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免费医学论文发表-调节利什曼原虫寄生虫中蛋白质分泌、分选和自噬的线性基序相对于其
发布时间:2024-02-21 16:44:36  来源:  【 】   浏览:
免费医学论文发表-调节利什曼原虫寄生虫中蛋白质分泌、分选和自噬的线性基序相对于其宿主当量存在分歧
 
抽象
致病性热带利什曼原虫鞭毛虫属于早期分支真核生物谱系(动质体),具有几个独特的特征。不幸的是,从分子生物学的角度来看,人们对它们知之甚少,这使得开发机制新颖和选择性药物变得困难。在这里,我们结合结构建模、进化序列发散和深度学习,深入探索了三个功能关键的靶向短线性基序系统及其受体。分泌信号肽、内质网 (ER) 保留基序(KDEL 基序)和自噬信号(与 ATG8 家族成员相互作用的基序)是细胞生命古老且必不可少的组成部分。尽管预计动质体中是保守的,但我们观察到所有这三个系统都显示出不同程度的差异,这与它们在动物、植物或真菌中研究得更好的等价物不同。我们不仅描述了它们的行为,还建立了模型,可以预测几种未表征的利什曼原虫蛋白的定位和潜在功能。异常富含Ala/Val的分泌信号肽、以Asp-Leu-COOH结尾的内质网驻留蛋白和非典型ATG8样蛋白都是动质体寄生虫的独特分子特征。由于它们与宿主的系统性分歧,它们的几种关键蛋白质-蛋白质相互作用可以作为针对利什曼病的选择性抗菌剂的靶标。
 
作者摘要
利什曼病是一种有害疾病,会导致生活质量显着下降,严重时可能致命。该病是由以白蛉(包括人类)为主要宿主的白蛉媒介传播的病原体利什曼原虫引起的。利什曼病影响着全世界超过1000万人,持续的环境变暖被认为有助于该疾病传播到新的地区。利什曼原虫的发病机制目前知之甚少,为了对抗感染和更好地控制疾病,需要进一步了解病原体的分子细节。在这里,我们描述了三种对利什曼原虫细胞管家和感染过程至关重要的蛋白质分选系统,它们与宿主的对应物有很大不同:分泌信号肽、内质网保留基序和自噬信号。我们提供最先进的计算模型来阐明这些系统。探索这些主要的细胞分选基序可能会为利什曼原虫细胞生物学提供新的见解,并有助于开发新的治疗方法。
 
数字
表1图1图2图3表1图1图2图3
  
引文: Zeke A, Gibson TJ, Dobson L (2024) 调节利什曼原虫寄生虫中蛋白质分泌、分选和自噬的线性基序相对于其宿主当量存在分歧。PLoS 计算生物学 20(2): 编号:E1011902。 https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902
 
编辑 器: Ylva Ivarsson,瑞典乌普萨拉大学
 
收到: 2023年8月2日;接受: 2024年2月8日;发表: 2月 16, 2024
 
版权所有: © 2024 Zeke et al.这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章,该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是注明原作者和来源。
 
数据可用性: 所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。https://zenodo.org/records/10201884 也提供补充结构。利什曼原虫信号预测方法可在 https://leishmaniadb.ttk.hu/files/LeiSig.zip 和 https://zenodo.org/records/10201868 使用。用于扫描利什曼原虫蛋白质组以寻找线性基序的 Python 代码示例已添加到补充材料中。
 
资金: 该项目已获得欧盟地平线2020研究和创新计划的资助,该计划由玛丽·斯克洛多夫斯卡-居里(Marie Sklodowska-Curie)赠款协议(第101028908号)资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
 
利益争夺: 提交人声明不存在相互竞争的利益。
 
介绍
细胞内适当的蛋白质运输和定位对于维持细胞完整性和稳态至关重要。真核生物携带一套基本保守的核心信号和分选系统,确保关键细胞过程的正确执行。这些不仅包括蛋白质分泌的信号(通过 Sec61 转位子),还包括随后将分泌的蛋白质靶向到适当区室的指令。细胞质蛋白也可能受到多种分选现象的影响,从核导入和输出到通过自噬的次级细胞质到囊泡靶向。参与这些分选系统的受体通常利用短而无序的蛋白质基序,尽管它们在>10亿年前分化,但在各种真核生物冠组中高度保守[1–4]。分泌信号识别颗粒 (SRP)、内质网 (ER) 保留受体 (KDEL 受体) 和自噬信号转导 ATG8 蛋白是这些过程的重要组成部分,有助于调节蛋白质定位、检索和降解。虽然每个过程都有不同的机制和功能,但它们共同确保了有效的蛋白质运输和细胞质量控制。
 
