离卵鸡胚胎电穿孔技术的示意图。（D） 在用普遍的电穿孔对照 pCI-H2B-RFP（洋红色）在 HH4 进行离卵电穿孔后，从 HH12 的指示增强子中记录的荧光报告基因活性（绿色）。（E） 通过 HCR 检测到大约 HH12 的胚胎横切面显示绿色增强子活性和 Sox10 洋红色表达。迁移的神经嵴细胞用箭头表示。（F） 卵内鸡胚胎电穿孔的示意图。（G） 在用无处不在的电穿孔对照 pCI-H2B-RFP（洋红色）在 HH9 的卵电穿孔进入神经管后，从 HH15 的指示增强子记录的增强子活性（绿色）。宾夕法尼亚州;咽弓，TG;三叉神经节，OV;耳囊、马、下颌弓。（H） 用于将增强子报告基因盒整合到基因组中以观察体内持续增强子活性的 AcDs 构建体示意图。（I） AcDs 增强子报告质粒卵电穿孔后指定增强子的后期增强子活性，nt;神经管，MES;中脑，Hb;后脑。HCR，杂交链式反应;RBC，红细胞;TAD，拓扑关联结构域。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786.g002
接下来，我们使用分别从雏鸡颅 [32] 和迷走神经 [37] 神经嵴和非神经嵴对照细胞获得的 ATAC-seq 数据，研究了 Chd7 TAD 内的染色质可及性景观（图 2B）。我们根据神经嵴细胞中的染色质可及性选择了推定的 Chd7 增强子。总共选择了 14 个推定的增强子（A、B1/B2、C、D、F、H、I、J、O、P、Q、R、S、T），并使用荧光增强子报告基因测定筛选体内增强子活性 [32,38]。为了确定增强子活性的完整时间范围，我们在 HH4 进行了离卵电穿孔，其中整个胚胎是目标，但电穿孔后的发育时间有限（图 2C）和 HH8 的卵电穿孔，这允许进一步分析发育，但仅针对神经管和神经嵴（图 2F）[39]。这些分析揭示了 11 个活性增强子（图 2D-2G 和 S2）。增强子 （enh） A、D、F、H 和 T 在 HH10-12 的颅神经嵴细胞分层和迁移中均具有活性（图 2D、2E 和 S2），这是由它们的活性与神经嵴标志物 Sox10 的表达共定位确定的（图 2E 和 S3）。在神经管中也观察到增强子 F、H 和 T 的活性（图 2D、2E 和 S2），而 enh-D 在整个神经外胚层中广泛活跃，与这些元件在非神经嵴细胞中的可及性特征一致（图 2B）。在 HH15 时，增强子 A、D、F、H 和 T 在头部间充质中动态活跃（图 2G）。在这个阶段，增强子 A、H 和 T 在三叉神经节中也活跃，并在迁移到咽弓时迁移心脏神经嵴细胞（图 2G）。我们没有在发育中的心脏本身中观察到任何增强子活性，这与在研究的阶段缺乏心脏 Chd7 表达一致。心脏特异性顺式调节可能在后期启动，激活该组织中的 Chd7 [40]。Enh-C 在咽弓中也很活跃，但主要活跃于神经管和在 HH10-15 处从后脑向后延伸的迁移前神经嵴细胞（图 2D、2E 和 S2）。在 HH15 时，在背根神经节 （DRG） 中也观察到 enh-C 活性（图 2G）。
我们还测试了位于 Chd7 基因第二个内含子内的 2 个大 ATAC 峰 （B1 和 B2）。我们发现 enh-B1 在 HH8 的迁移前神经嵴细胞和 HH12 的神经组织中表现出马赛克活性（S2 图）。Enh-B2 主要活跃在 HH12 的耳板区，后来在后脑和迷走神经水平的神经管 （HH25） 中活跃（S2 图）。Enh-Q （-127 kb） 在迷走神经管和宫颈水平以及 HH10-12 的耳板区的少量细胞中也具有活性。Enh-S 活性仅限于耳状板 （S2 图）。
Enh-O 活性局限于 HH8-10 的颅神经管，但在整个颅区域都活跃，包括 HH12 的迁移神经嵴细胞。后来，在迷走神经管中也检测到 （HH18） enh-O 活性（S2 图），与此阶段迷走神经嵴和非神经嵴的可及性一致（图 2B）。Enh-I 也可在神经嵴和非神经嵴细胞中使用，并且在 HH10-12 处在广泛的胚胎区域内活跃（S2 图）。Enh-J 在 HH12 时也广泛活跃于头部，但在 HH15 时局限于面部间充质和躯干（S2 图）。其他测试的推定元件 （enh-P 和 enh-R） （图 2B） 显示没有增强子活性。
由于我们最初的增强子报告基因系统是游离型的，因此随着开发的进行，报告基因构建体会降解和稀释。因此，在以后的时间点解释增强子活性是有问题的。为了规避这个问题，我们将AcDs玉米整合系统[41]调整为鸡模型。在该系统中，增强子报告基因盒的两侧是 Ds 重组位点，并与普遍表达 Ac 转座酶的质粒共电穿孔，导致该盒随机整合到基因组中（图 2H），随后在表达同源转录因子的细胞中稳定增强子活性。由于整合是随机的，因此可能由于染色质位置效应而未记录一些增强子活性或显得较弱;然而，与我们的游离型检测相结合，该系统为以后时间点的增强子活性提供了可靠的读数。我们选择 enh-C 和 enh-T 作为这种方法，因为这些区域在我们的 HH18 数据中很容易访问，因此可能在后期阶段活跃。我们跟踪增强子活性，直到卵电穿孔后 4 天。在中脑、后脑和神经管中检测到 Enh-C 活性，而 enh-T 在后脑的隐蔽区域活跃（图 2I）。
通过对雏鸡胚胎中 Chd7 表观基因组景观进行彻底调查，我们揭示了一大批推测控制 Chd7 表达的增强子。有趣的是，我们鉴定了几种在神经嵴中特异性活跃的增强子，而其他增强子在其他 Chd7 阳性组织中表现出更广泛的活性，从而证明了不同的组织特异性调节。
在人体内保护 Chd7 增强子活性
虽然很大一部分 CHARGE 综合征病例与 CHD7 基因本身的致病性变异直接相关，但仍有大量病例没有因果注释。我们假设 CHARGE 综合征的一些实例可能与 CHD7 间接相关，通过扰动控制 CHD7 表达的上游调节机制。为此，我们试图确定控制 CHD7 在人类中表达的调节元件。我们使用了 CS16/18/19（5 至 6.5 周）从颅组织样本中生成的 10X 多组数据（同时基因表达和染色质可及性单细胞分析），该数据类似于雏鸡 HH25-HH28。在质量控制（参见方法）之后，我们从 14,290 个细胞核中分离出 33 个簇（S4A 图）。CHD7 在所有簇中广泛表达（S4B 图），与其他染色质重塑因子相当，与组织特异性 TF 形成对比（S4B 和 S4C 图）。我们使用 UCSC 基因组浏览器中的 LiftOver 功能将雏鸡 Chd7 增强子的同源物映射到人类 ATAC 数据（图 3A）。我们在人类数据中确定了对应于雏鸡 Chd7 增强子的 5 个可访问元件，B、C、D、O 和 F（图 3A），并使用雏鸡增强子报告基因测定测试了这些人类同源序列（图 3B）。人类增强子 C 和 F 活性严格概括了它们的鸡对应物。与雏鸡相比，Enh-B 和 enh-D 更局限于神经组织，其中 enh-D 活性在后脑和中脑中检测到特别强。人类 enh-O 在后脑和中脑 （HH15-HH18） 以及面部间充质、耳板（HH15 处）也很活跃（图 3B）。增强子 -B 和 -C 在脊椎动物中非常保守 （PhastCons 评分 [42] 分别为 0.91 和 0.73，S2 文件），并且这些元件在躯干神经管中活跃。因此，这些元件的保守性与躯干神经嵴基因调控元件比颅神经嵴中的基因调控元件更保守的观点是一致的[43]。从这些人类 ATAC-seq 数据中，我们还克隆和测试了 20 多种推定的调节元件，并鉴定了 5 种新型组织特异性人类 CHD7 增强子。Enh-A5 和 enh-X7 主要活跃于神经管中，但也存在于周围的外胚层中，包括 HH12 的神经嵴细胞（图 3B）。在 HH15 时，enh-X7 在后脑和神经管中很强（图 3B）。人 enh-X2 和 enh-S 主要活跃于耳板中。这些元素在 cluster-6 中显示出可访问性增加，尤其是 enh-X2，它在这里完全开放。Enh-X2 保存良好 （PhastCons 评分 0.53），但由于我们的雏鸡数据是由神经嵴细胞生成的，并且该元件似乎具有耳特异性，因此在雏鸡数据中未检测到。人类 enh-X6 在集群 10 和 11 中也表现出受限的可及性，并且活动仅限于视区（图 3B）。
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图 3. 人类 CHD7 基因座的表观基因组景观。
（A） 人类基因组中的 CHD7 位点 （hg38， chr8：60,665,230–61,241,522），显示了来自人类胚胎颅骨样本生成的多组数据中 6 个簇的 ATAC 谱（参见方法）。从 galGal5 中取出的雏鸡增强子显示在橙色框中;新型人类增强子显示在灰色框中。还指出了来自 NHGRI-EBI GWAS 目录的 GWAS SNP。（B） 体外 HH12 和 HH15 在卵电穿孔后的体内人增强子活性（绿色）。普遍存在的电穿孔对照 pCI-H2B-RFP 以洋红色显示。GWAS，全基因组关联研究。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786.g003
