免费医学论文发表-神经胶质细胞中的体验依赖性 5-羟色胺能信号传导调节靶向突触消除
凡妮莎·凯·米勒，肯德尔·布罗迪
抽象
基于初始环境输入的脑回路连接的优化发生在关键时期，其特征是感觉体验依赖、时间受限和瞬时可逆突触消除。这种精确、靶向的突触修剪机制是由神经胶质吞噬作用介导的。血清素信号转导在大脑中具有突出的基础作用，但在神经胶质细胞或依赖于经验的脑回路突触连接重塑中的功能相对不为人知。在这里，我们发现神经胶质细胞之间的血清素能信号传导对于仅限于明确定义的果蝇关键期的嗅觉体验依赖性突触肾小球修剪至关重要。我们发现，经验依赖性 5-羟色胺信号转导仅限于关键期，包括 （1） 血清素产生和 （2） 5-HT2 个特异性受体在神经胶质细胞中，而不是神经元中，是靶向突触肾小球修剪绝对需要的。我们发现神经胶质细胞 5-HT2 个受体信号转导限制了关键期的经验依赖性突触连接修剪以及 5-HT 的条件性再表达2 个成人神经胶质细胞内的受体在成熟时重建“关键期样”经验依赖性突触肾小球修剪。这些结果揭示了 5-HT 介导的神经胶质 5-羟色胺能信号转导的基本要求2 个用于经验依赖性突触消除的受体。
数字
Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3
引文： Miller VK， Broadie K （2024） 神经胶质细胞中经验依赖性的血清素能信号传导调节靶向突触消除。公共科学图书馆生物学22（10）： e3002822 号。 https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822
学术编辑： Bing Ye，美国密歇根大学
收到： 2024 年 4 月 22 日;接受： 2024 年 8 月 29 日;发表： 10月 1， 2024
版权所有： © 2024 Miller， Broadie。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： S1 数据中提供了原始数据量化。原始图像将在 Harvard Dataverse 的“Kendal Broadie Dataverse”下提供。与本文对应的数据集的标题为“Miller and Broadie PLOS Biology 2024”。链接：https://dataverse.harvard.edu/dataverse/kendalbroadie#。
资金： K.B. 获得美国国立卫生研究院 （grant nr.： NS132867） https://reporter.nih.gov/project-details/10878362 的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
利益争夺： 作者已声明不存在相互竞争的利益。
缩写： 铝 触角叶;房间隔缺损， 自闭症谱系障碍;CSDn、 对侧突出的 5-羟色胺免疫反应性脑后神经元;DPE， 羽化后天数;DSHB， 发育研究杂交瘤库;EB / 丁酸乙酯;FXS， 脆性 X 综合征;ID、 智力障碍;有限公司 长期抑郁症;mGluR， 代谢型谷氨酸受体;OD / 眼优势;OE、 过表达;OSN、 嗅觉感觉神经元;PBS， 磷酸盐缓冲盐水;PFA， 多聚甲醛;PTSD， 创伤后应激障碍;RNAi， RNA 干扰;RT， 室温;SSRI， 选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂;特恩， 色氨酸羟化酶
介绍
大脑首先在早期关键期接收来自环境的信息，并利用这些输入通过突触连接的大规模变化来优化神经回路 [1,2]。关键期定义为感觉体验开始开启，突触重塑能力短暂可逆且显著增强，然后永久关闭，导致成熟大脑回路的巩固 [3,4]。关键期重塑的关闭限制了以后的行为适应性，并阻止了对损伤、创伤或疾病引起的后续损伤的纠正，但被认为是确保脑回路连接的维持稳定性所必需的[5,6]。关键时期大脑回路的大规模变化是通过 2 个相反的重塑过程之间的动态波动发生的：突触形成和突触消除。突触的发生和修剪都受到神经胶质细胞的严格调控[7,8]，关键期重塑的总体特征是经验靶向神经胶质吞噬作用直接介导的突触大量净损失[9–12]。精确的神经胶质细胞修剪对于通过使脑回路突触连接适应高度可变环境的不可预测的需求来正确简化信息流非常重要 [13,14]。在哺乳动物中，小胶质细胞和星形胶质细胞作为突触消除的吞噬细胞，具有多种信号线索来靶向和修剪不需要的突触[14–16]。小胶质细胞是大脑的先天免疫细胞，星形胶质细胞与突触密切相关。两种神经胶质细胞类别都可以作为初级或次级吞噬细胞发挥作用，在吞噬和去除神经元细胞体、近端树突乔木和远端轴突突触方面发挥协同作用[17,18]。小胶质细胞是关键的突触吞噬细胞，但据报道，星形胶质细胞胶质细胞是在成年小鼠突触连接的经验依赖性修剪过程中介导兴奋性突触消除的吞噬细胞[15,19,20]。相比之下，在经验依赖性关键期脑回路重塑期间介导突触修剪的神经胶质机制的研究要少得多。特别是，我们对关键期神经胶质细胞功能背后的分子信号机制知之甚少。
血清素 （5-HT） 信号传导在介导大脑可塑性方面起着必要的基础作用 [21,22]。5-羟色胺能细胞独特表达色氨酸羟化酶 （Trhn），这是一种用于 5-羟色胺生物合成的限速酶 [23]。5-羟色胺信号转导调节兴奋性和抑制性突触，在控制突触输出和比率变化的把关机制中发挥作用[24,25]。下游，G 蛋白偶联的 5-HT2 个受体 （5-HT2 个R） 调节可塑性信号传导 [26,27]，并在神经元和神经胶质细胞中表达，包括小胶质细胞和星形胶质细胞 [28–31]。5-HT 系列2 个长期以来，R 一直与学习和记忆密切相关 [32]，极化驱动长期抑郁 （LTD） 和增强作用的突触修饰 [33]。重要的是，5-HT2 个R 在调节脑回路成熟和重塑方面发挥着新兴的作用 [21,34]。5-羟色胺信号缺陷与许多神经系统疾病有关，如自闭症谱系障碍（ASD）、创伤后应激障碍（PTSD）、抑郁症和精神分裂症[35,36]，其中5-羟色胺能药物是患者症状管理的重中之重[37,38]。此外，其他5-羟色胺途径药物（如LSD、裸盖菇素）似乎可以增加成人大脑的回路重塑能力[39,40]，其新的理想目标是在成人中重新开放“关键期样”重塑，被广泛吹捧为治疗无数成熟大脑限制和损伤的灵丹妙药[41–43].然而，血清素信号转导在经验依赖性脑回路重塑中的假定作用在很大程度上仍然未知。在生命早期的关键时期，血清素能信号与突触修剪中的神经胶质功能没有联系，更不用说在以后重新打开成人的这种重塑能力中的作用了。在这里，我们在果蝇遗传模型系统中采用了一个特征明确的关键期来测试幼年和成熟成人大脑中感觉体验依赖性神经胶质突触修剪中对血清素信号的要求。我们发现神经胶质细胞内依赖于体验的血清素能信号转导对于生命早期关键时期的靶向突触修剪至关重要，并且在成年神经胶质细胞中有条件地引入血清素信号转导会在成熟时重新打开这种依赖于体验的突触修剪机制。
结果
经验依赖性关键期 5-羟色胺信号传导和突触肾小球修剪
果蝇遗传模型具有精确定义的早期生命关键期[44,45]、特征明确的神经胶质吞噬细胞[46,47]，以及用于细胞靶向操纵5-羟色胺能信号传导的复杂转基因工具包[24,25]。在果蝇幼年脑中，触角叶（AL）内完全定位的突触肾小球[48,49]分别由确定的嗅觉感觉神经元（OSN）突触末梢支配（图1和图2A，左上）。单受体类 OSN 对每个肾小球内投射神经元上的特异性气味突触做出反应 [50]。丁酸乙酯 （EB） 反应性 Or42a 受体 OSN 支配每个半球内的 VM7 突触肾小球（图 1 和 2A，左下角）。膜标志物 mCD8：：GFP 的 Or42a 受体驱动的表达用于特异性标记这种突触神经支配 [51]。已知血清素 （5-HT） 信号传导可调节 OSN 突触连接（图 2A，右上）[52]。用特征明确的抗 5-羟色胺 （5-HT） 抗体标记显示整个 AL 突触神经细胞的 5-羟色胺能点。神经胶质细胞在这个神经细胞周围丰富（图 2A，右下角），并延伸到突触肾小球 [11]。神经胶质细胞充当吞噬细胞，修剪突触肾小球，从而重塑神经支配连接[11,53]。Or42a receptor OSN 具有精确定时的早期生命关键期，该期在时间上受到严格限制，瞬时可逆，并且与气味剂量有关（图 2B）[44,54]。为了响应定时的 24 小时 EB 气味体验，与单独的载体对照（油）相比，Or42a OSN 突触肾小球神经支配被强烈修剪，仅在幼年脑关键期（羽化后 0 至 1 天 （dpe） 后;图 2B，顶部）。相比之下，在成熟成人中，没有明显的 VM7 突触肾小球神经支配响应完全相同的 EB 气味感觉体验（7 至 8 dpe，图 2B，底部）。血清素信号传导已得到充分证实，可通过特征性的 5-羟色胺能神经元神经支配来调节成人大脑中的嗅觉突触连接 [24,25,52];然而，关于幼年脑关键期的 5-羟色胺信号传导作用尚不清楚。