信号识别颗粒(SRP)是真核生物(以及原核生物和古细菌)中的一种核糖核蛋白复合物,在蛋白质靶向和跨细胞膜易位中起着至关重要的作用[5]。通过识别新合成蛋白质N末端的特定信号序列,SRP将它们引导至内质网(ER)上的Sec61转位子,从而实现分泌蛋白和跨膜蛋白的生物发生[6]。在这种复合物中,SRP54蛋白负责识别从翻译核糖体突出的N端信号肽或信号锚[7]。虽然信号肽在靶向后被专用的信号肽酶共翻译去除,但类似的SRP依赖性识别的信号锚入膜中[8]。具有信号肽但没有跨膜片段的真核ER驻留蛋白通过涉及所谓的KDEL受体的特定pH依赖性转运系统保留在管腔中[9]。这些受体(从它们识别的Lys/His-Asp-Glu-Leu-COOH序列中获得它们的同名)协调靶蛋白的逆行转运,将含有C端KDEL基序的蛋白从高尔基体中检索回内质网[10,11]。通过维持ER驻留伴侣的正确定位,KDEL受体也是细胞质量控制和稳态的关键组成部分[12]。
 
自噬是负责细胞质成分降解和回收的细胞过程。它受涉及自噬相关蛋白(ATG)和关键信号通路的复杂信号转导网络的调控[13]。通过货物识别机制,自噬选择性地降解受损或不需要的蛋白质和细胞器,促进细胞更新并适应营养剥夺。ATG8是一种小的泛素样修饰剂,是该机制的关键核心成分之一,特别是在巨自噬的情况下[14,15]。ATG8蛋白通过泛素蛋白酶样ATG4和E2样ATG3蛋白的顺序作用与磷脂酰乙醇胺脂质偶联[16]。脂质化 ATG8 不仅指导吞噬团膜的形成,而且还通过多个线性基序作为自噬体的募集剂。在这些基序中,所谓的LIR(LC3相互作用区)基序是动物、真菌和植物中最著名的自噬调节因子[15,17]。这些基序可以指导各种细胞质靶标的巨自噬,如受损的线粒体(线粒体自噬)、过氧化物酶体(pexophagy)、蛋白质聚集体(聚集体)、糖原聚合物(糖吞噬)、入侵微生物(异种噬菌)等[15,18]。
 
这三个主要分子系统也代表了新型药物的理想分子靶点。许多共翻译分泌调节剂(包括 KZR-8445、HUN-7293 和共转蛋白)已被确定具有治疗人类疾病的潜力。这些化合物能够通过选择性干扰某些人类蛋白质的分泌来抑制其信号肽或跨膜片段序列的产生[19,20]。虽然ER保留受体尚未被小分子靶向,但ATG8蛋白的LIR位点已被抑制剂[21]和货物特异性自噬调节剂(AUTACs:靶向嵌合体的自噬)成功靶向[22]。因此,我们在利什曼原虫以及更广泛的动质体组中的发现也可能具有治疗意义。
 
利什曼病是一种被忽视的热带病,由利什曼原虫属的单细胞鞭毛虫引起,具有皮肤和全身性,具有复杂的生命周期,涉及昆虫和哺乳动物宿主[23]。这些原生动物寄生虫是基底真核生物群动质体的成员,该群包括致病性锥虫物种,可引起非洲昏睡病和南美恰加斯病。现在人们认识到,这些危险的病原体是一个更广泛的群体的一部分,也包括自由生活的物种(例如Bodo saltans)以及专性致病性锥虫[24]。在锥虫中,现在很清楚,寄生哺乳动物宿主的能力独立进化了多次。因此,经遗传学研究,利什曼原虫物种最接近的近缘种是昆虫寄生虫鞭毛虫钩端单胞菌(形成利什曼原虫科或亚科),它们与锥虫属的亲缘关系非常遥远[25,26]。虽然异养动质体与次级光合裸藻物种在进化上相关,但它们代表了真核生物生命树(冠群Discoba,裸虫门)的早期分支:只有厌氧的后单胞菌(例如来自Fornicata组的肠贾第鞭毛虫)被认为更早分化[27].动质体具有一系列不寻常的分子生物学特征,包括多顺反子基因组,其转录本通过反式剪接处理,以及高度复杂的线粒体mRNA编辑装置[26]。虽然动质体似乎具有类似于其他真核生物和细菌的分泌信号肽[28,29],以及相当典型的内质网生理学和自噬,但我们试图探索这些系统是否在分子水平上与高等真核生物的系统相匹配。在我们的分析过程中,我们广泛使用了我们小组开发的 LeishMANIAdb [30] 数据库。我们的研究表明,虽然这些系统具有古老的真核生物遗产,但它们在动质体中严重分化,并且很难通过比较序列分析方法进行识别。
 