我们还探讨了以前发表的从体外来源的人颅神经嵴细胞获得的表观基因组数据 [44]。具体来说，我们检查了与活性增强子 （H3K4me1、H3K27ac）、启动子 （H3K4me3） 和抑制染色质 （H3K27me3） 相关的组蛋白修饰的 ChIP-seq 数据，以及 ATAC-seq 数据（S4D 图）。除 enh-C 外，所有测试的增强子均用 H3K4me1 标记（S4D 图）;然而，这些数据是由颅神经嵴细胞产生的，并且 ENH-C 主要在躯干中活跃（图 3B）。大多数增强子在体外 ATAC 数据中显示出一定的可及性（A5、D 和 F 是例外）。Enh-B 和 enh-O 用 H3K27ac 标记，enh-O 也用 H3K4me3 标记，H3K4me3 也存在于 enh-S 中（S4D 图）。Enh-S 也具有 H3K27me3 富集，由于 enh-S 活性仅限于耳板，因此该区域在其他细胞类型中被抑制/压缩是合理的。enh-F 也是如此（S4D 图）。总的来说，我们从这些数据中观察到的结果证实了我们的体内增强子报告基因检测结果。
为了探讨 CHD7 增强子与 CHARGE 综合征之间的潜在关联，我们调查了人类全基因组关联研究 （GWAS） （https://www.ebi.ac.uk/gwas/genes/CHD7） 的 NHGRI-EBI 目录中的数据，以寻找 CHD7 增强子内的 SNP。我们发现大多数 SNP 位于 CHD7 的基因体内（图 3A），其中两个与 enh-B 重叠。其他 S 靠近 enh-C 和 enh-D。这表明 CHD7 增强子位于已经显示易受 CHARGE 综合征相关改变影响的基因组区域内。最近研究表明，单个 TF 基序中单个 SNP 水平的变化会导致结合亲和力的微小至中度改变，但会对增强子活性产生显著影响 [45]。因此，对 CHARGE 患者 SNP 的更广泛分析可能仍将增强子活性与推定的致病性变异联系起来。
通过比较人和鸡 CHD7 位点，我们证明了该基因在羊膜中的保守顺式调节。我们的研究结果说明了体外衍生数据的效用，同时强调了在体内胚胎环境中观察到的重要差异。此外，我们的研究结果提供了一种替代机制，通过该机制可以在 CHARGE 个体中改变 CHD7 表达，其中致病性变异不是在基因本身中检测到的，而是在其调节元件中检测到的。
Chd7 增强子受神经嵴转录因子的差异调控
增强子活性由转录因子 （TF） 与增强子序列中其同源基序的组合结合决定。事实上，这种相互作用是基因表达的细胞类型特异性调节的基础。为了探索鸡 Chd7 增强子内推定的 TF 结合，我们首先扫描了人类 TFs 结合基序，使我们能够识别每个增强子序列中的基序实例（S5 图）。接下来，我们使用对数比值比评分计算每个增强子内结合位点的富集（图 4A）。这两种方法产生的结果大致相似。在所有雏鸡 Chd7 增强子中，我们发现神经嵴相关 TF 的富集，例如 Tfap2、SoxE （Sox8/9/10） 和 SoxB1 （Sox2/3） 因子以及 Zic 家族成员的显着存在（图 4A）。许多增强子还包含 Arnt/Arnt2 和 ATF2 因子的基序，我们之前在对核心上游 TF 驱动神经嵴规范的调查中对此进行了描述[32]。鉴于 Chd7 增强子的广泛空间和时间范围，不同的 TF 组合很可能在不同时间点和不同的胚胎位置驱动增强子活性。特别是，我们注意到神经嵴特异性增强子 enh-A 和 enh-T 分别对 SoxE 和 Tfap2 因子进行了差异富集（图 4A 和 S5），表明同一细胞群（颅神经嵴）内 Chd7 调节的机制不同。Enh-H 与 enh-A 具有相似的特征，其中两种增强子都缺乏 Tfap2 位点，但富集了 Sox9/10 和 Sox2/3 位点。Enh-A、enh-F 和 enh-C 富集了转录抑制因子 Snai2 的基序，这可能阻止了 Snai2 高度表达的后脑区域的 enh-A 活性。Pax6/7 可能在 enh-C 和 enh-F 元件中规避了这种抑制活性，其基序在 enh-A 中明显缺失（图 4A）。此外，Pax6/7 表达与 enh-F 和 enh-C 活性重叠，在后脑区域的神经管中发现，在 HH12 的后方发现（图 2D）。在 HH15 处，enh-F 在发育中的眼睛中也很活跃，这与该区域的 Pax6 共表达一致（图 2D）。相反，enh-C 活性在躯干神经管中持续存在（图 2D），与 Pax7 在该区域的共表达一致。因此，Pax 结合基序可能解释了同源因子对这些增强子的差异时空调控。Enh-F 和 enh-S 富集了 SoxE/B 和 Tfap2 基序;然而，enh-S 在雏鸡胚胎中没有显示出增强子活性，这可能是由于 RXR 介导的染色质压缩，因为这些基序存在于 enh-S 中，但不存在于 enh-F 中。虽然 Zic 因子在神经、斑块和神经嵴区域广泛表达，但它们的结合基序在神经嵴增强子 （enh-A、T、C） 中基本不存在。只有 enh-F 在早期颅神经嵴细胞以及后脑区域的一些外胚层细胞中活跃，包含所有 Zic 因子 （Zic1、2、3） 的结合位点，表明该家族调节非神经嵴增强子活性，与表达模式一致。基序分析还表明 Ets1 与 Chd7 调控有关，其中 Ets1 位点在 enh-H 和 enh-F 中检测到（图 4A）。
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图 4. 控制 Chd7 增强子活性的上游转录因子。
（A） 热图显示雏鸡 Chd7 增强子内预测的 TF 结合基序。（B） 来自 UCSC 基因组浏览器的轨迹，显示 Sox10（紫色）、Tfap2B（蓝绿色）、Pax7（黄色）和 H3K27ac 的生物素-ChIP 数据。（C-E）在 Cas9 双侧电穿孔后，鸡胚胎显示指示的增强子活性 （GFP） 和 Cas9 （RFP），左侧靶向选定 TF 的向导 RNA（实验），右侧使用 Cas9 的加扰向导 RNA（对照）。（F） 用含有 enh-A 的构建体双侧电穿孔的鸡胚胎，其中左侧的所有 Sox 位点都已突变，右侧是野生型 enh-A 构建体，两者都驱动 GFP 表达。pCI-H2B-RFP 作为对照在两侧共电穿孔。（G） 相对于对照 RFP 强度，双尾配对 T 检验，enh-A 对 （C-E） 中 TF 敲除实验后增强子活性（GFP 强度）的损失从左到右量化;p = 0.023**，n = 7 个胚胎，enh-C;p = 0.114，ns n = 3，enh-T;p = 0.047*，n = 4。TF，转录因子。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786.g004
鉴于先前在 Chd7 和 Sox10 之间建立的关系 [46,47]，我们着手探索 Sox10 是否也可能在 Chd7 的上游发挥作用。此外，由于 TF 家族中特定因子的结合位点可能难以辨别，我们试图使用直接结合测定来验证我们的 TF 结合预测。首先，我们使用基于生物素-链霉亲和素的染色质免疫沉淀 （Biotin-ChIP） 分析了 Sox10 在全基因组范围内的结合 [48]。为此，我们生成了构建体，以便在 N 端或 C 端实现转录因子的 Avi 标记。此外，我们将增强子报告基因盒掺入构建体中，以允许 Avi 标记的 TF 在其同源增强子的控制下以组织特异性方式表达，从而不仅模拟时空模式，还模拟内源基因的表达水平 （S5B 图） （Addgene #110204， #110205， 参见方法）。在 Avi 标记的 Sox10 的情况下，我们使用 Sox10 enh-99（S5C 图）[32] 来驱动 C 端标记的 Sox10。与普遍表达的生物素连接酶 BirA （Addgene #127781） [37] 共电穿孔到 HH4 期鸡胚的上胚层后，Avi 标记的 TF 在体内被生物素化，便于使用链霉亲和素珠高度严格地分离该因子及其相互作用的 DNA 部分 [48]。因此，这使我们能够在不同阶段分离感兴趣的特定 TF，并在整个基因组范围内检查 TF 结合区域。与 ChIP 输入样本相比，大多数活性 Chd7 增强子显示出 Sox10 的一些结合（图 4B），表明 Sox10 是 Chd7 调节的关键参与者。神经嵴特异性增强子 enh-A 和 enh-T 显示出特别高的 Sox10 占有率，这与我们的基序分析一致（图 4A 和 S5）。Enh-H 和 enh-F 在 Sox10 结合区也显著富集，表明 Sox10 可能有助于其神经嵴特异性活性。其他活性不限于神经嵴的增强子，包括 enh-B、enh-C、enh-D 和 enh-O 也被 Sox10 结合，这表明 Sox10 驱动它们在神经嵴细胞中的活性，而其他因素控制它们在非神经嵴区域的活性。