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图 1. 标测的果蝇幼年脑 AL 突触肾小球表现出嗅觉体验依赖性修剪。
特定的 OSN 类别支配 AL 的 2 个大脑半球（上）中映射的突触肾小球。Or42a OSN 专门投射到 VM7 肾小球（以绿色突出显示）。Or42a 受体与必需的 ORCO 亚基复合，结合 EB 气味剂以触发嗅觉反应（右侧框）。其他定位的肾小球，例如 DA1（蓝色），对 EB 气味剂没有反应。在幼年关键期，EB 嗅觉经验选择性地修剪 VM7 突触肾小球 （下图） 的 Or42a OSN 神经支配。加臭剂载体矿物油控制表现出正常的神经支配（左），而在关键时期短暂暴露于 EB 加臭剂会导致经验依赖性修剪（右）。神经胶质修剪过程是气味剂量依赖性的，并且在时间上仅限于关键期。AL，触角叶;EB， 丁酸乙酯;OSN，嗅觉感觉神经元;VM7，腹内侧 7。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.g001
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图 2. 经验依赖性和时间限制性 5-羟色胺信号传导和突触肾小球修剪。
(A） 用 CadN 抗体标记的果蝇脑 AL 突触肾小球（品红色;左上）。配对的 VM7 肾小球神经支配用 Or42a 气味受体驱动的 mCD8：：GFP（Or42：：GFP，绿色;左下角）标记。用 5-羟色胺抗体标记的同一神经细胞（5-HT，黄色;右上），以及用神经胶质细胞 repo-Gal4 驱动的 UAS-mCD8：：RFP（Repo>RFP，红色;右下）标记的神经胶质细胞。（B） 从 0-1 dpe（关键期，上图）或 7-8 dpe（成人成熟期，下图）定时暴露于加臭剂载体（油，左）或 25% EB 矿物油（右）中 24 小时。VM7 肾小球 OSN 神经支配的 Or42a 受体驱动的 mCD8：：GFP（Or42：：GFP，绿色）膜标记仅在 0-1 dpe 关键期显示经验依赖性修剪，在 7-8 dpe 成虫中没有。（C） 在 0-1 dpe 关键期 Or42a OSN 突触肾小球（Or42：：GFP，洋红色）的经验依赖性修剪期间，血清素（5-HT，绿色）被 EB 经验强烈上调，但在 7-8 dpe 成人中没有 EB 经验依赖性血清素信号传导或修剪。（D） 在石油载体对照和 EB 体验条件的关键期 （0-1 dpe） 中 VM7 肾小球内的 Or42a 神经元神经支配（OSN，品红色）和血清素（5-HT，绿色）荧光强度的定量。使用 Tukey 多重比较的双向方差分析显示 Or42a OSN 神经支配非常显着降低 （n = 28/条件，p = 7.45 × 10−11）和血清素增加（n = 28/条件，p = 4.10 × 10−14).（E） 在成熟成年人 （7-8 dpe） 中的相同定量显示 Or42a OSN 神经支配（n = 28/条件，p = 0.9738）或血清素信号传导（n = 28/条件，p = 0.9965）没有经验依赖性变化。所有单独的数据点都用均值 ± SEM 显示。显著性表示为 p < 0.0001 （****） 和 p > 0.05 （不显著，ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。AL，触角叶;CadN，N-钙粘蛋白;DPE，羽化后天数;EB， 丁酸乙酯;OSN，嗅觉感觉神经元;VM7，腹内侧 7。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.g002
我们发现 5-羟色胺信号传导在响应关键期 EB 气味体验时显着上调，与时间受限的 VM7 突触肾小球修剪相吻合，但在成熟成年人中的相同经历导致没有明显的信号传导或修剪（图 2C）。突触肾小球神经支配和血清素标记都是在共标记的大脑中完成的，以响应 2 个时间点的定时 EB 体验试验。在关键时期，与载体对照（油）相比，从 0 到 1 dpe 的 24 小时 EB 气味体验显着上调了血清素（5-HT，绿色），同时还推动了 EB 反应性 Or42a 神经元突触肾小球修剪（洋红色）与载体对照相比（图 2C，顶部）。与此形成鲜明对比的是，成熟成年人 （7 至 8 dpe） 的相同 EB 经历不会导致血清素信号传导或 VM7 神经支配发生可检测的变化（图 2C，底部）。与 EB 体验条件相比，定时油气味载体控制的荧光定量揭示了 0 至 1 dpe 关键期高度显着的突触肾小球修剪（洋红色）（图 2D，左）。同样，抗血清素（5-HT，绿色）荧光定量显示，在相同的限制性 0 至 1 dpe 关键时期，高度显著的经验依赖性血清素信号上调（图 2D，右）。相反，与匹配的油载体对照相比，7 至 8 dpe 的成熟成虫的 24 小时 EB 体验导致 OSN 突触神经支配（洋红色）绝对没有变化（图 2E，左）。与对照组相比，成熟成年人的相同 EB 经历不会导致血清素信号传导（绿色）发生可检测的变化（图 2E，右）。这些结果表明，经验依赖性 5-羟色胺信号传导和突触肾小球修剪在时间上都仅限于关键期。与 OSN 特异性感觉输入机制一致，遗传上仅限于 Or42a 神经元的关键期 EB 体验会诱导血清素信号传导和突触肾小球修剪（S1A 和 S1B 图）。为了测试 OSN 特异性血清素调节，非 EB 反应性肾小球 （DA1;图 1）对经验依赖性血清素变化进行成像。在关键期响应 EB 暴露，DA1 没有表现出 5-HT 上调（S1C 和 S1D 图）[55]。同样，独立的大脑区域（视叶）也显示响应关键期 EB 暴露时没有 5-HT 上调（S1E 和 S1F 图）。这些发现表明，关键期的经验依赖性 5-羟色胺信号转导位于幼年大脑中。接下来，我们通过测定细胞对血清素的需求，来测试关键期经历依赖性血清素信号传导在突触肾小球修剪中的可能作用。
神经胶质细胞（但不是神经元）的血清素信号转导对于突触肾小球修剪至关重要
为了开始测试关键期经验依赖性突触肾小球修剪中对经验依赖性血清素能信号传导的可能需求，我们首先转向使用针对 Trhn 的细胞靶向 RNA 干扰 （RNAi），Trhn 是血清素合成的必需酶 [23,56]。我们明显的主要候选者是来自神经元的 5-羟色胺能信号传导，因此我们首先使用泛神经元 elav-Gal4 驱动因子 [57] 来表达 UAS-Trhn RNAi，从而阻断所有神经元中血清素的产生 [58]。为了进一步完善这一分析，我们接下来从背外侧投射的 c中特异性地消除了血清素信号传导，即 s血清素免疫反应性 deutocerebral neurons （CSDn），它们是支配 AL 突触肾小球的特征明确的 5-羟色胺能神经元 [24]。我们完全预期所有 5-羟色胺能信号传导仅来自这些 CSDn 神经元。然而，据报道，神经胶质细胞也参与血清素能信号通路[59,60]，神经胶质细胞吞噬作用在关键时期介导突触肾小球修剪[61,62];和神经胶质细胞在果蝇大脑嗅觉回路中被很好地定位（图2A）[44,47]。因此，为了进行完整的分析，我们还采用了胶质细胞特异性 repo-Gal4 来驱动神经胶质细胞中的 UAS-Trhn RNAi。从未报道过神经胶质细胞介导 5-羟色胺能信号传导，因此我们测试了神经胶质细胞中的 Trhn 和 5-HT 标记，以及经验依赖性神经胶质细胞 5-羟色胺能信号传导（S2 图）。在 UAS-Trhn RNAi 对照 （无 Gal4 驱动器） 和所有 3 种细胞靶向敲低中，我们将加臭剂载体对照 （油） 的 24 小时关键期暴露 （0 至 1 dpe） 与 25% EB 加臭剂 （% v/v EB 在油中） 配对。我们测试了 VM7 肾小球中 Or42a OSN 神经支配的经验依赖性修剪，所有突触肾小球都用 N-钙粘蛋白抗体标记（灰度），VM7 神经支配用 Or42a 受体驱动的膜 mCD8：：GFP 在强度热图（色标）中标记。VM7 突触肾小球内 3 维 Or42a OSN 神经支配体积的代表性图像和定量如图 3 所示。
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图 3. 在关键期，神经胶质 5-羟色胺信号传导是突触肾小球经验依赖性修剪所必需的。