结果与讨论
动质体信号肽与通常的真核模式有很大不同
众所周知,利什曼原虫物种具有一种不寻常的利用外泌体分泌蛋白质的方式[31],通常被认为是将蛋白质输出到宿主细胞的主要方式。然而,与其他动质体一样,也存在典型的真核 Sec61 依赖性分泌系统。后者对于可溶性溶酶体或内质网驻留以及跨膜蛋白的生物发生可能是必不可少的。虽然已知的利什曼原虫信号肽 (SP) 确实与一般真核信号具有广泛的相似性,但它们在几个方面更接近细菌 II 型信号肽,例如它们的氨基酸含量。为了进行简明的分析,我们收集了 LeishMANIAdb [30] 和 SwissProt [33] 中 SignalP6 [32] 预测的 SP。在检查其疏水核心时,我们注意到利什曼原虫中的SPs强烈喜欢小的疏水氨基酸,导致较高的丙氨酸(相对频率(r.f.:0.19)和缬氨酸(r.f.:0.17)和较低的亮氨酸(r.f.:0.26)和苯丙氨酸(r.f.:0.04)含量,与其他真核生物(r.f.:0.12,0.11,0.32,0.07)相比;图 1/A;S1 表)。尽管这种差异在纯粹的统计学术语中并不显著(使用蛋白质组水平的统计),但在许多 SP 示例中仍然非常明显。频移似乎是利什曼原虫信号肽本身的特征,因为利什曼原虫物种和SwissProt的整个蛋白质组氨基酸分布非常相似(S2表)。
 
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图 1.
 
答:信号肽疏水区的氨基酸分布。B:左:AF2 预测了 SRP54 蛋白与婴儿乳杆菌和酿酒酵母的信号肽之间具有不同组合的结构(G. Euk.:通用真核生物,动素:动质体,信号 p:信号肽)。使用的 Pdb 型号:signal_sacs2_sc.pdb、signal_sacs2_lei.pdb、signal_leiin_sc.pdb。signal_leiin_lei.pdb(结构在 S 材质中可用)。C:SRP54和信号肽不同组合的能量(自由焓)计算结果 D:利什曼原虫特异性信号肽预测方法(LeiSig)的接收者操作特性(ROC) E:不同方法对5种利什曼原虫物种的信号肽预测。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.g001
 
为了研究这一不寻常发现的结构背景,我们求助于SRP54 M结构域的结构建模,负责识别信号肽。唯一通过实验确定的结构是古细菌起源的,而大多数真核生物的研究都集中在动物和真菌系统上。因此,我们必须从动物-真菌-植物冠组中模拟一个复合物,为此我们选择了酵母酿酒酵母 SRP54 和同源信号肽。在原始的古菌复合体中,M结构域中的三个螺旋(αM1,αM2,αM4)识别并与信号肽形成接触。此外,αM1b和αMF也可能通过关闭信号肽来帮助识别[34](S1图)。虽然尚未确定真核复合体,但Phyre 2 [35]和AlphaFold2 [36](AF2)的同源性建模可以很容易地用于评估结构差异。尽管拓扑结构大致相似,但 Phyre2 难以捕获 SP 周围的二级结构元素,这可能是因为我们只能模拟单体而不是结合结构(S2 图)。我们比较了 SRP54 M 结构域的 AF2 预测结构与 L 不同组合的 SP。婴儿和 S.酿酒师。虽然包括来自同一物种的蛋白质在内的同源复合物似乎是紧凑的,不包含空体积或冲突,但跨物种组合的预测结构存在明显问题:酿酒酵母 SRP54 和 L。婴儿SP形成结构过于松散,而L.婴儿SRP54 和 S。酿酒师SP 包含可见的冲突(图 1/B)。
 
为了跟进我们的初步观察,我们在来自八个选定物种的 SRP54 M 结构域之间生成了 16 个组合 (A.拟南芥,H.智人,S.solfataricus,B. 萨尔坦斯,T.克鲁兹,T.布鲁塞,L.西穆里,L.婴儿)带两个 SP (L.婴儿和 S.酿酒师)使用 AF2(参见 S 材料:signal*.pdb 和 S3 表了解 ptm 分数),并使用 FoldX 计算每个二元结构的整体稳定性 [37]。这些计算背后的基本原理是,动质体 SRP54 可能识别一些不同的信号肽,因此一般真核 SRP54 和信号肽的稳定性以及动质体 SRP54 和信号肽的稳定性应该具有较低的能量值,而交叉组合(一般真核生物-动质体)应该具有不太有利的能量值。虽然依靠酵母信号肽应该会略微影响能量计算,但在这个测试中,我们只分析趋势,并不期望值是高精度的。考虑“通用”真核生物 SRP54 和 S。酿酒师SP,它们的平均稳定性表明系统的能量阈值是合理的(在3个结构上计算;-35.07 kcal/mol)。另一方面,当我们使用跨物种组合(“通用”真核生物 SRP54 和 L.婴儿SP(3 个结构),或动质体 SRP54s 和通用真核 SP(5 个结构)),其计算的结合能在绝对值上要低得多(分别为 -14.79 kcal/mol 和 -21.20 kcal/mol)。重要的是,具有同源动质体 SRP54 和 L。婴儿计算出的平均能量SP与酵母SP的其他真核结构域相似(5个结构;-31.17 kcal / mol)(图1 / C和S4表)。
 