Tfap2B 是已知的神经嵴规格因子。鉴于观察到 Tfap2B 基序在 Chd7 增强子中富集（图 4A），我们使用 HH18 胚胎的颅骨和迷走神经嵴细胞生成的 Tfap2B 生物素-ChIP-seq 数据检查了 Tfap2B 在这些元件上的直接结合 [37]（图 4B）。这些数据证实，正如我们的基序分析所预测的那样，Tfap2B 确实与 enh-T、enh-F、enh-B 以及 enh-Q 和 enh-I 结合（图 4A 和 S5A）。有趣的是，我们没有在 enh-A 处检测到任何 Tfap2B 结合，再次表明 Sox10 和 Tfap2B 对一些神经嵴特异性 Chd7 增强子的差异控制，很可能是特异性神经嵴亚群和可能的未来衍生物（图 4A）。接下来，使用 Cut&Run（在靶标下切割和使用核酸酶释放）测定 [49,50]，我们还分析了在 HH8-9 提取的背神经管组织中 Pax7 的结合（图 4B）。在这里，我们证实了 Pax7 在 enh-C 的结合，正如预测的那样，我们没有在 enh-F 检测到任何 Pax7 结合（图 4B），支持 Pax6 在 enh-F 中占据这个结合位点的假设。
上游转录因子的功能扰动破坏了增强子的活性
为了进一步解析 Chd7 增强子活性所需的关键 TF 组合，我们使用小鸡 CRISPR/Cas9 系统 [51] 同时敲低多个 TF。通过以双侧方式将增强子报告基因构建体与向导 RNA （gRNA） 和 Cas9 质粒共电穿孔 [39]（S5B 图），我们可以直接评估 TF 丢失对增强子活性的影响（图 4C-4E）。
由于所有 Chd7 增强子和神经嵴主调节因子结合的主要 TF，我们主要考虑包括 Sox10 的 TF 的敲除组合。我们还将功能评估重点放在神经嵴特异性增强子 enh-A 、 enh-T 和 enh-C 上。如上所述，enh-T 与 Sox10 和 Tfap2B 结合（图 4B），此外，该增强子富含 Sox2/3 结合基序（图 4A）。密切相关的旁系同源物的结合基序的相似性（例如，SoxB 因子 - Sox2/3 或 SoxE 因子 - Sox8/9/10）可能使得难以辨别占据特定位点的特定因子。然而，鉴于 enh-T 在耳平板区域也很活跃，其中 Sox3 比 Sox2 高表达，我们假设 enh-T 内的 SoxB 结合位点被 Sox3 占据。使用前面描述的 gRNA [32,37]，我们在胚胎左侧靶向 Sox10 与 Sox3 和 Tfap2B 的组合，并将对照 gRNA 应用于右侧，两侧也接受 Cas9-RFP 和 enh-T 驱动黄水晶构建体。与对照组右侧相比，这种扰动导致胚胎左侧迁移神经嵴细胞、神经管和耳区黄水晶表达降低（图 4C 和 4G）。
Enh-C 是唯一在躯干神经管中具有主要活性的 Chd7 增强子（图 2D）。TF 基序分析显示 enh-C 富含 Pax7 基序（图 4A），并且还包含 Sox9 结合的基序（S5A 图）。Pax7 和 Sox9 都在躯干神经管中表达。Pax7 和 Sox9 的联合敲除导致 HH10 躯干神经管中的 enh-C 活性降低（图 4D 和 4G）。
接下来，我们试图确定驱动 enh-A 活性的关键 TF 组合。Sox9 和 Sox10 位点均富含该增强子（图 4A）。考虑到 SoxE 因子在神经嵴中高度表达，具有相似的结合基序，并且经常合作，我们推断这些可能是 enh-A 活性的核心上游因子。我们还将 Ets1 确定为推定的上游因子（图 4A）。事实上，我们发现同时敲除 Sox9 、 Sox10 和 Ets1 导致迁移神经嵴中 enh-A 活性在 10ss 时显著降低（图 4E）。SoxB 位点也富含 enh-A;然而，这些因子的联合敲除对 enh-A 驱动的黄水晶表达没有影响，表明这些因子作为经典的转录抑制因子，抑制非神经嵴细胞中的增强子活性，与它们在神经组织中的表达一致。同时，我们生成了 enh-A 的突变构建体，其中所有 Sox 位点都发生了突变，这导致增强子功能降低（图 4F 和 4G），强化了 enh-A 主要由 Sox 因子驱动的观点。
使用证实我们的基序分析和 ChIP 数据的功能扰动实验，我们证明了 Chd7 神经嵴增强子的活性在功能上确实依赖于神经嵴转录因子。
讨论
基因表达的转录调控由顺式调节元件（增强子和启动子）介导，这些元件整合了上游转录因子对下游靶基因的作用。发育基因受位于远端的增强子的调节，这些增强子包含细胞类型特异性转录因子基序，有助于基因表达的空间和时间控制。相反，广义表达因子的调节往往由 TSS 近端增强子介导，TSS 近端增强子包含不同谱的普遍基序，从而实现稳定的核心启动子相互作用。远端作用增强子对无处不在的因子进行组织特异性调节的报道很少见。
尽管 CHD7 表达广泛，但人类 CHD7 的杂合缺失会导致 CHARGE 综合征，这是一种组织特异性神经嵴病，影响由神经嵴细胞模式化或来源于神经嵴细胞的结构。染色质重塑剂的组织特异性功能以前归因于与组织特异性转录因子的下游相互作用。例如，在雪旺细胞中，转录因子 SOX10 将染色质重塑复合物募集到 OCT6 和 KROX20 基因的顺式调控区 [52]，而在少突胶质细胞中，据报道 OLIG2 将 SMARCA4/BRG1 引导至基因的顺式调控区，从而控制其分化 [53]].同样，据报道，组织特异性转录因子直接将 PRC1 募集并靶向到巨核细胞中的染色质 [54]。此外，以前的 CHD7 研究解析了 CHD7 活性的下游靶标和伴侣，例如，据报道 CHD7 与 OCT3/4、SOX2 和 NANOG 一起与小鼠神经嵴干细胞中神经嵴转录因子 FOXD3 的增强子结合 [30]。在人神经嵴细胞中，CHD7 在 SOX9 上游的远端调节元件处与 PBAF 结合 [26]。在这里，我们探讨了染色质重塑因子（如 Chd7）的神经嵴富集可能受组织特异性顺式调节元件和相关上游转录因子控制的有趣可能性。在此过程中，我们还确定了 Chd7 在神经嵴基因调控网络中的位置。
与之前在雏鸡中的研究一致 [55]，我们发现 Chd7 表达始于 HH8 沿颅神经管，包括迁移前神经嵴细胞。Chd7 在神经嵴细胞从背神经管出现的整个过程中和随后的迁移过程中上调。除了咽弓、背根神经节和三叉神经节外，还在包括眼睛和耳囊泡在内的平板衍生物中检测到 Chd7 转录物。这种 Chd7 表达模式在小鼠 [27]、斑马鱼 [56] 和非洲爪蟾 [26] 中是保守的。
使用来自分离的鸡颅和迷走神经嵴细胞的调节数据，我们确定了一组 11 个新型 Chd7 增强子，其体内集体活性完全概括了 Chd7 表达。虽然一些增强子表现出颅神经嵴特异性活动，但其他增强子在头部和/或躯干和迷走神经嵴中更广泛地活跃。重要的是，我们在从早期人类胚胎颅组织生成的多组数据中发现了保守的染色质可及性谱。我们还在潜在的增强子序列中检测到高水平的保守性，这反映在体内保守的增强子活性中。证明了羊膜动物胚胎发育过程中 Chd7 调节的保守性，也支持雏鸡模型在探索人类状况方面的精致效用。虽然许多临床 CHARGE 综合征病例在 CHD7 ORF 中包含致病性变异，但许多剩余的未归因病例很可能是由控制 CHD7 的顺式调节元件的破坏引起的。因此，此处确定的增强子代表了 CHD7 基因体内没有致病性变异的 CHARGE 综合征个体的潜在替代筛选位点。
增强病是由致病性变异或增强子调控错误引起的一组临床病症。这可能是通过增强子序列的直接突变来实现的，例如，声刺猬增强子中的点突变导致多指畸形[57]，或产生调节增强子的蛋白质的上游基因突变，例如歌舞伎综合征[58]。有趣的是，Kabuki 综合征归因于多梳抑制复合物 2 （PRC2） 成员的致病性变异 [59]，并且与 CHARGE 综合征具有重叠特征 [60]。