(A） 突触肾小球的 CadN（灰度）标记和 VM7 肾小球的 Or42a OSN 神经支配，显示为彩色热图（16 LU 刻度，右下角）。插图显示了 VM7 中的单通道 OSN 图像。顶行是 Trhn RNAi 单独转基因对照（对照：w1118;Or42a-mCD8：：GFP/+;UAS-Trhn RNAi/+） 与油载体对照（左）和 25% EB 体验（右）在关键期从 0-1 dpe 持续 24 小时。第二行是神经胶质细胞特异性 repo-Gal4 驱动的 Trhn RNAi （repo （glia）： w1118;Or42a-mCD8：：GFP/+;UAS-Trhn RNAi/repo-Gal4）显示经验依赖性突触肾小球修剪的总块。底行是泛神经元 elav-Gal4 驱动的 Trhn RNAi （elav （神经元）：w1118;Or42a-mCD8：：GFP/elav-Gal4;UAS-Trhn RNAi/+） 显示对 EB 经验依赖性突触肾小球修剪没有影响。（B） 未驱动的 Trhn RNAi 对照、神经胶质靶向 Trhn RNAi 和 2 个神经元靶向的 Trhn RNAi 系中 Or42a OSN 神经支配体积的定量;TRHN 系列RNAi 对照（绿色，左）、神经胶质 RNAi（红色，左二）、5-羟色胺能 CSDn 神经元 RNAi（蓝色;w1118;OR42a-GAL4/+;UAS-Trhn RNAi/GMR60F02-Gal4）和泛神经元 elav RNAi（橙色，右）。使用 Tukey 多重比较的双向方差分析显示，在 Trhn RNAi 对照中，Or42a OSN 神经支配体积的神经胶质修剪显着 （n = 30/条件，p = 4.00 × 10−14）以及两种神经元 Trhn RNAi 条件（血清素能 CSDn-Gal4：n = 10/条件，p = 6.4 × 10-−14;泛神经元 elav-Gal4：n = 10/条件，p = 1.19 × 10−14），但没有明显的突触肾小球修剪与神经胶质细胞靶向的 Trhn RNAi （repo-Gal4： n = 10， p = 0.539）。所有单独的数据点都用 SEM ±平均值显示。显著性表示为 p < 0.0001 （****） 和 p > 0.05 （不显著，ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。CadN，N-钙粘蛋白;CSDn，对侧突出的 5-羟色胺免疫反应性脑后神经元;DPE，羽化后天数;EB， 丁酸乙酯;OSN，嗅觉感觉神经元;RNAi，RNA 干扰;Trhn，色氨酸羟化酶;VM7，腹内侧 7。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.g003
在 UAS-Trhn RNAi 转基因对照中，与油载体相比，24 小时的 EB 体验（0 到 1 dpe）推动了强大的 VM7 突触肾小球修剪（图 3A，顶部）。载体对照（左）显示强烈的荧光占据整个 VM7 肾小球，而 EB 经验导致标记强度和体积的显着损失（右）。令我们惊讶的是，阻断神经胶质细胞中的血清素合成（repo-Gal4 驱动的 UAS-Trhn RNAi）阻止了这种依赖于经验的修剪（图 3A，中间）。载体控制（左）和 EB 体验（右）在神经胶质细胞缺乏 5-羟色胺信号转导的情况下难以区分。通过共标记神经胶质细胞核（抗 Repo）、血清素（抗 5-HT）和 Trhn-Gal4 驱动细胞膜标志物 （UAS-mCD8：：GFP;S2A 和 S2B 图）。关键期 EB 经历诱导这些神经胶质细胞产生 5-羟色胺（S2A-S2C 图），Trhn 标志物和 5-HT 与这些相同神经胶质细胞共定位的经验依赖性增加（S2D 和 S2E 图）。一致地，EB 体验依赖性 5-羟色胺信号转导被神经胶质细胞中 repo-Gal4 驱动的 UAS-Trhn RNAi 阻断（S3 图;见下文）。相比之下，阻断神经元中血清素的产生对经验依赖性突触肾小球修剪没有影响（图 3A，底部）。与油载体（左）相比，Or42a 神经元神经支配被关键期 EB 暴露（右）强烈修剪，程度与对照组相同。一致地，elav-Gal4 驱动的 UAS-Trhn RNAi 阻断 CSDn 胞体中血清素的产生，但与神经胶质细胞中 repo-Gal4 驱动的 UAS-Trhn RNAi 相比，对 VM7 肾小球中体验依赖性血清素信号传导的影响较弱（S3A-S3C 图）。因此，神经胶质 Trhn 敲除会损害 VM7 突触肾小球中 EB 经验依赖性 5-HT 的产生，但不会损害 CSDn 神经元中 5-HT 的产生，而神经元 Trhn 敲除可有效消除 CSDn 神经元中的 5-HT（S3D 和 S3E 图）。神经支配体积的定量显示，与油载体相比，来自 EB 经验的转基因对照中非常显着的修剪（图 3B，左，绿色）。相比之下，神经胶质细胞中 repo-Gal4 驱动的 Trhn RNAi 不会导致显着的经验依赖性修剪（图 3B，红色）。与没有 EB 暴露的油转基因对照相比，油载体和 EB 经验都导致难以区分的神经支配。与 GMR60F02-Gal4 的血清素能 CSDn 神经元特异性阻断血清素合成的相同定量（图 3B，蓝色，p = 6.4 × 10−14），或在所有具有 elav-Gal4 的神经元中（图 3B，橙色，p = 1.19 × 10−14），显示正常的突触肾小球修剪。这些令人惊讶的发现表明，来自神经胶质细胞的 5-羟色胺信号转导对于关键期体验依赖性突触肾小球修剪至关重要，而血清素能神经元没有可检测到的参与。接下来，我们转向测试在关键时期对这种经验依赖性神经胶质血清素信号做出反应的细胞。
神经胶质细胞 5-HT2 个自身受体是突触肾小球修剪所必需的和限速
虽然 5-羟色胺能 5-HT2 个G 蛋白偶联受体在调节神经元的脑回路可塑性方面已得到广泛证实 [32,39,40]，但对可能的发育作用知之甚少。为了测试经验依赖性关键期电路修剪中的功能，我们首先使用了 elav-Gal4 驱动的 5-HT2 个R RNAi 在神经元中 [63]，但在神经元中没有发现这些受体的可检测作用，与匹配的对照相比，突触依赖性肾小球修剪正常保持（S4A 和 S4B 图）。除了在神经元突触中的作用外，5-HT2 个受体存在于神经胶质吞噬细胞中，包括小胶质细胞和星形胶质细胞[29,59,60]。在神经元中，5-HT2 个R 自分泌信号传导是突触调节过程中一种公认的机制 [64]。总之，这表明可能存在 5-HT2 个神经胶质细胞中的 R 自信号传导功能用于经验依赖性关键期突触肾小球修剪。为了测试这个新的想法，我们再次使用神经胶质特异性 repo-Gal4 来驱动 UAS-5-HT2 个R RNAi，然后检测经验驱动的 VM7 突触肾小球修剪。我们发现 5-HT2 个神经胶质细胞内的受体是 EB 经验依赖性关键期修剪所必需的（图 4A）。在 5-HT2 个与在油臭载体条件下保持的 VM7 神经支配相比，R RNAi 转基因对照，24 小时 （0 至 1 dpe） 的 25% EB 体验再次导致广泛的 Or42a 神经元突触肾小球修剪（图 4A，顶部）。与此形成鲜明对比的是，使用神经胶质细胞靶向 5-HT2 个带有 repo-Gal4 的 R RNAi 完全阻断了经验依赖性突触肾小球修剪，载体对照（油）和 EB 体验条件都表现出无法区分的 VM7 神经支配水平（图 4A，底部）。Or42a OSN 神经支配体积的定量显示关键期 EB 经历导致 5-HT 中 VM7 突触肾小球的显着神经胶质修剪2 个R RNAi 转基因对照（图 4C，左，蓝色）。相反，神经胶质细胞靶向 5-HT 没有显着的神经支配修剪2 个R RNAi（图 4C，红色）。我们发现 5-HT2 个R 仅在幼年关键期（绿色）因 EB 经历而升高，因为成熟成虫没有显示 5-HT2 个响应 EB 暴露的 R 变化（红色;S5A 和 S5B 图）。因此，我们得出神经胶质 5-HT2 个在生命早期的关键时期，经验依赖性突触肾小球修剪需要受体。
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图 4. 神经胶质细胞 5-HT2a受体对于经验依赖性突触肾小球修剪是必需的和限速。