这些计算表明,利什曼原虫受体变得不自然地紧张,当用一般真核 SP 建模时,能量估计较弱,因此“通常的真核”信号肽和动质体受体之间的复合物不太可能在体内形成。早前研究表明,锥虫信号肽难以靶向重组蛋白以在其他真核生物中分泌[28]。请注意,酵母肽也可以作为动物或植物信号的良好替代物。这意味着动质体 SRP45 的识别表面异常狭窄,解释了对较短的 Ala/Val 侧链的偏好。我们认为,这也意味着利什曼原虫蛋白较窄的结合沟可能足够独特,可以作为新型小分子抑制剂的靶标。
 
如果动质体信号肽与其他研究得更好的真核生物如此不同,我们想知道一些SP示例是否可能发散到足以被经典预测算法遗漏。为此,我们使用存储在 LeishMANIAdb 中的同源信息扩展了已知的利什曼原虫信号肽集:当 SignalP6 预测信号肽时(S5 表),我们检查了 (I) 信号肽比对中的间隙数量和 (II) 蛋白质同源组内信号肽的序列同一性(S6 表).使用这种方法,我们收集了数百种蛋白质,其中 SignalP6 预测某些序列上的信号肽,但不预测其他密切相关的序列上的信号肽,即使序列同一性非常高并且片段中没有间隙。我们总共组装了 732 个这样的候选序列,其中 411 个与 SignalP6 信号肽的间隙含量低于 50%,序列同一性超过 50%。
 
只有当我们能够在相关蛋白质之间可靠地分配信息时,同源性定位才有用,但是在 LeishMANIAdb 中,我们有数千种蛋白质没有经过实验研究的同源物。为了评估这些蛋白质是否可能具有信号肽,我们开发了一种基于机器学习的预测方法。首先,我们使用 SignalP6 预测信号肽(1024 种蛋白质)和 411 种蛋白质的正面示例创建了一个训练集,其中同源性可用于分配信号肽。对于负面预测,我们纳入了膜蛋白(CCTOP [38]预测的第一个膜区域位于N端50个残基内 - 1709个蛋白质)以及没有预测的膜区域或信号肽的蛋白质(2212个蛋白质)。数据集分为训练集和独立测试集(基准集 1、S7 和 S8 表)。我们还准备了一个包含 89 种蛋白质的额外数据集(通过从利什曼原虫蛋白质组中随机选择蛋白质),我们使用深度同源性搜索手动检查信号肽的存在(基准集 2,S9 表)。接下来,我们使用迁移学习在训练数据集上微调预训练的蛋白质语言模型[39]。在基准集 1 上,我们实现了 93% 的平衡精度和 95% 的曲线下面积,而在基准集 2 上,我们实现了 81% 的平衡精度和 92% 的曲线下面积(图 1/D;更多细节:S10表)。通过将临界值设置为更高的值(默认为 0.5),可以进一步提高特异性。开发的方法(LeiSig)可在 https://leishmaniadb.ttk.hu/files/LeiSig.zip 下载。LeiSig 以氨基酸序列为输入,预测利什曼原虫蛋白是否具有信号肽。尽管预测切割位点仍然是一个挑战,但对于利什曼原虫物种来说,预测可能的分泌蛋白已经向前迈出了一大步,可能会缩小可能在建立感染中发挥作用的蛋白质集。虽然我们的方法有明显的缺点(见方法),但这种方法(具有更高的灵敏度(S11表)揭示了5种利什曼原虫物种中3558个具有SP的候选蛋白,其中2103个是其他方法无法预测的(图1/E和S12和S13表)。 这表明利什曼原虫蛋白质组中存在大量潜在的新型分泌或跨膜蛋白。
 
保留KDEL基序的内质网在寄生动质体中异常发散
在信号肽之后,我们将注意力转向利什曼原虫的另一个不寻常的特征。组成型内质网 (ER) 管腔蛋白组包含许多高度保守的蛋白质,这些蛋白质在分泌蛋白折叠、糖基化和质量控制中发挥作用。在所有已知的真核生物中,这些蛋白质在高尔基体逆行运输系统的帮助下,利用单个受体(也称为KDEL受体)组成型分选到内质网。然而,在利什曼原虫属的蛋白质中,这些蛋白质的C末端通常的高度保守(H/K)DEL共识,在动物、植物和真菌冠组中是高度保守的(图2/A)。相反,仔细检查表明,保守的、已知的或预测的内质网驻留利什曼原虫蛋白似乎总是携带羧基末端 DL 基序(图 2/B)。这一共识与动质体以外的所有其他已知的真核生物不同,包括早期分枝的鞭毛虫肠第鞭毛虫,但与其他动质体物种相匹配。
 
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图 2.
 