因此，了解增强子中的哪些基序是转录因子结合诱导增强子活性所必需的。因此，我们使用转录因子基序预测来确定负责 Chd7 增强子活性的核心因子。在此过程中，我们揭示了导致疾病突变的潜在敏感位点。我们使用 ChIP 分析验证了基序预测，发现神经嵴主调节因子 Sox10 与神经嵴特异性增强子 enh-A 和 enh-T 结合。Sox10 和 Chd7 之间的功能关系之前已经描述过。Sox10 在 Chd7 形态斑马鱼中失调 [46]，co-IP 实验表明 Sox10 和 Chd7 物理相互作用以调节下游靶标 [47]。在这里，我们通过证明 Sox10 还充当神经嵴内 Chd7 表达的上游驱动因素来扩展这种关系，由至少 2 个远端顺式调节元件介导，称为 enh-A 和 enh-T。我们还鉴定了 Tfap2B 在 enh-T 位点的结合。已知 Tfap2B 和 Chd7 在神经祖细胞中相互作用 [61]，但与 Sox10 类似，据报道，在这种情况下，Tfap2B 在 Chd7 丢失时减少。我们的工作表明，Tfap2B 还驱动神经嵴细胞中的 Chd7 增强子活性，这可能表明 Sox10/Tfap2B 和 Chd7 之间存在正反馈回路。我们还验证了 Pax7 结合 enh-C，它在整个躯干中都处于活性。这是 Pax7 调节 Chd7 的首次报道，并提供了 Chd7 轴向特异性调节的证据。此外，enh-C 在人类中具有保守和活性的对应物，PAX7 的致病性变异最近已被证明会影响颅面发育 [62]，这是 CHARGE 综合征的一个表型特征。因此，我们的数据提供了一种额外的机制，PAX7 通过该机制调节正常的神经嵴生物学。
奇怪的是，很大一部分 Chd7 增强子包含视黄酸受体位点。RXRA 以前被描述为一种在先天性心脏病中发生突变的 Chd7 相互作用蛋白 [40]。我们还发现 Chd7 增强子的一个子集富含 Zic 结合位点。Zic1/4 是 Dandy-Walker 综合征中小脑蚓部异常的原因 [63]，这也是 CHARGE 综合征的一种表型。Zic1/2基因缺陷小鼠与Chd7缺陷小鼠共享前半球叶状缺陷[64]。这表明神经立方病和其他发育缺陷之间共有的表型重叠，并说明了需要对此类疾病背后的复杂遗传关系进行更多的机制理解，以改善诊断和临床管理。
总之，这里我们描述了早期雏鸡神经嵴发育过程中染色质重塑剂 Chd7 的上游组织特异性调节。我们详细介绍了增强子活性和同源转录因子结合，将 Chd7 嵌入神经嵴基因调控网络中，神经嵴主调节因子（包括 Sox10、Tfap2B 和 Pax7）的下游。因此，在神经嵴转录因子和 Chd7 活性之间提供了关键联系，并最终提供了关于它们如何影响神经嵴衍生组织的正常发育的推定机制。此外，我们证明了 Chd7 调节的特征在人类中是保守的，为识别驱动 CHARGE 综合征的致病性变异提供了潜在的资源，以及无处不在的因子的组织特异性活性的新机制。
方法
胚胎采集
雏鸡胚胎是从受精的 Bovans Brown 鸡蛋 （Med Eggs） 中收获的，这些鸡蛋在 37°C 和大约 60% 的湿度下孵育。根据正常雏鸡发育的 Hamburger 和 Hamilton 表对胚胎进行分期 [35]。所有实验均在发育不到 12 天的鸡胚胎上进行，因此不受 1986 年《动物（科学程序）法》的监管。
胚胎制备和电穿孔
对于离卵电穿孔，使用基于滤纸的“易培养”捕获原肠胚期 （HH4） 胚胎 [39,65]。简而言之，通过在鸡蛋的上半球上开一个小孔，用钝钳去除厚白蛋白，将薄白蛋白收集在 50 ml 试管中。去除蛋壳，直到与蛋黄齐平。然后使用锯齿镊子从蛋黄中去除残留的白蛋白，注意不要损坏胚胎。将一张约 1 cm 见方的滤纸放在蛋黄上，中间打了一个孔，胚胎位于中间。然后用解剖剪刀沿所有 4 个边缘切割滤纸，并以 45 度角轻轻地将附有胚胎的纸从蛋黄上提起。然后将纸张倒置（胚胎现在腹侧朝上）并置于含有林格氏溶液（125 mM NaCl、1.5 mM CaCl2、5 毫米氯化钾、0.8 毫米钠2HPO4、0.15 毫米 KH2采购订单4).
合并质粒并稀释至所需浓度。pTK 增强子报告基因的浓度为 2 μg/μl，普遍存在的电穿孔对照 pCI-H2B-RFP （Addgene #92398） 的浓度为 1.0 μg/μl，U6-3 gRNA （Addgene #92359） 的浓度为 0.5 μg/μl，pCI-Cas9-RFP （Addgene #92397） 的浓度为 1 μg/μl。在电穿孔过程中加入足够的植物染料以观察质粒。将质粒注射到上胚层和下面的卵黄膜之间的空腔中以覆盖整个上皮胚层并电穿孔：5 个 5 V 脉冲，50 ms 开，100 ms 关。双侧电穿孔用于扰动实验，其中对照和实验摄政被输送到原始条纹的相对两侧，为每个实验提供理想的内部阶段匹配对照。胚胎在 37°C 下在保留的薄白蛋白上培养过夜至所需阶段 [39]。将胚胎在室温下在 4% 多聚甲醛 （PFA） 中固定 1 小时，然后在成像前在 PBS 中洗涤。
对于卵电穿孔，将受精蛋水平孵育约 40 小时（至 HH9）。使用 18 G 针头和 5 ml 注射器，通过在鸡蛋尖头上打的小孔从鸡蛋中取出 2 至 3 ml 白蛋白，避开蛋黄。然后在鸡蛋的顶部切一个大约 1.5 厘米× 0.8 厘米大小的“窗口”。在卵子中找到胚胎后，将质粒注射到神经管的整个长度中。将电极横向放置在胚胎旁边，并以 5 个 10 V、50 ms 开、100 ms 关的脉冲进行电穿孔。在胚胎顶部加入几滴补充青霉素/链霉素的林格氏溶液。然后用 Sellotape 小心地密封窗户，确保没有缝隙。胚胎在 37°C 下培养 2 至 6 天。从鸡蛋中提取胚胎，并在室温下在 4% PFA 中固定 1 小时，然后在成像前在 PBS 中洗涤。
增强子克隆和测试
如下文和 [38] 中所述，分别克隆和测试假定的增强子元件。使用含有特异性“尾巴”（5′ TTTTTTCGTCTCgccagg n20， 3' TTTTTTCGTCTCcaacag n20），以便于随后使用改进的 GoldenGate [66] 方案克隆到 pTK 黄水晶报告基因载体中。将凝胶纯化的扩增子与修饰的 pTK 黄水晶报告载体 （Addgene #130513） 与 T4 DNA 连接酶和 BsmBI 限制性内切酶结合，并进行循环反应，允许同时进行 BsmBI 消化和 T4 介导的扩增子连接到报告载体中（37°C 5 分钟、16°C 10 分钟、×15、55°C 5 分钟、80°C 5 分钟）。然后将连接/消化反应转化为 DH5a 细胞。对后续菌落进行测序，以确保存在预期的扩增子。制备无内毒素质粒制剂（Qiagen 无内毒素 maxi 制备试剂盒，货号 #12362）用于电穿孔。
影像学分析
使用 Axio Vision 4.8 软件在具有 2.5× 物镜的奥林巴斯 MVX10 体视显微镜上筛选胚胎。Zeiss 780 正置共聚焦显微镜用于高细胞分辨率成像。将 HH8-12 的胚胎安装在显微镜载玻片上，该载玻片先前用电绝缘胶带（×2 层）分层，用手术刀切开矩形间隙，并用盖玻片覆盖，保留足够的液体以实现最佳成像。将较旧的胚胎置于 35 mm 玻璃底成像皿中，并用几滴低熔点琼脂糖固定。
杂交链式反应
使用 v3 方案进行荧光原位杂交链反应 [34]。简而言之，将胚胎在室温下在 4% PFA 中固定 1 小时。将较老的胚胎 （HH12-HH18） 在 3% H 中漂白2O2/8% KOH 直到清除任何色素。所有胚胎均在甲醇系列中脱水，并在 -20°C 下至少储存过夜。补液后，根据阶段（HH9-10 为 2.5 分钟，HH12-HH15 胚胎为 25 分钟）用蛋白酶-K （20 mg/ml） 处理胚胎在室温下处理 2.5 至 25 分钟，并在室温下用 4% PFA 后固定 20 分钟。将胚胎在 PBST 中在冰上洗涤 2× 5 分钟，然后在冰上用 50% PBST/50% 5× SSCT（5× 氯化钠柠檬酸钠，0.1% 吐温-20）在冰上洗涤 5 分钟，单独在 5× SSCT 上洗涤 5 分钟。然后将胚胎在杂交缓冲液中冰上预杂交 5 分钟，然后在 37°C 下在新鲜杂交缓冲液中预杂交 30 分钟。以 4 pmol/ml（在杂交缓冲液中）制备探针，用探针混合物代替预杂交缓冲液，并将胚胎在 37°C 下温和章动孵育过夜。用探针洗涤缓冲液在 37°C 下去除多余的探针 4× 15 分钟。 胚胎在室温下在扩增缓冲液中预扩增 5 分钟。通过在 95°C 下单独快速冷却 30 pmol（10 μl 3 mM 储备发夹）制备发夹 90 秒，并在避光下冷却至室温至少 30 分钟。将冷却的发夹添加到 500 μl 扩增缓冲液中。从胚胎中去除预扩增缓冲液，并在室温下避光加入发夹溶液过夜。通过在室温下 5× SSCT 洗涤 2× 5 分钟、2× 30 分钟和 1× 5 分钟去除多余的发夹。将胚胎安装在载玻片上并使用 Zeiss LSM 880 正置共聚焦显微镜成像。使用 Zeiss Zen 软件处理图像，以 6 μm 的间隔收集 Z 堆栈扫描，范围约为 70 至 200 μm，给出了胚胎 z 堆栈的最大强度投影。使用平铺扫描并使用双向拼接模式进行拼接，重叠率为 10%。
生物素-ChIP-seq