（A） VM7 肾小球的 Or42a OSN 神经支配显示为热图（彩色 LU 量表;右下角，在 B 中）。顶行是 5-HT2 个受体 RNAi 对照 （w1118;Or42a-mCD8：：GFP/+;无人机-5-HT2 个R RNAi/+）使用气味载体（油，左）和 0-1 DPE 的 25% EB 暴露（右）显示经验依赖性神经支配修剪。底行是神经胶质 repo-Gal4 驱动的 5-HT2 个受体 RNAi （repo （glia））：w1118;Or42a-mCD8：：GFP/+;无人机-5-HT2 个R RNAi/repo-Gal4）显示神经支配修剪的完全阻断。（B） 顶行是未驱动的 5-HT2 个受体 OE 对照 （5-HT2 个R OE/+：w1118;Or42a-mCD8：：GFP/+;无人机-5-HT2 个R OE/+）显示突触肾小球修剪减少，从 0-1 dpe 为 15% EB。底行：神经胶质 repo-Gal4 驱动的 5-HT2 个R OE [repo （glia）]： w1118;Or42a-mCD8：：GFP/+;无人机-5-HT2 个R OE/ repo-Gal4）显示高度升高的修剪。（C） 转基因 RNAi 对照（蓝色）和神经胶质 5-HT 中 Or42a OSN 神经支配体积的定量，EB 体验为 25%（左）2 个 受体RNAi（红色）和 5-HT 中 15% EB（右）2 个R OE 控制（绿色）和 5-HT2 个R OE （洋红色）.与 Tukey 多重比较的双向方差分析显示 Or42a OSN 神经支配体积的神经胶质修剪非常显着，在 5-HT 中具有更高的 EB 体验2 个R RNAi 对照（n = 25/条件，p = 1.00 × 10−15），但使用神经胶质靶向 5-HT 没有显着修剪2 个R RNAi （n = 10/条件，p = 0.662）。同样，对于 15% EB，5-HT 中存在显着的神经胶质修剪2 个R 对照（n = 25/条件，p = 4.67 × 10−10），但使用神经胶质细胞靶向 5-HT 的修剪效果要大得多2 个R OE （n = 25/条件，p = 4.63 × 10−10).具有神经胶质 5-HT 的 Or42a OSN 神经支配体积2 个与对照 EB 条件相比，R OE 非常显着 （p = 4.64 × 10−10).所有单独的数据点都用均值 ± SEM 显示。显著性表示为 p < 0.0001 （****） 和 p > 0.05 （不显著，ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。DPE，羽化后天数;EB， 丁酸乙酯;OE，过表达;OSN，嗅觉感觉神经元;RNAi，RNA 干扰;VM7，腹内侧 7。
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以上结果显示 5-羟色胺能 5-HT2 个神经胶质细胞之间的受体信号传导对于突触肾小球的神经胶质修剪至关重要，但未能测试 5-HT2 个受体决定了经验依赖性修剪的程度。因此，我们接下来测试了 5-HT2 个神经胶质细胞内的受体限制了关键期突触肾小球修剪。为了测试这种可能性，我们降低了 EB 气味剂浓度（矿物油中的 15% EB v/v）以降低感官体验的效力，从而减少体验依赖性突触修剪的程度。在这种新条件下，我们然后测试了神经胶质 repo-Gal4 驱动的 UAS-5-HT2 个R 过表达 （OE） 会增加经验依赖性突触肾小球修剪的范围（图 4B）。在 5-HT2 个R原厂/+ 转基因对照，与载体对照（油）相比，15% EB 暴露后突触修剪程度从 0 到 1 dpe 持续 24 小时呈剂量依赖性降低，但经验依赖性突触肾小球修剪水平降低是明显的（图 4B，顶部）。相比之下，5-HT2 个R原厂在神经胶质细胞中，导致在 15% EB 条件下突触肾小球修剪明显增加（图 4B，底部），其程度与较高的 25% EB 条件（与图 4A 相比，顶部）无法区分。5-HT 的定量2 个R原厂/+ 转基因对照显示，从较低的 15% EB 关键期经历中，突触肾小球修剪减少但仍显着（图 4C，右，绿色）。相比之下，神经胶质细胞靶向 5-HT2 个受体 OE 显着增加了 EB 经验依赖性突触肾小球修剪的程度（图 4C，右，洋红色）。神经元 elav-Gal4 驱动的 5-HT2 个R RNAi 强烈消除 5-HT2 个R 在对照和 EB 暴露条件下的表达，证实了敲低特异性（S6A 和 S6C 图）。重要的是，神经胶质 repo-Gal4 驱动的 5-HT2 个R RNAi 和 OE 显示 5-HT 的预期双向变化2 个R 水平，含 5-HT2 个R原厂显著提高 EB 经验依赖性 5-HT2 个R 上调（S6B 和 S6C 图）。综上所述，5-HT2 个神经胶质细胞中的 R RNAi 完全阻断了较高剂量的 25% EB 暴露（图 4C，左）和 5-HT 的突触肾小球修剪2 个神经胶质细胞中的 R OE 通过较低剂量的 15% EB 体验（右）大大增加了修剪。这种双向神经胶质细胞 5-HT2 个受体调节在这两种情况下都非常重要。鉴于神经胶质细胞 5-HT2 个受体限制了经验依赖性突触肾小球修剪在关键期，我们接下来询问神经胶质 5-HT 是否2 个R OE 可以在成熟时诱导类似的重塑。
成人神经胶质 5-羟色胺能信号转导重新打开经验依赖性突触肾小球修剪
幼年大脑关键期相关损伤导致终生衰弱，导致人们试图重新打开成熟成人的“关键期样”重塑能力[41,42,65]。我们发现 5-HT2 个神经胶质细胞中的受体 OE 强烈增加了幼年脑关键期的经验依赖性突触重塑，表明它也可能在成熟大脑中实现从头经验依赖性重塑。为了检验这一假设，我们采用了条件性的、温度敏感的 Gal80 （Gal80茨） 重新引入 5-HT 的转录阻遏蛋白2 个受体仅在成人神经胶质细胞中，然后在成熟时检测恢复经验依赖性突触肾小球修剪。Gal80 系列茨阻遏蛋白在较低的允许温度 （18°C） 下阻断 Gal4 介导的转录，但在较高的限制温度 （28°C） 下被灭活以允许 Gal4 转录 [66]。野生型成虫在 VM7 肾小球中未显示 Or42a 神经元神经支配的可检测到经验依赖性突触肾小球修剪，成熟成虫暴露于 EB 气味（图 2B 和 2E）。同样，转基因 Gal80茨成人在允许的 18°C 温度条件下（蓝色），当 Gal80茨阻遏蛋白保持活性和 5-HT2 个因此，受体在神经胶质细胞中不过表达，在转基因对照或抑制的 5-HT 中也显示没有 EB 经验依赖性突触肾小球修剪2 个R OE 条件（图 5A）。所有这些成人的 EB 经历都不会检测到改变 VM7 神经支配。同样，在 28°C 的限制性温度（红色）下，当 Gal80茨阻遏蛋白无活性且 5-HT2 个受体在成年神经胶质细胞内过表达，气味载体控制 （OIL） 条件也显示没有突触肾小球修剪（图 5B，顶部）。这是意料之中的，因为在这种情况下没有针对 VM7 突触连接重塑的 EB 感觉体验。在所有 3 种对照条件下对 3 维神经支配体积的量化证实，在没有诱导 5-HT 的情况下，在 18°C 或 28°C 温度下，成熟成体没有显着的突触肾小球修剪2 个神经胶质细胞中的 R OE（图 5C，绿色和蓝色）。
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图 5. 胶质细胞靶向 5-HT2 个成人受体表达重新打开了经验依赖性突触肾小球修剪。
(A） 在 18°C （Gal80） 下，成熟的成年动物在 VM7 肾小球（蓝色）中没有可检测到的 Or42a OSN 神经支配的经验依赖性修剪茨permissive temperature） 的 Tim S Temperature）。顶行显示 w1118遗传背景对照（对照：W1118;微管蛋白 Gal80/Or42a-mCD8：：GFP;repo-Gal4/+）和 Gal80茨转基因对照 （Gal80茨： w1118;微管蛋白 Gal80茨/OR42a-mCD8：GFP;5-HT2 个R OE/ repo-Gal4）使用 14-16 dpe （18°C） 的 24 小时矿物油载体。底行显示了相同的基因型，在成年时 （14-16 dpe， 18°C） 24 小时内出现 25% EB 气味。（B） 在 28°C （Gal80茨限制性温度;红色）、胶质细胞 5-HT2 个R OE 可在成熟成人中实现依赖于经验的突触肾小球修剪。顶行是仅暴露在油车上的 2 个控件。底行是遗传背景对照 （w1118;微管蛋白 Gal80茨/Or42a-mCD8：：GFP;repo-Gal4/+） 和抑制的 Gal80茨条件 （W1118;微管蛋白 Gal80茨/OR42a-mCD8：GFP;5-HT2 个R OE/ repo-Gal4）在成熟成年人暴露于 25% EB 经验 24 小时后。（C） 在允许的 18°C（左）下突触肾小球神经支配体积的定量，用于对照（绿色）和 Gal80茨-抑制的 5-HT2 个R 条件（蓝色），以及对照（绿色）和 5-HT 的 28°C 限制性温度（右）2 个R OE 状况（红色）。使用 Tukey 多重比较检验的双向方差分析显示 Gal80 的神经支配体积没有显着变化茨/18°C 的 repo 对照线（n = 20/条件，p = 0.266），或使用神经胶质细胞靶向 Gal80茨-5-HT 系列2 个18°C 时的 R OE 线（n = 20/条件，p = 0.9529），或在 Gal80 中茨/repo 控制线处于 28°C 限制性温度（n = 20/条件，p = 0.870）。神经胶质细胞靶向 Gal80 的 Or42a OSN 神经支配体积显着降低茨-5-HT2 个28°C 时的 R OE（n = 20/条件，p = 1.00 × 10−15).所有单独的数据点都用 SEM ±平均值显示。显著性表示为 p < 0.0001 （****） 和 p > 0.05 （不显著，ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。DPE，羽化后天数;OE，过表达;OSN，嗅觉感觉神经元;VM7，腹内侧 7。