答:比较来自不同谱系的五种真核生物的所有已知或预测的KDEL样基序的序列标志,表明其保守性。B:这种原始的 K/H/RDEL 共识在动质体中发生了改变,主要产生以 DL 结尾的肽。C:叠加蛋白质模型表明,动质体的内质网检索受体(KDEL受体)的守门环与其他真核生物不同,在所有被检查的寄生物中,与传入的经典KDEL肽(pdb:6I6H)的主链发生冲突,但在自由生活的Bodo盐中则不冲突。D:HADDOCK模型表明,长守门环迫使利什曼原虫受体的配体采取与哺乳动物KDEL受体不同的主链构象。E:识别受体共识的改变可以识别动质体ER驻留蛋白的保守家族,包括新鉴定的蛋白质组(蓝色条表示存在含有KDEL样肽的直系同源物,而浅蓝色条表示没有KDEL的同源蛋白)。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.g002
 
仔细检查 AlphaFold2 预测的 ER 保留 KDEL 受体的结构有助于解释这种差异。尽管受体结合裂隙的碱基在受体腔内衬的氨基酸方面几乎具有 100% 的同一性,但利什曼原虫中 KDEL 受体的入口被细长的环变窄,当叠加在动物 KDEL 受体-配体晶体结构上时导致冲突(图 2/C)。这迫使利什曼原虫属的肽链在进入受体时采用截然不同的几何形状。为了证明这一现象,我们建立了一个基于AlphaFold2结构的婴儿利什曼原虫KDEL受体模型,该模型具有肽配体(使用最佳共识序列),与HADDOCK对接并优化其几何形状[40](参见方法)。与动物KDEL受体复合物的晶体结构的比较清楚地显示了不同的主链几何形状(图2 / D)。
 
有趣的是,这种与经典模式的偏差不仅限于利什曼原虫物种。KDEL受体中相同的内向“守门人”环特征也见于其他动质体物种,例如布氏锥虫或克氏锥虫。然而,由于守门人氨基酸的差异,所得的 KxDL 样基序比利什曼原虫属中的典型基序更接近。或任何其他动质体(见S14表)。奇怪的是,我们发现C末端的异常DL偏好(Asp-Glu-COOH)仅限于专性寄生的锥虫科。对自由生活的动质体Bodo saltans中基序的调查表明,它仍然更喜欢规范的KDEL基序,尽管个体残基位置的变化相对宽松。在这种早期分枝的物种中,细长的“守门人”向外延伸,导致一个宽阔的空腔,可能具有相对宽松的配体结合特性。正是这种“守门人”循环的逐渐改变导致了寄生虫中受限制但非规范的 KDEL 样 DL 基序。虽然这种保留基序与它们的宿主生物体有很大不同,但目前尚不清楚它是否真正与其(动物或植物)宿主的内质网受体正交。因此,这种不寻常的分歧(如果有的话)的生物学作用目前尚不清楚。
 
对KDEL受体及其配体基序的更广泛分析可以更精确地捕捉到这种进化(参见S3图中的进化树和序列,除了图2所示的物种外,还涉及12个额外的物种)。它包括几个锥虫以及 Neobodo designis、Perkinsela spp.(非寄生动质体)、Eutreptiella gymnastica (Euglenida) 和 Naegleria gruberi (Heterolobosea,冠组 Discoba) 作为外群,总共 n = 17 种(S15 表)。尽管守门人环序列(甚至其确切长度)的保守性相对较差,但进化轨迹似乎很清楚。锥虫科中的大多数 AlphaFold2 模型都显示向内定位的守门环(除了 Strigomonas culicis 和 Phytomonas sp.EM1)。相比之下,其他生物体的所有模型都显示出向外定位的环。即使 AlphaFold2 在产生最有利的柔性环构象(具有低 pLDDT 值)方面不是 100% 正确,这也非常符合以下假设:完全寄生锥虫具有优先向内的构象,而对于其他物种,相同的守门环总是向外的(非寄生动质体 Bodo saltans、Neobodo designis、 Perkinsela spp.和euglenid Eutreptiella gymnastica)(S4和S5图)。一组朝内的氨基酸(尤其是 Arg)严重限制了受体内的空间,迫使配体基序采用不同的主链几何形状以及不同的序列偏好。环路中的特定Pro似乎也稳定了大多数物种的这种向内几何形状。这些比对还揭示了 KDEL 对锥虫属的 -4 位置有轻微 Arg/Lys 偏好的可能原因。在他们的例子中,紧挨着守门环下方的 Glu->Asp 交换扩大了受体的空腔,允许规范的 Arg/Lys 残基存在于该基序中(S6 图)。KDEL受体的细长“守门人”环是裸虫门独有的特征,这是其他真核生物所没有的进化创新。后者得到了以下观察结果的支持:Naegleria amoebae(属于Discoba的另一个分支)仍然显示出具有短环和典型K/HDEL基序的完美经典受体。受体的这种进化路径与基序标志密切相关,在裸虫科(广泛向外环)中显示出保守的EL基序末端,在非寄生动质体中显示出混合的EL / DL末端(环仍然适度向外),并且在专性寄生锥虫科(主要是向内定位的环)的成员中几乎完全是DL末端(S3图)。
 