为了促进生物素-ChIP，将 Avi 标记的转录因子质粒（Addgene #127775 Sox10、#127776 Tfap2B）与 0.5 μg/μl 的 pCI NLS-BirA-2A-mCherry 质粒（Addgene #127781）共电穿孔到 HH4 胚胎（离卵）中，在 HH8 （Sox10） 收集，或 HH8/9（卵内）在 HH18 （Tfap2B） 收集。生物素-ChIP-seq 程序如下所述 [48]。每个实验收获大约 15 个胚胎，并解剖它们的颅 （Sox10） 或迷走神经 （Tfap2B） 区域（体节 1-7），提供大约 100,000 个感兴趣的细胞。解剖的胚胎组织在细胞核提取缓冲液 （NEB） （0.5% NP40、0.25% Triton-X、10 mM Tris-HCl （pH 7.5）、3 mM CaCl 中解离2、0.25 M 蔗糖、1 mM 二硫苏糖醇、0.2 mM 苯甲基磺酰氟、1×蛋白酶抑制剂 （PI））在玻璃 dounce 匀浆器中。细胞在室温下用 1% 甲醛交联 15 分钟，并在室温下用 125 mM 的 1 M 甘氨酸淬灭 5 分钟。用 1× PBS/PI（1× PBS、1× PI、1 mM 二硫苏糖醇和 0.2 mM 苯甲基磺酰氟）洗出交联剂 3 次，并在 4°C 下以 2,000 g 离心 4 分钟。 将沉淀物快速冷冻并储存在 −80°C 下，直到收集到足够的样品。将沉淀解冻并重悬于 1 ml NEB 中，在 4°C 下以 2,000 g 离心 4 分钟，并用 PBS/PI 洗涤一次，然后在 SDS 裂解缓冲液（0.7% SDS、10 mM EDTA、50 mM Tris-HCl （pH 7.5）、1× PI）中裂解细胞核。交联染色质在 12 A、10 ×（10 秒开，30 秒关）下超声处理，然后是 8 A、4×（30 秒开，30 秒关），并在 1.5% 琼脂糖凝胶上运行，以确保剪切的 DNA 片段适当。剪切的染色质样品在 4°C 下在旋转器上在预封闭的链霉亲和素珠（Dynabeads M-280 链霉亲和素珠，Invitrogen）中预澄清过夜，收集 1/20 的染色质作为起始馏分并储存在 −80°C 下。 在室温下用 SDS 洗涤缓冲液（2% SDS、10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM EDTA）洗涤珠子，然后进行 4 次放射免疫沉淀测定缓冲液 （RIPA） 洗涤（50 mM Hepes-KOH （pH 8.0）、500 mM LiCl、1 mM EDTA、1% NP40、0.7% 脱氧胆酸盐钠、1× PI）和一次 NaCl TE 洗涤液（1× TE（10 mM Tris，1 mM EDTA）， 50 mM NaCl）在 4°C 下。 使用 SDS ChIP 洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl （pH 7.5）、10 mM EDTA、1% SDS）从磁珠中洗脱样品，并在 65°C 下在热混合器中以 1,000 rpm 孵育过夜来逆转交联。然后将染色质样品与链霉亲和素珠分离。在 37°C 下用 RNaseA （0.2 μg/ml） 消化细胞 RNA 1 h，并在 55°C 下用蛋白酶 K （0.4 mg/ml） 去除细胞蛋白 2 h。然后使用标准苯酚：氯仿和乙醇沉淀方案提取样品和输入 DNA。使用 MicroPlex 文库制备 v2 试剂盒 （Diagnode） 制备文库，循环数由起始材料量决定（Sox10 ChIP，10 个循环，Tfap2B ChIP，14 个循环）最终文库在 NextSeq 500 测序平台上使用 NextSeq 500/550 High Output Kit v2（75 个循环）进行定量和测序。
基因组编辑
手动设计向导 RNA 以靶向基因，方法是在包含蛋白质 DNA 结合结构域的外显子之前的外显子内搜索合适的 PAM （NGG） 位点。在这项研究中，我们使用了先前在我们实验室验证过的向导 RNA [32,37,51]。用 1.0 μg/μl 的 pCAG-Cas9-2A-Citrine （Addgene #92358） 对 0.5 μg/μl 的向导 RNA 进行电穿孔 [51]。
剪切和运行
根据已发布的方案进行切割和运行[49,50]。细胞制备：在所需阶段收集胚胎（每阶段 ×10 个）并置于 1 ml NEB（0.5% NP40、0.25% Triton-X、10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、3 mM CaCl 中2、0.25 M 蔗糖、1 mM DTT、0.2 mM PMSF、1×蛋白酶抑制剂片剂），在玻璃匀浆器中用杵 A 在冰上冲程 10 次后，将溶液在室温下离心 600 g 3 分钟在低结合力的 1.7 ml Eppendorf 管中。去除细胞核提取缓冲液，用 DIG-wash 缓冲液（20 mM HEPES （pH 7.5）、150 mM NaCl、0.5 mM 亚精胺、0.05% 洋地黄皂苷、1×蛋白酶抑制剂片剂）洗涤细胞两次。将细胞结合到磁珠上和抗体孵育：然后将沉淀的细胞重悬于 1 ml DIG 洗涤缓冲液中，并在 Eppendorf ThermoMixer 中以中等速度振荡时加入 Concanavalin-A 珠子。旋转 10 分钟后，将微珠细胞溶液分成等分试样，每种要使用的抗体分装 1 个。将磁珠收集在磁力架上，除去 DIG 洗涤缓冲液，并在振荡的同时向每个等分试样中加入 150 μl 抗体缓冲液（2 mM EDTA 在 DIG 洗涤缓冲液中）。以 1：110 稀释度加入一抗（αChicken Pax7 （DSHB）、H3K27ac Abcam ab4729），并将样品在 4°C 下以端到端旋转孵育过夜。结合蛋白-A/G-MNase 融合蛋白：短暂旋转后，将珠子收集在磁力架上，并用 1 ml DIG 洗涤缓冲液洗涤两次。摇动时，将 150 μl Protein-A/G-MNase 溶液加入珠子中，并在 4°C 下旋转孵育 1 小时。将珠子收集在磁力架上，用 DIG-wash 缓冲液洗涤两次，并在振荡时重悬于 100 μl DIG-wash 缓冲液中。将试管转移至冰上的冷块中，冷却至 4°C，加入 2 μl 200 mM CaCl2摇晃加入，并立即放回冰冷块中 30 分钟。振荡的同时，加入 100 μl STOP 缓冲液（340 mM NaCl、20 mM EDTA、4 mM EGTA、0.05% 洋地黄苷、100 μg/ml RNase A、50 μg/ml 糖原）并在 37°C 下孵育 30 分钟。收集片段化抗体结合的 DNA：在磁力架上收集磁珠，上清液现在含有消化的染色质， 转移至新的 1.7 mL 低结合力 Eppendorf 管中。通过添加 2 μl 10% SDS、2.5 μl 蛋白酶-K （20 mg/ml） 降解染色质蛋白，并在 50°C 下孵育 1 小时。使用标准苯酚：氯仿提取和乙醇沉淀纯化 DNA 片段，并重悬于 20 μl 水中。在 Agilent Tapestation（高灵敏度）和 Qubit 上采取质量控制措施后，使用 NEBNext Ultra II 试剂盒制备测序即用型文库，并在 Illumina Next-seq 500/550 平台上使用高通量试剂盒 v2（75 个循环）进行测序。
数据分析
10× 单细胞 RNA-Seq 数据分析。
使用 10X Genomics Cell Ranger v7.1.0 mkfastq [67] 对单细胞 RNA-seq 数据进行多路复用，然后使用 Ensembl 110 基因模型与 bGalGal1.mat.broiler.GRCg7b 基因组组装进行比对，随后使用 cellranger 计数函数进行定量。共回收了 5,669 个细胞，每个细胞的平均读数为 85,006 个，中位基因为 6,231 个。使用 R v4.3.1 中的 Seurat v5.0.0 [68] 完成计数矩阵的下游分析。过滤计数矩阵以去除包含少于 750 个基因、大于 10,000 个基因或大于 2% 的线粒体基因计数的条形码。过滤后，使用 Seurat 的 v2 SCTransform 函数对 Seurat 对象进行归一化，回归线粒体百分比，并通过 Seurat 的主成分分析进行降维。使用前 30 台 PC，对数据运行 Seurat 的 RunUMAP 和 FindNeighbors，然后以 0.4 的分辨率对单元格进行聚类。通过 Seurat 的 FindAllMarkers 函数计算这些簇的差异表达标记基因，然后用于簇身份的手动注释。原始数据和处理后的数据可从 GEO GSE270155 获得。
多组数据集