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直接相反，条件性神经胶质细胞靶向 5-HT2 个完全成熟成虫的 R OE 诱导强烈的经验依赖性突触肾小球修剪，这与关键期修剪机制没有区别（图 5B）。在限制性 28°C（红色）下，缺乏 5-HT 的转基因对照2 个R原厂与单独使用油气味载体相比，构建体显示 EB 体验后 VM7 肾小球的 Or42a 神经元神经支配没有可检测到的变化（图 5B，左）。同样，在 Gal80 中茨在 28°C 下抑制因子无活性且 5-HT 的动物2 个R原厂在神经胶质细胞中，气味载体对照（油）同样没有显示突触修剪，这与缺乏 EB 暴露经验一致（图 5B，右上）。然而，在这些与 EB 经验完全相同的条件下，VM7 肾小球的 Or42a 神经元神经支配存在强烈的神经胶质修剪（图 5B，右下）。与突触肾小球修剪一致，EB 经验依赖性 5-HT 上调与临界期反应难以区分，仅发生在阻遏物非活动状态 （28°C） 中，当 5-HT2 个R原厂构建体表达（S7A 和 S7B 图）。这种从头经验依赖的突触肾小球修剪在程度上与关键期修剪（与图 2-4 相比）相当，表明幼鱼重塑能力完全再生。图 5C 显示了所有 8 种情况下 VM7 突触肾小球中 Or42a 神经元神经支配体积的定量。在允许的 18°C 温度（蓝色，左）下，当 Gal80茨阻遏物处于活动状态，与 EB 体验条件相比，神经支配体积显示油载体控制中完全缺乏修剪（图 5C，左）。在转基因对照（绿色，左）或抑制的 Gal80 中未发生明显的修剪茨动物（蓝色，左二）。在 28°C 的限制性温度（红色，右）中，当 Gal80茨无活性，神经胶质细胞靶向 5-HT2 个受体表达驱动成熟成虫中高度显着的经验依赖性修剪（图 5C，右）。在转基因对照（绿色，左）中没有发生明显的突触修剪，但现在条件性 5-HT 发生了显着的 EB 经验依赖性突触肾小球修剪2 个成人神经胶质细胞中的受体 OE（红色，右）。同样，28°C 条件神经胶质细胞 Trhn OE （Trhn原厂） 还诱导经验依赖性血清素上调和 VM7 突触肾小球修剪以响应 EB 体验（S8A-S8C 图）。这些发现表明，有条件的成人神经胶质细胞特异性 Trhn OE 驱动血清素的产生以及血清素能 5-HT2 个靶向成人神经胶质细胞的受体 OE 都会触发成熟时“关键期样”突触肾小球重塑的重新开放。
讨论
我们发现胶质细胞到胶质细胞 5-羟色胺信号传导是果蝇通过经验依赖性突触修剪进行脑回路重塑的一种新机制 [30,61,62]。众所周知，5-羟色胺能信号传导可调节哺乳动物的幼年脑回路重塑[67]。例如，对 5-羟色胺能信号传导的干扰会损害出生后关键期的视觉皮层眼优势（OD）重塑[68]，而5-羟色胺调节发育中的前额叶皮层的突触成熟[69]。然而，此类研究低估或完全忽视了神经胶质细胞参与这些机制。我们提出，由关键期感觉体验驱动的神经胶质血清素信号的上调是放大驱动果蝇感觉体验依赖性突触肾小球修剪的重塑信号的一种手段。我们发现血清素的产生和 5-HT2 个特別神经胶质细胞内的受体是经验依赖性突触肾小球修剪所必需的。众所周知，5-羟色胺能信号传导在高阶加工中调节感觉输入[24,25]，而5-羟色胺特异性控制果蝇的经验特异性嗅觉回路可塑性[24,44,70]，但这种机制是由成熟成虫的5-羟色胺能CSDn神经元（不是神经胶质细胞）介导的，其作用规模比在幼年关键期依赖经验的突触肾小球修剪要小得多在这里报告。因此，我们发现了对神经胶质血清素信号传导和 5-HT 的真正新需求2 个在生命早期关键期似乎对神经胶质吞噬突触修剪的调节具有特异性的受体。一个需要考虑的机制模型是在早期发育过程中表征的明确的细胞“社区效应”，其中调节的细胞间信号转导协调重要决策选择点的细胞行为[71,72]。类似的社区效应机制可能在果蝇幼年大脑中起作用，神经胶质细胞之间的回路定位血清素能信号传导是协调经验依赖性反应所必需的，这些反应在时间受限的发育关键期启动、启用或维持突触肾小球的神经胶质浸润吞噬细胞修剪（图 6）。
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图 6. 关键期神经胶质细胞血清素能信号传导的示意图嗅觉突触肾小球经验依赖性修剪。
Or42a OSN 突触末端（绿色）在正常情况下密集支配 VM7 肾小球（上、左）。神经胶质细胞 （红色） 主要位于 AL 神经细胞外。在暴露于 EB 气味剂的关键时期，神经胶质突（红色）浸润 VM7 肾小球（上，右）。这些投影吞噬了 Or42a OSN 末端，并介导了突触的经验依赖性修剪，以优化电路连接。随着关键期的经验，神经胶质胞体上调 Trhn 以产生 5-羟色胺（5-HT;下，左）。神经胶质细胞释放 5-HT（蓝色）仅在关键期响应体验。神经胶质细胞 5-HT2 个受体（黄色）也因关键期经历而上调，神经胶质 Trhn 血清素产生和 5-HT2 个通过 Bouton 吞噬和神经胶质细胞吞噬作用进行经验依赖性突触肾小球修剪所需的接收（下图，右）。AL，触角叶;EB， 丁酸乙酯;OSN，嗅觉感觉神经元;Trhn，色氨酸羟化酶;VM7，腹内侧 7。
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我们发现神经胶质细胞血清素能 5-HT2 个受体对于关键期经验依赖性神经胶质突触肾小球修剪至关重要。在神经元中，5-HT2 个众所周知，受体可调节成年小鼠的关键学习/记忆级联反应 [33,73] 和 5-HT2 个R 自动调节还已知在发育过程中调节 5-羟色胺能神经元回路整合 [74]。然而，神经胶质 5-HT2 个在果蝇中发现的 R 信号传导似乎完全是新颖的。我们发现神经胶质细胞 Trhn 5-HT 合成和 5-HT 的经验依赖性上调2 个R 水平仅在青少年关键期。在小鼠中，神经元 5-HT2 个R 自分泌信号转导对于活性依赖性突触重塑很重要，突触重塑可被短寿命旁分泌配体（如 BDNF）激活，以维持和/或扩增下游信号通路 [43,75,76]。这种逆行神经营养因子信号传导是控制自分泌反馈的长期模型，但神经营养因子在果蝇中并不十分保守[77]。这里显示的神经胶质细胞5-羟色胺能信号传导可能同样是一种自分泌机制，或者是一种对输入经验做出反应的胶质细胞到胶质细胞信号传导机制，以实现突触肾小球的时间受限和回路定位的神经胶质细胞修剪[44,45]。这些机制中的任何一种都可能是由 5-HT 的动态变化驱动的2 个直接协调感觉输入体验的受体水平，特别是在关键时期。剖析脑回路突触重塑与 5-HT 的调节可用性之间的关系将很有趣2 个神经胶质细胞中的受体。这种关系可以解释为什么将依赖于经验的突触修剪严格限制在关键期[1,78]。不同的神经胶质细胞亚型可能在这种血清素信号传导机制中相互作用，正如我们在果蝇幼年大脑中神经胶质细胞吞噬作用回路修剪的另一个案例中所展示的那样[46,47]，以及在啮齿动物的其他信号传导环境中发生的情况[79,80]，但这种机制在关键时期将是全新的。未来的研究将测试关键突触修剪的时间限制是否由神经胶质特异性 5-HT 决定2 个受体可用性，提供塑造大脑回路的机械能力。
在幼年关键期，神经胶质 5-HT 强烈增强了经验依赖性突触修剪2 个受体 OE，显示神经胶质 5-羟色胺信号传导是限速的。这种机制是神经胶质特异性的，因为类似的神经元 5-HT2 个R OE 对经验依赖性突触肾小球修剪没有影响。相比之下，5-HT7R OE 在野生型小鼠和神经发育疾病模型中逆转代谢型谷氨酸受体 （mGluR） 介导的 LTD 和增强型 LTD [81]。在制药上，5-HT2 个R 激动剂和拮抗剂在治疗措施中起作用，以维持基线脑回路功能。例如，5-HT2 个R 拮抗剂（非典型抗精神病药）治疗仅对一些精神分裂症患者有效，但对这些抗精神病药物无反应的病例通常对 5-HT 反应积极2 个R 激动剂 [73]。这种限速信号机制在 PTSD 患者中也观察到。与精神分裂症类似，PTSD 诱导的精神病可以对 5-HT 反应2 个R 受体拮抗剂和选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂 （SSRIs），但难治性 PTSD 病例可能对 5-羟色胺能信号传导上调剂（如 MDMA）[36,82] 和 5-HT 都有反应2 个R 激动剂（如 LSD 和裸盖菇素）[39,40,83]。因此，这种 5-HT 的证据2 个R 率限制二分法反复出现，尽管在神经系统疾病状态下，它几乎只存在于 5-羟色胺能信号转导失调中。相比之下，神经胶质 5-HT 的限速功能2 个经验依赖性突触肾小球修剪中的 Rs 似乎是全新的（图 6）。对 5-HT 的见解2 个关键时期的 R 机制要求，特别是在神经胶质细胞中，可能为一系列神经系统疾病的新治疗途径提供关键见解。要考虑的一个机理模型是 5-HT2 个R 二分法可能存在，因为维持适当的细胞间 5-羟色胺能信号传导的“开关样”要求。在大量 5-HT2 个R 相关疾病（例如，精神分裂症、PTSD、痴呆）[79]，这种开关样信号机制可能对 5-HT 有反应2 个R 拮抗剂/激动剂治疗以恢复适当的脑回路功能。