重新定义的基序正则表达式与新开发的信号预测方法使我们能够从 LeishMANIAdb 中扫描候选 ER 蛋白的物种(S16 表)。为了进一步限制可能的假阳性命中,我们还提供了有关内在蛋白紊乱和细胞定位的信息。我们还提供了由 PSSMSearch [41] 计算的特定位置评分矩阵,以执行更灵敏的扫描(S17 表)。认识到利什曼原虫属中正确的KDEL等效基序,我们不仅设法确认了已知的ER驻留蛋白的保守性:Hsp70(BIP和HYOU1家族)和Hsp90(内纤溶蛋白)伴侣,钙网蛋白,蛋白质二硫键异构酶和肽基 - 脯氨酰异构酶在利什曼原虫物种中,还有其他几种不寻常的蛋白质(图2 / E和S14表)。我们在利什曼尼科(Leishmaniinae)中发现了一种ER驻留的几丁质酶,具有保守的KDEL样信号,这种信号也存在于其他一些真核生物中,尽管不在动物中。相对鲜为人知的MANF(中脑星形胶质细胞衍生的神经营养因子,也称为ARMET)蛋白以前只在动物身上被发现,可能是古老的真核伴侣[42]。我们发现了不止一个含有皂苷B结构域的蛋白质(假定的伴侣)家族,一个明显与拟南芥对盐敏感(SES1)蛋白(SESSAB)同源[43][44],第二个例子显示出与动植物中发现的Canopy蛋白(CARSAB)的一些结构相似性[45]。我们还自信地鉴定出一种动质体希瓦氏菌样磷酸酶(Shewanella-like phosphatase, SHELP),在真环状体中已经发现了同源内质网保留信号,暗示了其古老起源,尽管它们的功能目前尚不清楚[46]。
 
值得注意的是,动质体似乎也具有某些酶的同源对,其中一个蛋白质谱系始终携带KDEL等效信号(除了信号肽),而第二个谱系对则没有。与内质网相关的动质体ATP酶(ERIKA;动物躯干没有这样的基序)[47],以及更广为人知的锥虫硫酮合酶就是这种情况。在后一种情况下,ER驻留的谷胱甘肽亚精胺酰胺结构域蛋白(ERGAD)仅携带一个结构域,其生理作用可能不同于其更广为人知的参与锥虫硫酮代谢的胞质旁系同源物(具有两个催化结构域)[48]。
 
为了评估这些新描述的蛋白质的功能,我们还检查了动质体ER保留的几丁质酶,谷胱甘肽酰亚胺酰胺酶结构域(ERGAD),ERIKA和希瓦氏菌样磷酸酶(SHELP)蛋白的预测催化位点使用序列比对和AlphaFold2模型(S7,S8,S9和S10图 ,分别)。有趣的是,除了ERGAD之外,其中单个水解酶结构域始终缺乏催化所需的亲核残基,所有其他结构域都有望具有催化活性。这在预测的糖水解酶 18(几丁质酶)的情况下尤其有趣,因为目前尚不清楚它在内质网内处理的底物是什么。然而,非动质体真核生物和其他一些单细胞真核生物(例如绿藻)也具有同源 ER 驻留蛋白(具有与 β-1-4 N-乙酰氨基葡萄糖低聚糖相容的催化位点,并且不携带在无活性几丁质酶中观察到的突变),暗示它参与了迄今为止未知的生化途径。
 
最后,有一些例子表明,在利什曼原虫物种及其亲戚中,蛋白质家族始终携带ER保留信号(除了信号肽),但与其他真核生物中的蛋白质没有任何已知的同源性。一种这样的蛋白质 (LESSER) 具有非常小的结构域,在利什曼原虫科中具有 ER 保留信号,但似乎在其他动质体中分泌。最近发现另一种更有趣的动质体特异性蛋白(kinetoplastid-specific protein, EVER)对多诺瓦尼乳杆菌的生存能力至关重要[49]。虽然最初被描述为一种分泌蛋白(由于信号肽),但我们现在自信地预测它是一种内质网成分。与自由生活的博多盐丹相比,利什曼原虫属(以及其他寄生锥虫)的内质网驻留酶库存似乎总体减少,这一事实可能具有治疗意义。鉴于这些基因丢失,保留的内质网驻留蛋白可能具有对利什曼原虫生命周期很重要的功能,由于它们的独特性或与同源宿主蛋白的差异性,它们可能提供药物靶标。
 