Chd7 表观基因组位点使用牛津大学 D. Fountain 为另一项研究生成的人类胚胎多组数据集进行可视化。根据伦理批准的研究 REC 96/085（剑桥大学和剑桥大学医院 NHS 基金会信托基金），从捐献者那里获得样本。样品根据材料转让协议转移，并根据伦理批准的研究 REC 22/PR/0630（牛津大学）在 HTA 许可的场所（许可证号 12433）进行储存和处理。使用 Chromium 10X Next GEM 单细胞多组学 ATAC + 基因表达试剂盒分析来自 3 个卡内基阶段（CS16、CS18、CS18、CS19）的 4 个颅骨样本的细胞核。根据 10X 推荐对文库进行测序，并使用 Cellranger v7.1.0 进行处理。一个文库由于每个细胞核的中位基因较差而被排斥。包括三个文库，共 14,290 个细胞核，基因表达文库的最终中位基因为每个细胞核 2,770 个，每个细胞核的中位深度为 129,399 个读数。使用基因解复用将混合文库解复用为单个样本。为此，生成了大量 RNA-seq 文库并对其进行测序，目标深度为 5000 万个读数。根据 GATK RNAseq 短变体发现 （SNPs + Indels） 管道进行变体调用和基因分型。使用 Demuxafy v2.0.1 中的 Souporcell 对多组样本进行多组分离。使用 Cellbender v0.3.0 检测并去除环境 RNA。使用 Souporcell 根据基因型检测双峰，使用 scDblFinder 分别使用 Demuxafy v2.0.1 检测双峰。文库合并得到 11,719 个细胞核，并与标准 Seurat v4.9.9.9058 管道（分辨率 1.0）聚簇。使用 FindAllMarkers 函数（logfc 阈值 0.25，最小 pct 0.25）手动注释簇。这些数据可以在此处GSE262042访问。
ChIP-seq 和 Cut & Run 分析
对 Avi 标记的 Sox10 生物素 ChIP 测序和 Cut & Run 样品进行多路分离，并合并所得文件。先前发表的 HH18 胚胎禽类 TFAP2b 的生物素-ChIP-seq 数据 [37] 是从 GEO 数据库 （GSE125711） 下载的。我们使用 FastQC v0.11.4 [69] 评估了读取质量。使用 TrimGalore v0.4.1 修剪接头序列，然后使用 bowtie2 v2.3.5 映射到鸡基因组 galGal5 组装 [70]。将序列比对/映射文件压缩为二进制版本 （BAM） 用于下游分析。仅根据二进制比对图 （BAM） 标志保留对齐对，并使用 Samtools （v1.3） 从 BAM 文件中删除线粒体读数 [71]。然后使用 PicardTools （v1.83） 去除 PCR 重复项，仅保留唯一映射的读长。使用自定义 Perl 脚本生成 BigWig 格式的平滑基因组浏览器轨迹，以便在 UCSC 基因组浏览器上实现数据可视化。Pax7 Cut&Run 和 Sox10 生物素-ChIP 数据可在此处GSE261486访问。
同样，我们从 GEO 数据库 （GSE70751） 下载了之前发表的组蛋白翻译后修饰的人类 ChIP-seq 的原始 fastq 文件 [44]。这些文件按上述方式处理，但读数被映射到人类基因组组装 hg38。使用 MACS2 （v.2.0.10） [72] 为每个 ChIP-seq 样本调用峰。在 R （v.3.2.1） 中使用 DiffBind 包 （v1.10.2） 进行差分可访问性分析。样本之间的差异可及性是使用 DEseq2 （v1.4.5） 中实现的负二项分布模型计算的。阈值 FDR < 0.1 和倍数富集 >1 用于定义输入对照上的差分结合峰。
选定增强子内的基序富集
为了鉴定在 Chd7 增强子中富集的基序，我们使用了 HOCOMOCO v.11 数据库中的 49 个位置权重矩阵 （PWM） 列表 [73]，这些矩阵之前根据它们在差异可及染色质中的富集和它们在禽神经嵴单细胞转录组中的同源 TF 的表达（在 [32 中详细描述]]).Homer （v.4.7） annotatePeaks.pl 用于筛选鸟类和人类 Chd7 增强子中的此类基序。我们使用峰内最高的对数比值分数作为所选 Chd7 增强子中基序富集的证据。
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S1 图 单细胞多组学 RNA-seq 数据中的基因表达。（A） 其他染色质重塑因子和转录因子 （B） 在 scRNA-seq 簇中表达的小提琴图。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786.s003
（TIF）
S2 图 Chd7 增强子的体内活性。Chick Chd7 增强子，如交替阶段显示的顶部框所示。额外的增强剂;B1、B2、I、J、O、Q 也已显示。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786.s004
（TIF）
S3 图 增强子活性与神经嵴标记基因的共定位。
（A、B） enh-A 分别在 HH12 和 HH15 处与 Sox10 的 HCR 显示。Ai、Bi 和 Bii 显示通过 A 和 B 的横截面，如白色虚线所示。（C， D） enh-T 分别在 HH12 和 HH18 位点表达 Sox10。Ci 和 Di 显示由白色虚线指示的部分。（E、F、G） enh-C、enh-D 和 enh-H，分别位于 HH12 位点，Pax7 或 Sox10 表达如图所示。（Ei， Fi， Gi） E、F 和 G 的横截面，由白色虚线表示。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786.s005
（TIF）
S4 图 人 CHD7 基因座的表观基因组图谱。
（A） 左上角;UMAP 图描绘了从 3 个样品中分离出的 33 个簇，总共 14,290 个细胞核（右上）;细胞的样本来源，左下角;Chd7 在所有簇中表达的特征图。（B） CHD7 、其他染色质重塑因子和转录因子在人类 Multiome 数据的 scRNA-seq 数据中表达的特征图。（C） CHD7 基因座的 UCSC 基因组浏览器视图，显示了来自人类体外来源的颅神经嵴细胞的 ATAC-seq 和组蛋白 ChIP-seq 数据 [44]。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786.s006
（TIF）
S5 图 CHD7 增强子中的转录因子基序富集。
（A） 使用 HOMER 在 Chd7 增强子中鉴定的预测转录因子基序的热图。（B） 描述生物素-ChIP 测定（上图）和双侧电穿孔（下图）的示意图。（C） Sox10-enh99 的体内活性用于驱动 Avi 标记的 Sox10 进行生物素-ChIP。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002786.s007
（TIF）
确认
我们感谢 Joseph McLean 的技术援助，并感谢 Sauka-Spengler 实验室的所有成员提供的有益讨论和反馈。高分辨率成像是在 MRC WIMM 的 Wolfson 成像中心和 Stowers 研究所的显微镜室内进行的。Mike Piacentino 提供了用于扰动实验中图像定量的宏。
引用
1.Gorlin RJ、Cohen MM、Hennekam RCM。头部和颈部综合征。第 4 版，英国牛津;纽约：牛津大学出版社;2001. xiv，第 1283 页。
2.Pagon RA， Graham JM， Jr.， Zonana J， Yong SL. 缺损、先天性心脏病和伴有多种异常的后鼻孔闭锁：CHARGE 关联。儿科杂志。1981;99(2):223–7.电子版1981/08/01。PMID：6166737。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
3.Zentner GE、Layman WS、Martin DM、Scacheri PC。CHARGE 综合征中 CHD7 突变的分子和表型方面。Am J Med Genet A. 2010 年;152A（3）：674-86。电子版，2010 年 2 月 27 日。PMID：20186815;PubMed 中心 PMCID：PMC2918278。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
4.Martucciello G、Bicocchi MP、Dodero P、Lerone M、Silengo Cirillo M、Puliti A 等人。全结肠神经节硬化症与 10 号染色体长臂的间质缺失相关。儿科外科国际杂志 1992 年;7(4):308–10.