本小说 5-HT2 个神经胶质细胞中的 R 需求也可能为神经胶质细胞相关神经发育障碍的新治疗方法提供见解，例如脆性 X 综合征 （FXS），这是智力障碍 （ID） 和 ASD 最常见的遗传原因 [22,35]。此外，5-羟色胺信号传导受损与许多其他神经胶质细胞吞噬细胞脑回路修剪过度活跃的疾病状态有关（例如，精神分裂症、神经退行性疾病）[73,84]，表明神经胶质5-羟色胺信号传导失调可能起作用。5-HT 系列2 个Rs 介导正常的免疫通路信号传导 [85,86]，致幻剂、抗精神病药和抗抑郁药都通过 5-HT 起作用2 个R 函数 [40,87,88]。然而，在模式物种中，包括所涉及的细胞类型，其机制仍然知之甚少[73,89]。此处报道的果蝇神经胶质细胞血清素信号转导可能解决 5-HT 的异常2 个R 拮抗剂随机作用，可纠正和加重患者的心理症状 [84,88,90]。重要的是，我们发现 Trhn 的神经胶质 OE 可以驱动 5-HT 信号传导，以及 5-HT2 个仅在成年神经胶质细胞中的受体条件 OE 在成熟时重新启动经验依赖性突触肾小球修剪，重新打开我们果蝇模型中先前“关闭”的关键期。同样，5-HT2 个R 激动剂（如 LSD、裸盖菇素）可增加培养的成年小鼠神经元的可塑性 [33,39,89]，但这些研究的重点主要集中在诱导生长的生长因子通路（如 BDNF 和下游 TrkB 信号通路）[40,76,91]。在机制信号转导回路中，条件性成体胶质细胞 5-HT2 个R OE 重新启动经验依赖性 5-羟色胺信号传导。在未来的研究中，探索介导经验依赖性突触肾小球修剪的神经胶质信号机制将至关重要，这些机制在关键期和成熟期、跨大脑回路以及我们的果蝇 FXS 疾病模型中介导。使用5-羟色胺能疗法诱导成熟期的新脑回路重塑是一个令人着迷的目标[35,40,92]，这里报道的研究表明，神经胶质5-羟色胺信号传导可能是控制经验依赖性突触连接变化的机制中一个重要的、被忽视的组成部分。
方法
果蝇遗传学
所有动物均保持在 25°C、60% 湿度下，对标准果蝇食物进行 12：12 小时的光照/黑暗循环。转基因 Gal4 激活剂驱动系如下：普遍存在的 UH1-Gal4 （RRID： BDSC 55850） [93];神经胶质 repo-Gal4 （RRID： BDSC 7415） [94];泛神经元 elav-Gal4 （RRID： BDSC 8765） [57];OSN Or42a-Gal4 （RRID： BDSC 9969） [49];血清素能神经元 （CSDn） GMR60F02-Gal4 （RRID： BDSC 48228） [95];和色氨酸羟化酶Trhn-Gal4 [96]。转基因UAS应答系如下：膜标志物UAS-mCD8：：GFP（RRID：BDSC 5137）[97]和-mCD8：：RFP（RRID：BDSC 32219）、UAS-orco（RRID：23145）[98]和5-羟色胺途径UAS-Trhn RNAi（RRID：BDSC 25842）[58]、UAS-Trhn原厂（RRID：BDSC 27638）[99]，UAS-5-HT2 个RNAi（RRID：BDSC 31882）[63]和UAS-5-HT2 个原厂（RRID：BDSC 4830）[63]. Or42a-Gal4 用于在 orco 中驱动 UAS-orco2无效突变体（RRID：BDSC 23130）[98]。温度敏感 （ts） Gal80 阻遏蛋白为 α-tubulin-Gal80茨（RRID：BDSC 86328）[100]. 启动子融合系为 Or42a-mCD8：GFP [51]。对照系是遗传背景 w1118（RRID：BDSC 3605） 和转基因对照系 （1） w1118;Or42a-mCD8：GFP/+;回购-Gal4/+， （2） w1118;Or42a-mCD8：GFP/+;UAS-Trhn RNAi/+，（3） w1118;Or42a-mCD8：GFP/+;无人机-5-HT2 个RNAi/+， w1118;Or42a-mCD8：GFP/+;无人机-5-HT2 个原厂/+和 （4） w1118;Or42a-mCD8：：GFP/α-tubulin-Gal80茨; repo-Gal4/+ 的所有研究都使用了两性动物。
气味暴露
气味暴露处理如前所述[44,45,101]。简而言之，发育阶段的动物根据年龄、性别和基因型被作为深色蛹分类到单独的小瓶中。用胶带封口膜将细丝不锈钢网固定在样品瓶顶部。将小瓶置于密封的 3,700 ml Glasslock 容器中，其中装有 1 ml 矿物油载体（100%;Sigma-Aldrich）或 15% 至 25% EB 气味剂（Sigma-Aldrich;矿物油中的 % v/v EB）在 1.5 ml 微量离心管中，以曝光室为中心。将腔室置于温控培养箱 （25°C） 中，进行 12 小时的光照/黑暗循环。将小瓶放入腔室 4 小时后，将所有封闭的幼蝇迅速转移到干净的小瓶中，在干净的暴露室中加入新鲜的加臭剂（如上所述）。将动物在培养箱的气味暴露室中再放置 20 小时（总共 24 小时），然后立即进行免疫细胞化学处理 [101]。
条件转基因
对于所有温度敏感型 Gal80 （Gal80茨） 实验中，发育阶段的动物根据年龄、性别和基因型作为深色蛹分装到单独的小瓶中。将动物在 18°C（允许温度）下饲养 14 天，然后转移到实验温度（保持 18°C 或 28°C 限制温度）以暴露气味。如上所述，将动物暴露在密封 Glasslock 容器中具有细丝不锈钢网顶部的小瓶中，仅暴露于 1 ml 载体对照（100% 矿物油;Sigma-Aldrich）或 25% EB 加臭剂（Sigma-Aldrich;矿物油中 % v/v EB）。然后将动物在温控培养箱的气味暴露室中维持 24 小时，然后立即进行免疫细胞化学处理。
免疫细胞化学成像
将发育阶段的动物在 70% 乙醇中麻醉 1 至 2 分钟，并使用锋利的镊子 （Dumont #5） 在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS;Invitrogen 的 Alpha S将大脑在室温 （RT） 下在 4% 多聚甲醛 （PFA;EMS 15714） 在 4% 蔗糖 PBS 中。用 PBS 洗涤固定的大脑 3×然后在室温下或用 1% BSA （Sigma-Aldrich） 和 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液封闭过夜（在 4°C 下 12 至 16 小时）（PBS-T;Fisher Chemical）。将大脑与用 0.2% BSA 的 PBS-T 溶液稀释的一抗在 4°C 下孵育过夜。使用的一抗如下：鸡抗 GFP （Abcam， 13970;1：1,000）、大鼠抗 RFP （Chromotek， 5F8;1：1,000）、大鼠抗 DNEX-8 （发育研究杂交瘤库 （DSHB;1：50）、兔抗 5-HT （Immunostar;1：1,000）、兔抗 5HT2 个受体 （Abcam， ab140524， 1：100） 和小鼠抗 Repo 抗体 （DSHB， 8D12; 1：100）。用 PBS-T 将大脑以 3× 洗涤 20 分钟，然后与荧光偶联的二抗孵育过夜。使用的二抗如下：AlexaFluor-488 山羊抗兔、AlexFluor-488 山羊抗鸡、AlexaFluor-546 山羊抗大鼠和 AlexaFluor-546 驴抗大鼠（均以 1：250 的比例使用）。脑部在 PBS-T 3× 中洗涤各 20 分钟，然后用 PBS 和 dH 洗涤2O 1× 20 分钟。将大脑安装在载玻片上 （75 × 25 mm， 0.9 至 1.06 mm;Corning） 和 Fluoromount-G （EMS 17984–25） 中的玻璃盖玻片（编号 1.5H，Carl Zeiss）。使用双面胶带 （Scotch） 将盖玻片抬高到大脑上，用透明指甲油 （Sally Hansen） 密封盖玻片。在具有 63× 油浸物镜的 510 META 激光扫描共聚焦显微镜 （Carl Zeiss） 上收集图像。以 1,024 × 1,024 分辨率收集图像，Z 切片厚度为 0.75 μm [101]。显微镜和成像设置在每次实验中保持不变（确切设置可在 Protocol Exchange 中找到）。