LIR样基序的鉴定揭示了利什曼尼科动物中快速进化的自噬网络
ATG8蛋白是所有已知真核生物中巨自噬所必需的小泛素样修饰剂[50]。与泛素不同,它们共价(但可逆地)附着在膜脂质磷脂酰乙醇胺上(通过 ATG4 酶),从而指导吞噬团膜的形成。自噬体吞噬的位置、范围和细胞内容物由 ATG8 相互作用蛋白决定,这些蛋白通常通过动物、真菌和植物中所谓的 LIR 基序结合 ATG8。尽管存在微小的变异(例如,在动物中,ATG8蛋白已分裂为LC3和GABARAP亚家族,LIR基序配体偏好略有不同)[51],但这种重要的线性基序在已知的真核生物中基本上是保守的,只有轻微的改变。
 
正如先前的研究已经指出的那样,利什曼原虫和钩端单胞菌属已经将其祖先的ATG8/ATG12蛋白增殖为多种旁系同源物[52],命名法复杂,但在其他自噬相关系统中也显示出重大差异[53]。我们对动质体ATG8进化树的仔细、详细分析表明,利什曼原虫属有五个不同的ATG8样蛋白主要家族[54]。先前确定的 ATG8A、ATG8B 和 ATG8C 亚群在序列和结构方面高度分化且不典型。我们观察到先前注释的利什曼原虫 ATG12 基因与不同的利什曼原虫 ATG8A、ATG8B 和 ATG8C 蛋白具有兄弟进化关系,并且这些组似乎都是从在其他锥虫中发现的单个 ATG12 样基因进化而来的(S11 图)。不幸的是,无法从稀缺的可用数据中确定动质体 ATG12 在生化上是否更类似于经典的真核生物 ATG8 或 ATG12。ATG8和ATG12蛋白具有很强的结构和序列同源性,它们从相同的祖先泛素样修饰物进化而来[55]。值得注意的是,动质体ATG12蛋白需要蛋白酶切割,类似于ATG8(由ATG4酶处理),与其他真核ATG12不同[54]。最后,利什曼原虫属的 ATG8 基因和蛋白质是相当典型的,其表面与其他真核 ATG8 蛋白高度相似。仔细比较表面表明,ATG8A、B、C 和 ATG12 蛋白中的 LIR 结合表面发生了严重改变(图 3/A)。因此,我们假设后一种蛋白质不能结合经典的 LIR 基序,并且这些基序只能靶向 ATG8。
 
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图 3.
 
答:我们在利什曼尼科的ATG8蛋白组的进化模型。对于每个旁系同源物,预期阻断 LIR 结合的表面突变以红色显示,而新的不变表面以橙色显示。小结构图从相同角度显示匹配的蛋白质表面。每个蛋白质组的预测 ATG4 切割位点(P-4 至 P-1)由每个组名称下方用灰色书写的序列来举例说明。B:ATG8A、ATG8B 和 ATG8C 基因通常存在于利什曼原虫基因组中的两个串联阵列中,但它们的拷贝数因物种而异。C:ATG8 蛋白保存的 LIR 肽结合能力由该蛋白与利什曼原虫 LIR 基序模型肽之间的模拟模型来说明,类似于在保守的自噬装置蛋白 ATG2、ATG3 和 ATG4 中看到的肽(下面写的 Discoba 组蛋白质的频率标志)。D:ATG8 和 ATG4.2 酶之间以及 ATG8C 和 ATG4.2 之间的模拟复合物高度相似,并且揭示了非典型 ATG8 可能存在 LIR 等效基序。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.g003
 
作为另一个引人注目的发现,动质体 ATG12 和任何非典型 ATG8 家族蛋白都不具有与 ATG3 中发现的 AIM(也称为 AIM12)线性基序兼容的 LIR 界面。在大多数已知的真核生物中,后一个基序对ATG12介导的ATG8偶联至关重要,使ATG12偶联物在ATG8的上游起作用[56\u201258]。在动物、植物和真菌中发现的几乎无处不在的 AIM12 基序甚至在动质体中都不保守(尽管我们的 ATG3 比对表明它存在于 Discoba 中的其他群体中,这表明存在继发性损失,参见 S14 图)。因此,动质体 ATG12 在(宏)自噬和 ATG8 部署中的作用目前尚不清楚。
 