查看文章谷歌学术
5.Heuckeroth RO. 先天性巨结肠——整合基础科学和临床医学以改善结果。Nat Rev 胃肠醇肝醇。2018;15(3):152–67.电子版2018/01/05。PMID：29300049。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
6.Waardenburg PJ.一种新的综合征，结合了眼睑、眉毛和鼻根的发育异常与虹膜和头毛的色素缺陷以及先天性耳聋。Am J Hum Genet.1951;3(3):195–253.Epub 1951/09/01。PMID：14902764;PubMed 中心 PMCID：PMC1716407。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
7.弗朗切斯切蒂 A， 克莱因 D.下颌面骨发育不良;一种新的遗传综合征。Acta Ophthalmol.1949;27(2):143–224.电子版1949/01/01。PMID：18142195。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
8.Hannan KM、Sanij E、Rothblum LI、Hannan RD、Pearson RB。疾病期间 RNA 聚合酶 I 转录失调。生物化学生物物理学学报。2013;1829(3–4):342–60.电子版2012/11/17。PMID：23153826;PubMed 中心 PMCID：PMC3594452。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
9.邦杜兰 N，沙姆 MH。SOX10 在肠神经系统发育中的作用。开发生物学 2013;382(1):330–43.电子版2013/05/07。PMID：23644063。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
10.Kuhlbrodt K、Schmidt C、Sock E、Pingault V、Bondurand N、Goossens M 等人。对人类 Waardenburg-Hirschsprung 患者中发现的 Sox10 突变进行功能分析。J Biol Chem. 1998;273(36):23033–8.电子出版 1998/08/29。PMID：9722528。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
11.Paratore C， Eichenberger C， Suter U， Sommer L. Sox10 单倍体不足影响先天性巨结肠小鼠模型中祖细胞的维持。Hum Mol Genet.2002;11(24):3075–85.Epub 2002/11/06。PMID：12417529。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
12.Pingault V， Bondurand N， Kuhlbrodt K， Goerich DE， Prehu MO， Puliti A， et al. Waardenburg-Hirschsprung 病患者的 SOX10 突变。Nat Genet.1998;18(2):171–3.电子版1998/02/14。PMID：9462749。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
13.Thongpradit S、Jinawath N、Javed A、Jensen LT、Chunsuwan I、Rojnueangnit K 等人。Waardenburg 综合征中的新型 SOX10 突变：功能表征和基因型 - 表型分析。前基因。2020;11:589784.电子版2020/12/29。PMID：33362852;PubMed 中心 PMCID：PMC7756068。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
14.Baldwin CT， Lipsky NR， Hoth CF， Cohen T， Mamuya W， Milunsky A. 与 I 型 Waardenburg 综合征相关的 PAX3 突变 Hum Mutat. 1994;3(3):205–11.电子版1994/01/01。PMID：8019556.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
15.郎 D， 陈 F， 米莱夫斯基 R， 李 J， 卢 MM， 爱泼斯坦 JA.Pax3 是肠道神经节形成所必需的，并与 Sox10 一起调节 c-ret 的表达。J Clin 投资。2000;106(8):963–71.Epub 2000/10/18。PMID：11032856;PubMed 中心 PMCID：PMC314346。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
16.Tassabehji M、Read AP、Newton VE、Patton M、Gruss P、Harris R 等人。导致 1 型和 2 型 Waardenburg 综合征的 PAX3 基因突变。Nat Genet.1993;3(1):26–30.Epub 1993/01/01。PMID：8490648。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
17.Vissers LE、van Ravenswaaij CM、Admiraal R、Hurst JA、de Vries BB、Janssen IM 等人。染色质域基因家族新成员的突变会导致 CHARGE 综合征。Nat Genet.2004;36(9):955–7.电子版2004/08/10。PMID：15300250。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
18.Basson MA， van Ravenswaaij-Arts C. 从 CHARGE 综合征研究中对染色质重塑的功能见解。趋势基因。2015;31(10):600–11.电子版2015/09/29。PMID：26411921;PubMed 中心 PMCID：PMC4604214。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
19.Janssen N、Bergman JE、Swertz MA、Tranebjaerg L、Lodahl M、Schoots J 等人。与 CHARGE 综合征有关的 CHD7 基因的突变更新。Hum Mutat. 2012 年;33(8):1149–60.电子版，2012 年 3 月 31 日。PMID：22461308。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
20.CHD7 突变和 CHARGE 综合征：不断扩大的表型的临床意义。J Med Genet.2011;48(5):334–42.电子版2011/03/08。PMID：21378379。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
21.Bilan F、Legendre M、Charraud V、Maniere B、Couet D、Gilbert-Dussardier B 等人。使用基于变性高效液相色谱的方案完成 50 例 CHARGE 综合征患者的 CHD7 基因异常筛查：新指南和常规诊断建议。J Mol Diagn.2012;14(1):46–55.电子版，2011 年 10 月 29 日。PMID：22033296.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
22.Vuorela P、Ala-Mello S、Saloranta C、Penttinen M、Poyhonen M、Huoponen K 等人。CHARGE 综合征中 CHD7 基因的分子分析：鉴定 22 个新突变和大 CHD7 缺失贡献低的证据。基因医学 2007;9(10):690–4.电子版2007/12/13。PMID：18073582。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
23.Clapier CR，凯恩斯 BR。染色质重塑复合物的生物学。Annu Rev 生物化学。2009;78:273–304.Epub 2009/04/10。PMID：19355820。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
24.陈 T， 登特 SY.染色质修饰剂和重塑剂：细胞分化的调节因子。Nat Rev Genet.2014;15(2):93–106.电子版，2013 年 12 月 25 日。PMID：24366184;PubMed 中心 PMCID：PMC3999985。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
25.Schnetz MP， Handoko L， Akhtar-Zaidi B， Bartels CF， Pereira CF， Fisher AG， et al. CHD7 靶向活性基因增强子元件以调节 ES 细胞特异性基因表达。PLoS 基因。2010;6（7）：e1001023。电子版，2010/07/27。PMID：20657823;PubMed 中心 PMCID：PMC2904778。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
26.Bajpai R， Chen DA， Rada-Iglesias A， Zhang J， Xiong Y， Helms J， et al. CHD7 与 PBAF 合作控制多能神经嵴的形成。自然界。2010;463(7283):958–62.电子版2010/02/05。PMID：20130577;PubMed 中心 PMCID：PMC2890258。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
27.博斯曼 EA、宾夕法尼亚 AC、安布罗斯 JC、凯特尔伯勒 R、斯坦普尔 DL、斯蒂尔 KP。小鼠 Chd7 中的多个突变为 CHARGE 综合征提供了模型。Hum Mol Genet.2005;14(22):3463–76.电子版，2005 年 10 月 07 日。PMID：16207732。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
28.Sperry ED、Hurd EA、Durham MA、Reamer EN、Stein AB、Martin DM。在 CHARGE 综合征中突变的染色质重塑蛋白 CHD7 是颅面和气管正常发育所必需的。开发动态。2014;243(9):1055–66.电子版2014/07/01。PMID：24975120;PubMed 中心 PMCID：PMC4160830。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
29.Hurd EA、Capers PL、Blauwkamp MN、Adams ME、Raphael Y、Poucher HK 等人。基因捕获报告小鼠中 Chd7 功能的丧失是胚胎致命的，并且与多个发育组织中的严重缺陷有关。哺乳动物基因组。2007;18(2):94–104.电子版2007/03/06。PMID：17334657。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
30.Fujita K、Ogawa R、Ito K. CHD7、Oct3/4、Sox2 和 Nanog 在小鼠神经嵴衍生干细胞形成过程中控制 FoxD3 表达。FEBS J. 2016 年;283(20):3791–806.电子版，2016 年 10 月 21 日。PMID：27579714。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
31.Fujita K， Ogawa R， Kawawaki S， Ito K. 染色质重塑剂在小鼠躯干神经嵴细胞多能性维持机制中的作用 神经嵴衍生干细胞的形成.机械开发 2014;133:126–45.电子版2014/05/20。PMID：24836203。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
32.Williams RM、Candido-Ferreira I、Repapi E、Gavriouchkina D、Senanayake U、Ling ITC 等人。体内全球神经嵴基因调控网络的重建。开发单元。2019;51（2）：255–76 e7。电子版2019/10/23。PMID：31639368;PubMed 中心 PMCID：PMC6838682。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
33.Lettieri A， Oleari R， Paganoni AJJ， Gervasini C， Massa V， Fantin A， et al. 染色质重塑剂 CHD7 的信号素调节：一种在发育和癌症中塑造神经细胞和神经嵴的新兴遗传相互作用。前细胞开发生物学2021;9：638674。电子版，2021 年 4 月 20 日。PMID：33869187;PubMed 中心 PMCID：PMC8047133。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
34.Choi HMT、Schwarzkopf M、Fornace ME、Acharya A、Artavanis G、Stegmaier J 等人。第三代原位杂交链式反应：多重、定量、灵敏、通用、稳定。发展。2018;145(12).电子版，2018/06/28。PMID：29945988;PubMed 中心 PMCID：PMC6031405。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
35.汉堡 V，汉密尔顿 HL。雏鸡胚胎发育的一系列正常阶段。J Morphol. 1951 年;88(1):49–92.Epub 1951/01/01。PMID：24539719。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
36.Davies JO、Telenius JM、McGowan SJ、Roberts NA、Taylor S、Higgs DR 等。染色体构象的多重分析，灵敏度大大提高。Nat 方法。2016;13(1):74–80.电子版，2015 年 11 月 26 日。PMID：26595209;PubMed 中心 PMCID：PMC4724891。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
37.凌 ITC，Sauka-Spengler T.早期染色质塑造预先决定了多能迷走神经嵴分为神经、神经元和间充质谱系。2019 年;21(12):1504–17.电子版2019/12/04。PMID：31792380。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
38.Williams RM， Sauka-Spengler T. 使用发育中的雏鸡胚胎进行快速有效的增强子克隆和体内筛选。STAR 协议。2021;2(2):100507.电子版2021/05/25。PMID：34027475;PubMed 中心 PMCID：PMC8121703。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
39.Williams RM， Sauka-Spengler T. 早期鸡胚胎的 Ex 卵电穿孔。STAR 协议。2021;2(2):100424.电子版，2021 年 4 月 27 日。PMID：33899011;PubMed 中心 PMCID：PMC8053799。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