定量测量
所有测量均使用 ImageJ 盲法分析工具插件在基因型和体验条件盲目的情况下进行。定量 5-HT、5HT2 个R 和色氨酸羟化酶 Trhn-Gal4 驱动 UAS-mCD8：：RFP 膜标志物强度值，使用所有像素的加权和，将每个位置每个切片中的所有像素相加。亮度值 <50 被降低以考虑成像背景。ImageJ JACoP 分析插件用于共定位测试。皮尔逊系数在 Z 堆栈上进行分析，阈值在盲目比较中保持不变。对于 Or42a 神经支配体积测量，为 VM7 肾小球的边界定义了 ROI，并且使用以下公式通过和切片 Z 投影的套索周长测量值来量化神经支配体积：[体积 （μm3) = 面积 （μm2) x 切片厚度 x 切片总数]。来自所有联合生物学重复的数据都保持为原始测量点散布，并进行盲法定量以确保所有试验的正常性 [101]。
统计分析
所有统计分析均使用 Prism 软件 （GraphPad 版本 9） 进行。除非另有说明，否则所有分析均使用 N = 突触肾小球数进行。所有符合参数统计标准的组均采用未配对的双尾 t 检验进行分析。对于比较 ≥2 基因型的数据，使用双向方差分析，以气味剂暴露和基因型作为自变量，然后进行 Sidak 多重比较测试，以比较每种基因型内的油气味载体和 EB 暴露条件。通过具有 5% alpha 显着性水平的双向方差分析检验分析 2 个或多个基因型之间的比较。数据在图中表示为所有单独的数据点和平均值± SEM。图中的显著性表示为 p < 0.05 （*）、p < 0.01 （**）、p < 0.001 （***） 和 p < 0.0001 （****）。p > 0.05 的值被视为不显著 （ns）。图例中给出了每次比较的确切显著性 p 值。
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通过 Or42a 神经元的关键期 EB 气味体验特异性地提高了 VM7 血清素信号传导。
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S1 图 通过 Or42a 神经元的关键期 EB 气味体验特异性地提高了 VM7 血清素信号传导。
（A） 在 orco 无效突变体 （UAS-orco;Or42a-gal4， orco2） 启用 EB 气味反应。关键期从 0-1 dpe 暴露于气味油载体（对照，左）或 25% EB 油中（经验，右），具有抗血清素（5-HT，绿色）和 Or42a 受体驱动的 mCD8：：GFP（Or42：：GFP，洋红色）膜标记用于 VM7 神经支配。（B） VM7 肾小球中 5-HT 荧光强度（左）和 Or42a 神经支配体积（右）的定量。使用 Tukey 多重比较的双向方差分析显示血清素显着增加 （n = 12/条件，p = 7.13 × 10−5）和 VM7 神经支配显着降低 （n = 12/条件，p = 4.78 × 10−10） 具有 EB 经验。具有均值 ± SEM 的单个数据点。显着性表示为 p < 0.0001 （****）。（C） 遗传背景 w1118动物在 EB 非依赖性 DA1 肾小球中表现出 5-HT（绿色）或 CadN（洋红色）在 0-1 dpe 暴露于加臭油载体（对照，左）或 25% EB 油（经验，右）的 24 小时后没有变化。（D） 使用 Tukey 多重比较的双向方差分析显示，5-HT（绿色，n = 10/条件，p = 0.930）或 CadN（品红色，n = 10/条件，p = 0.0.910）荧光强度与 EB 经验没有显着变化。（E） 遗传背景 w1118动物在 0-1 dPe 暴露于加臭油载体（对照，左）或 25% EB （经验，右）的 24 小时暴露后，视叶中的 5-HT（绿色）或 CadN（洋红色）没有变化。（F） 使用 Tukey 多重比较的双向方差分析显示，5-HT（绿色，n = 10/条件，p = 0.2981）或 CadN（品红色，n = 10/条件，p = 0.0535）荧光强度与 EB 经验没有显着变化。单个数据点以均值 ± SEM 显示。源数据可以在 S1 数据中找到。CadN，N-钙粘蛋白;DPE，羽化后天数;EB， 丁酸乙酯;VM7，腹内侧 7。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.s001
（国际电影节）
S2 图 临界期神经胶质细胞表达 Trhn 和 5-羟色胺 （5-HT），具有经验依赖性升高。
（A） 关键期 （0–1 dpe） 共标记神经胶质核（Repo，品红色）和 Trhn-Gal4 驱动的 UAS-mCD8：：RFP 膜标志物（青色）的 VM7 突触肾小球。比较显示，从 0-1 dpe 暴露于油臭剂载体对照（左）和 25% EB（右）的 24 小时。（B） EB 曝光后的高倍率成像，对血清素（5-HT，黄色）、神经胶质细胞核（Repo，品红色）和 Trhn-Gal4 驱动的 UAS-mCD8：：RFP 膜标志物（蓝色）进行三重标记。（C） 5-HT 和 Repo 标记（白色）从 0-1 dpe 暴露于油臭剂载体对照（左）和 25% EB（右）24 小时后共定位。（D） 5-HT 和神经胶质 Repo 共定位与 2 种处理条件的定量。未配对的 t 检验比较显示 5-HT-胶质细胞 （Repo） 共定位显著增加 （每个 n = 10，p = 8.78 × 10 −8) (E） 胶质 Repo 和 Trhn-Gal4 驱动的 UAS-mCD8：：RFP 膜标志物与 2 种处理条件的共定位定量。未配对的 t 检验比较显示 Trhn-胶质细胞 （Repo） 共定位显著增加 （每个 n = 10，p = 0.0017）。源数据可以在 S1 数据中找到。DPE，羽化后天数;EB， 丁酸乙酯;Trhn，色氨酸羟化酶;VM7，腹内侧 7。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.s002
（国际电影节）
S3 图 神经元中的细胞靶向 Trhn RNAi 和神经胶质细胞差异在经验依赖性关键期影响血清素。
（A） UAS-Trhn RNAi/+ 转基因对照，关键期暴露 24 小时，从 0-1 dpe 到 25% EB 体验，在 VM7 肾小球（左）和血清素能神经元 （CSDn） 细胞体（右）中标记血清素（5-HT，绿色）。（B） 在相同条件下，神经元中由 elav-Gal4 驱动的 Trhn RNAi （elav>Trhn RNAi）。EB 体验依赖性 5-羟色胺上调在 VM7 肾小球中持续存在（左），尽管 5-羟色黄胺如预期的那样在 CSDn 胞体中丢失（右）。（C） 在相同条件下，神经胶质细胞中 repo-Gal4 驱动的 Trhn RNAi （repo>Trhn RNAi）。经验依赖性血清素上调在 VM7 肾小球（左）中丢失，尽管血清素维持在 CSDn 胞体内（右）。（D） VM7 中 5-HT 荧光强度的定量。与 Tukey 多重比较的单因素方差分析显示，与 UAS-Trhn RNAi/+ 对照相比，repo-Gal4 驱动的 UAS-Trhn RNAi 中 5-HT 显着降低 （n = 10，p = 9.00 × 10−15） 和 elav-Gal4 驱动的 UAS-Trhn RNAi （n = 10，p = 5.72 × 10−5).（E） CSDn 神经元细胞体中 5-HT 荧光强度的定量。与 Tukey 多重比较的单因素方差分析显示，与 repo-Gal4 驱动的 UAS-Trhn RNAi 相比，elav-Gal4 中 5-HT 显着降低 （n = 10，p = 8.00 × 10−15).所有单个数据点均以均值 ± SEM 显示。显著性表示为 p < 0.0001 （****），p < 0.05 （*），p > 0.05 （不显著，ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。CSDn，对侧突出的 5-羟色胺免疫反应性脑后神经元;DPE，羽化后天数;EB， 丁酸乙酯;RNAi，RNA 干扰;Trhn，色氨酸羟化酶;VM7，腹内侧 7。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.s003
（国际电影节）
S4 图 5HT 系列2 个神经元中的受体 RNAi 对经验依赖性修剪没有影响。