40.Yan S， Thienthanasit R， Chen D， Engelen E， Bruhl J， Crossman DK， et al. CHD7 通过 ATP 依赖性和不依赖性活动调节心血管发育。美国国家科学院院刊 2020 年;117(46):28847–58.电子版2020/11/01。PMID：33127760;PubMed 中心 PMCID：PMC7682373。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
41.Chong-Morrison V， Mayes S， Simoes FC， Senanayake U， Carroll DS， Riley PR， et al. 斑马鱼中 CRISPR/dCas9-SID4x 表观基因组调节的 Ac/Ds 转座。生物开放。2023;12(6).电子版，2023 年 6 月 27 日。PMID：37367831;PubMed 中心 PMCID：PMC10320716。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
42.Siepel A、Bejerano G、Pedersen JS、Hinrichs AS、Hou M、Rosenbloom K 等人。脊椎动物、昆虫、蠕虫和酵母基因组中的进化保守元素。基因组研究 2005;15(8):1034–50.电子版2005/07/19。PMID：16024819;PubMed 中心 PMCID：PMC1182216。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
43.Martik ML、Gandhi S、Uy BR、Gillis JA、Green SA、Simoes-Costa M 等人。通过逐渐获得神经嵴调节回路进化新头部。自然界。2019;574(7780):675–8.电子版2019/10/28。PMID：31645763;PubMed 中心 PMCID：PMC6858584。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
44.Prescott SL、Srinivasan R、Marchetto MC、Grishina I、Narvaiza I、Selleri L 等人。人类和黑猩猩神经嵴中的增强子分歧和顺式调节进化。细胞。2015;163(1):68–83.电子版2015/09/15。PMID：26365491;PubMed 中心 PMCID：PMC4848043。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
45.Lim F、Solvason JJ、Ryan GE、Le SH、Jindal GA、Steffen P 等人。亲和优化增强子变体会破坏发育。自然界。2024;626(7997):151–9.Epub 20240117。PMID：38233525;PubMed 中心 PMCID：PMC10830414。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
46.Asad Z、Pandey A、Babu A、Sun Y、Shevade K、Kapoor S 等人。通过 Sox10 下调拯救斑马鱼 CHARGE 模型中的神经嵴衍生表型。Hum Mol Genet.2016;25(16):3539–54.电子版，2016 年 7 月 16 日。PMID：27418670;PubMed 中心 PMCID：PMC5179949。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
47.He D， Marie C， Zhao C， Kim B， Wang J， 邓 Y， et al.Chd7 与 Sox10 合作，调节 CNS 髓鞘形成和髓鞘再生的发生。国家神经科学。2016;19(5):678–89.电子版2016/03/02。PMID：26928066;PubMed 中心 PMCID：PMC4846514。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
48.Lukoseviciute M， Ling ITC， Senanayake U， Candido-Ferreira I， Taylor G， Williams RM， et al. 斑马鱼和鸡的组织特异性体内生物素染色质免疫沉淀测序。STAR 协议。2020;1(2):100066.电子版，2020 年 10 月 29 日。PMID：33111104;PubMed 中心 PMCID：PMC7580215。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
49.Meers MP、Bryson TD、Henikoff JG、Henikoff S. 改进的 CUT&RUN 染色质分析工具。Elife 的。2019;8.电子版2019/06/25。PMID：31232687;PubMed 中心 PMCID：PMC6598765。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
50.Skene PJ， 海尼科夫 S.一种高效的靶向核酸酶策略，用于 DNA 结合位点的高分辨率定位。Elife 的。2017;6.电子版2017/01/13。PMID：28079019;PubMed 中心 PMCID：PMC5310842。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
51.Williams RM、Senanayake U、Artibani M、Taylor G、Wells D、Ahmed AA 等人。基因组和表观基因组工程 CRISPR 工具包，用于体内调节鸡胚胎中顺式调节相互作用和基因表达。发展。2018;145(4).电子版2018/02/02。PMID：29386245;PubMed 中心 PMCID：PMC5869010。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
52.Weider M、Kuspert M、Bischof M、Vogl MR、Hornig J、Loy K 等人。染色质重塑因子 Brg1 是雪旺细胞分化和髓鞘形成所必需的。开发单元。2012;23(1):193–201.电子版，2012 年 7 月 21 日。PMID：22814607。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
53.Yu Y， Chen Y， Kim B， Wang H， Zhao C， He X， et al.Olig2 将染色质重塑基因靶向增强子，以启动少突胶质细胞分化。细胞。2013;152(1–2):248–61.电子版2013/01/22。PMID：23332759;PubMed 中心 PMCID：PMC3553550。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
54.Yu M、Mazor T、Huang H、Huang HT、Kathrein KL、Woo AJ 等人。核心结合转录因子将多梳抑制复合物 1 直接募集到染色质。分子细胞。2012;45(3):330–43.电子版2012/02/14。PMID：22325351;PubMed 中心 PMCID：PMC3278717。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
55.Aramaki M、Kimura T、Udaka T、Kosaki R、Mitsuhashi T、Okada Y 等人。鸡 CHD7 的胚胎表达谱，CHARGE 综合征致病基因的直系同源物。出生缺陷研究 A Clin Mol Teratol。2007;79(1):50–7.电子版2006/12/07。PMID：17149726。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
56.Patten SA， Jacobs-McDaniels NL， Zaouter C， Drapeau P， Albertson RC， Moldovan F. Chd7 在斑马鱼中的作用：CHARGE 综合征的模型。公共科学图书馆一号。2012;7（2）：e31650。电子版2012/03/01。PMID：22363697;PubMed 中心 PMCID：PMC3282775。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
57.Potuijt JWP、Baas M、Sukenik-Halevy R、Douben H、Nguyen P、Venter DJ 等人。前 ZRS 中的点突变破坏了肢芽中的声音刺猬表达，并导致三指拇指多指综合征。基因医学 2018;20(11):1405–13.电子版2018/03/16。PMID：29543231。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
58.Smith E， Shilatifard A. 增强子生物学和增强病。Nat 结构分子生物学 2014;21(3):210–9.电子版2014/03/07。PMID：24599251。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
59.Gabriele M， Lopez Tobon A， D'Agostino G， Testa G.神经发育障碍的染色质基础：重新思考分子轴和时间轴上的功能障碍。Prog 神经精神药理学生物学精神病学。2018;84（B 部分）：306-27。电子版印刷 2018/01/09。PMID：29309830。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
60.Schulz Y， Freese L， Manz J， Zoll B， Volter C， Brockmann K， et al. CHARGE 和歌舞伎综合征：表型和分子联系。Hum Mol Genet.2014;23(16):4396–405.电子版2014/04/08。PMID：24705355.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
61.CHD7 通过改变染色质可及性和新生基因表达促进胚胎干细胞中的神经祖细胞分化。科学代表 2020;10(1):17445.电子出版 2020/10/17。PMID：33060836;PubMed 中心 PMCID：PMC7562747。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
62.Feichtinger RG、Mucha BE、Hengel H、Orfi Z、Makowski C、Dort J 等人。转录因子 PAX7 中的双等位基因变异是肌病的新遗传原因。基因医学 2019;21(11):2521–31.电子版2019/05/17。PMID：31092906.
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
63.Blank MC、Grinberg I、Aryee E、Laliberte C、Chizhikov VV、Henkelman RM 等人。Zic1 和 Zic4 的缺失会改变多个发育程序，从而导致 Dandy-Walker 小脑畸形发病机制。发展。2011;138(6):1207–16.电子版2011/02/11。PMID：21307096;PubMed 中心 PMCID：PMC3042874。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
64.Aruga J， Inoue T， Hoshino J， Mikoshiba K. Zic2 与 Zic1 合作控制小脑发育。神经科学杂志。2002;22(1):218–25.电子版2002/01/05。PMID：11756505;PubMed 中心 PMCID：PMC6757594。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
65.Chapman SC， Collignon J， Schoenwolf GC， Lumsden A. 使用滤纸载体的改进雏鸡全胚培养方法。开发动态。2001;220(3):284–9.PMID：11241836。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
66.Engler C， Gruetzner R， Kandzia R， Marillonnet S. Golden gate shuffling：一种基于 IIs 型限制性内切酶的一锅 DNA shuffling 方法。公共科学图书馆一号。2009;4（5）：e5553。Epub 20090514。PMID：19436741;PubMed 中心 PMCID：PMC2677662。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
67.Zheng GX、Terry JM、Belgrader P、Ryvkin P、Bent ZW、Wilson R 等人。单细胞的大规模并行数字转录分析。Nat Commun.2017;8:14049.Epub 20170116。PMID：28091601;PubMed 中心 PMCID：PMC5241818。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
68.Hao Y、Stuart T、Kowalski MH、Choudhary S、Hoffman P、Hartman A 等人。用于集成、多模态和可扩展单细胞分析的字典学习。国家生物技术.2024;42(2):293–304.Epub 20230525。PMID：37231261;PubMed 中心 PMCID：PMC10928517。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
69.Andrews S. FastQC：一种用于高通量序列数据的质量控制工具。2010.
查看文章谷歌学术
70.Langmead B. 用 Bowtie 比对短测序读数。Curr Protoc 生物信息学。2010;第 11 章：第 11 单元 7.电子版2010/12/15。PMID：21154709;PubMed 中心 PMCID：PMC3010897。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
71.Li H， Handsaker B， Wysoker A， Fennell T， Ruan J， Homer N， et al.序列比对/映射格式和 SAMtools。生物信息学。2009;25(16):2078–9.电子版2009/06/10。PMID：19505943;PubMed 中心 PMCID：PMC2723002。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
72.冯 J， 刘 T， 秦 B， 张 Y， 刘 XS.使用 MACS 鉴定 ChIP-seq 富集。Nat Protoc.2012;7(9):1728–40.Epub 20120830。PMID：22936215;PubMed 中心 PMCID：PMC3868217。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
73.Kulakovskiy IV， Vorontsov IE， Yevshin IS， Sharipov RN， Fedorova AD， Rumynskiy EI， et al. HOCOMOCO：通过大规模 ChIP-Seq 分析实现人类和小鼠转录因子结合模型的完整集合。核酸研究 2018;46（D1）:D 252–D9。PMID：29140464;PubMed 中心 PMCID：PMC5753240。
查看文章PubMed/NCBI谷歌学术
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