（A） 5-HT2 个R RNAi 对照 （w1118;Or42a-mCD8：：GFP/+;无人机-5-HT2 个R RNAi/+;顶部）和神经元特异性 5-HT2 个R RNAi （w1118;Or42a-mCD8：：GFP/elav-Gal4;无人机-5-HT2 个 RNAi/+，下图），从 0-1 dpe 暴露于加臭油载体（对照，左）或 25% EB（经验，右）的关键期暴露 24 小时后。VM7 肾小球的 Or42a-mCD8：：GFP 神经支配显示为基于强度的热图（彩色 LU 刻度;右下图）。（B） Or42a 神经元神经支配 3-D 体积的定量。具有 Tukey 多重比较的双向方差分析显示 EB 经验的显著修剪 （n = 12/条件，p = 1.05 × 10−12），这与神经元靶向的 5-HT 没有显著差异2 个R RNAi 条件 （n = 10/条件，p = 0.73）。单个数据点用均值 ± SEM 显示。显着性表示为 p > 0.05（不显着，ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。DPE，羽化后天数;EB， 丁酸乙酯;RNAi，RNA 干扰;VM7，腹内侧 7。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.s004
（国际电影节）
S5 图 在幼年关键期 5HT2A 受体的经验依赖性上调，但在成熟成虫中不上调。
（A） 对照 （w1118） 幼年临界期（0-1 dPe，上图）或成熟成虫（7-8 dPe，下图）5HT 的 AL 染色2 个受体（抗 5HT2 个R，绿色）暴露于油中 24 小时（对照，左）和 25% EB 油（经验（EB），右）。（B） 5HT 的定量2 个R 期间和治疗条件下的荧光强度。使用 Tukey 多重比较的双向方差分析显示 5HT 中显着上调2 个具有 EB 经验的幼年关键期的 R 荧光强度 （绿色，左，n = 10/条件，p = 1.12 × 10−6），但在成熟成虫中没有显着变化 （红色，右，n = 10/条件，p = 0.123）。所有单个数据点均以均值 ± SEM 显示。显着性在 p > 0.05 时表示不显著 （ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。AL，触角叶;EB， 丁酸乙酯;5-HT 系列2 个R，5-HT2A 受体。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.s005
（国际电影节）
S6 图 5HT 的细胞靶向转基因对照2 个在经验依赖性关键期神经元和神经胶质细胞中的 R 水平。
（A） 神经元转基因对照（elav-Gal4/+，左）和神经元敲低 5HT2 个受体（elav-Gal4/+、UAS-5HT2 个RNAi/+，右）和 5HT2 个从 0-1 dpe 暴露于加臭剂载体（对照、油）或 25% 加臭剂（经验、EB）的关键期暴露 24 小时后，受体标记（绿色）。（B） 神经胶质细胞 repo-Gal4 对照（repo-Gal4/+，左）的相同标记，神经胶质细胞敲低 5HT2 个受体 （UAS-5-HT2 个RNAi/repo-Gal4，中）和神经胶质细胞 5HT2 个OE （UAS-5-HT2 个OE/ repo-Gal4，右）。（C） 5HT 的定量2 个repo-Gal4 对照（绿色）、elav-Gal4 对照（蓝色）、repo-Gal4 5HT 中的 R 荧光强度2 个RNAi（橙色），elav-Gal4 5HT2 个RNAi（黄色，右起第二个）和 5HT 胶质细胞 5HT2 个OE （红色）。使用 Tukey 的多重比较的双向方差分析显示 EB 体验依赖性 5HT 的增加2 个两种转基因对照中的受体水平 （n = 10，repo-Gal4;p = 5.38 × 10 −10， elav-Gal4;p = 0.0205），5HT 显著降低2 个两种 RNAi 条件下的受体水平 （n = 10，repo-Gal4;p = 4.63 × 10 −10， elav-Gal4;p = 1.05 × 10−9），以及神经胶质细胞 5HT 的 EB 反应显著升高2 个R OE （n = 10/条件，p = 2.36 × 10−9).所有单个数据点均以均值 ± SEM 显示。显著性表示为 p < 0.0001 （****），p < 0.05 （*），p > 0.05 （不显著，ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。DPE，羽化后天数;EB， 丁酸乙酯;OE，过表达;RNAi、RNA 干扰。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.s006
（国际电影节）
S7 图 5HT 的经验依赖性 5-HT 上调2 个受体 OE 诱导的成熟成人突触修剪。
（A） 条件性神经胶质细胞 5HT2 个R OE 线 （w1118;微管蛋白-Gal80茨/OR42a：：GFP;无人机-5HT2 个R OE/repo-Gal4） 在允许的 18°C Gal80 中茨-抑制条件（上）和限制性 28°C 5HT2 个R OE 条件（底部）。成熟成人暴露于气味载体（油，左）或 25% 气味剂（EB，右）24 小时后，5-羟色胺（5-HT，绿色）和 Or42a 神经支配（Or42a：：GFP，红色）的 VM7 共标记。（B） 在允许的 18°C Gal80 中定量 5-HT 荧光强度茨-抑制（蓝色）和限制性 28°C 5-HT2 个R OE（红色）条件，在控油和 EB 暴露中。使用 Tukey 多重比较检验的双向方差分析显示，在 18°C 对照中，5-HT 荧光强度没有显着变化（每个 n = 10，p = 0.789），但神经胶质细胞靶向 5HT 时显著增加 2 个28°C 时的 R OE（每个 n = 10，p = 6.81 × 10−8).单个数据点以均值 ± SEM 显示。显著性表示为 p < 0.0001 （****） 和 p > 0.05 （不显著，ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。EB， 丁酸乙酯;OE，过表达;VM7，腹内侧 7。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.s007
（国际电影节）
S8 图 成人神经胶质细胞中的条件性 Trhn OE 诱导 EB 经验依赖性 5-HT 上调和修剪。
（A） 条件性神经胶质细胞 Trhn OE 线 （w1118;微管蛋白-Gal80茨/UAS-Trhn OE;repo-Gal4/UAS-Or42a：：GFP） 在允许的 18°C Gal80 中茨-抑制条件（上）和 28°C Trhn 神经胶质 OE 条件（下）。成熟成人暴露于气味载体（油，左）或 25% 气味剂（EB，右）24 小时后，5-羟色胺（5-HT，绿色）和 Or42a 神经支配（Or42a：：GFP，红色）的 VM7 共标记。（B） 在 18°C 对照（蓝色）和 28°C Trhn OE（红色）条件下突触肾小球神经支配体积的定量。使用 Tukey 多重比较检验的双向方差分析显示，在 18°C 时神经支配体积没有显着变化 （每个 n = 10;p = 0.985），但在 28°C 时神经胶质 Trhn OE 显著降低（每个 n = 10，p = 3.53 × 10 −10).（C） 在 18°C 对照（蓝色）和 28°C Trhn OE（红色）条件下定量 5-HT 荧光强度。使用 Tukey 多重比较检验的双向方差分析显示，在 18°C 下 5-HT 没有显着变化（每个 n = 10，p = 0.740），但在 28°C 下神经胶质细胞 Trhn OE 显着增加（每个 n = 10，p = 0.0412）。 单个数据点用均值 ± SEM 显示。显著性表示为 p < 0.0001 （****），p < 0.05 （*） 和 p > 0.05 （不显著，ns）。源数据可以在 S1 数据中找到。EB， 丁酸乙酯;OE，过表达;Trhn，色氨酸羟化酶;VM7，腹内侧 7。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.s008
（国际电影节）
S1 数据。 为所有图表收集的原始数据值（图 2-5，S1-S8 图）。
每个图都有一个选项卡标签（即“主图 2”），并在每个选项卡中按面板标签（A、B、C 等）进行组织。统计分析包含在 S1 数据文件中。
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002822.s009
（XLSX）
确认
我们感谢 Zhichun Lin 对果蝇饲养和遗传杂交的贡献。我们感谢 Emma Rushton 对果蝇遗传学的贡献。我们感谢 Dominic Vita 对神经胶质细胞成像的贡献。我们感谢其他 Broadie Lab 成员提供的关键见解和持续的讨论。我们感谢布卢明顿果蝇库存中心和维也纳果蝇资源中心提供的基本细胞系，以及发育研究杂交瘤库提供的基本抗体。
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