虽然 ATG8A、ATG8B 或 ATG8C 蛋白似乎都不能够进行经典的 LIR 基序结合(因为与 ATG8 相比,相互作用界面不保守),但它们确实具有其他假定的蛋白质-蛋白质相互作用表面(图 3/A)。对非典型 ATG8 样蛋白的仔细表面分析表明,虽然它们中几乎没有保留,但每种 ATG8A、ATG8B 和 ATG8C 蛋白都具有两个潜在的蛋白质-蛋白质相互作用表面,它们在每个亚型中都是保守的(见 S12 图)。其中之一是经过严重改变的 LIR 界面,但很可能能够招募与规范 LIR 截然不同的基序。在这些非典型ATG8中也相当保守的另一个区域与在其他真核生物中发现的ATG8蛋白的所谓UIM(泛素相互作用基序)结合面相当接近[59]。因此,后一个接口很可能也是功能性的,尽管其合作伙伴目前尚不清楚。值得注意的是,大多数 ATG8A、ATG8B 或 ATG8C 利什曼原虫蛋白在该区域呈现两个彼此相邻的半胱氨酸氨基酸,这表明可能存在氧化还原依赖性调节。有趣的是,这些蛋白质中的每一种都优选地保留了改变的LIR位点(ATG8A,ATG8C)或后者的新位点(ATG8B),暗示了它们之间的一些微妙的功能差异(S12图)。
 
作为最近多样化的证据,大多数非典型 ATG8 基因被发现是利什曼尼科大型基因阵列的一部分。ATG8C基因形成自己的阵列,而ATG8A/B基因在不同的基因组位置形成联合阵列,具有许多相同或高度相似的基因(图3/B和S18和S19表)。这些阵列中的大多数还包含零碎的、不完整的 ATG8 样 ORF,但这些 ORF 可能有助于相关基因之间的重组。这种猖獗的基因扩增显然不是由于对哺乳动物宿主的适应,因为在昆虫寄生虫Leptomonas pyrrhocoris中已经看到了匹配的阵列。尽管如此,每个单独簇的ATG8样基因拷贝数增加在物种之间是非常一致的。有趣的是,ATG12基因似乎不受基因扩增的影响,典型的ATG8基因也没有(图3/B)。
 
为了测试经典 ATG8 蛋白的 LIR 界面的功能,我们搜索了其他真核生物 (H.智人,S.酿酒师,A.拟南芥)。虽然动质体基因组中完全缺少许多蛋白质的同源物,但我们设法找到了三个例子,其中LIR基序在进化过程中也被保留下来(S13和S15图)。由于AlphaFold2多聚体已被证明在预测LIR基序[60]和其他ATG8伴侣的正确几何形状方面相当成功,因此我们也将其应用于利什曼原虫复合物。ATG3 是 E2 样结合酶,参与将活化的 ATG8 从 ATG7(E1 样)转移到靶脂质。与大多数其他真核生物(某些真菌除外)一样,ATG3 的内环携带非典型 LIR 基序,在利什曼原虫中也是保守的,正如我们的比对和 AlphaFold2 模型所示(S14 图)。在利什曼原虫 ATG4.2 酶的无序 C 末端也发现了保守的、规范的 LIR 基序(S15 图)。ATG4 是参与 ATG8 预处理的泛素水解酶样酶(有趣的是,另一个同源物 ATG4.1 始终缺乏 LIR 基序,并且 ATG4.2 的基序在某些其他动质体中也发生了改变)。最后,脂质转移蛋白 ATG2 似乎也存在于动质体中,其经典 LIR 基序位于与动物相同的位置(在预测的无序环上)。(S13 图)。图 3/C 显示了每个蛋白质比对的序列标志以及与婴儿利什曼原虫 ATG8 的进一步理想化模型 LIR 肽复合物。
 
在ATG8表面保护的鼓励下,我们开始鉴定利什曼原虫基因组中潜在的含有LIR基序的自噬相关蛋白(表1,更多细节另见S20和S21表)。考虑到保守的实例,动质体LIR基序的最简单正则表达是[DE]。{0,2}[WFY]..[LIV] 或 [DEST]。{0,2}[WFY]..[LIV],也允许磷酸化为末端提供电荷,这在许多真核生物中很常见。然而,这没有考虑到内部位置强烈选择结构破坏(Pro,Gly)或带正电荷(Arg,Lys)的氨基酸,并且不允许芳烃(Phe,Tyr,Trp,His)在第一个干预位置[1,15]。侧翼区域,尤其是N端侧翼,也强烈不利于带正电的残基。在第一个疏水位置 (Y-LIR) 含有 Tyr 的基序很少见,因为它们的结合力比 F-LIR 或 W-LIR 对应物更弱。因此,一个更好、更严格的定义是(允许 C 侧翼承担与 N 侧翼相同的锚定作用,因为它也出现在许多真核 LIR 基序中,例如脊椎动物 Beclin-1):[^RK][^RK][DE][WF][^PGRKFYWH][^PGRK][LIV] |[^RK][德][^RK][WF][^PGRKFYWH][^PGRK][丽芙] |[德][^RK][^RK][WF][^PGRKFYWH][^PGRK][丽芙] |[^RK][^RK][^RK][WF][^PGRKFYWH][^PGRK][丽芙][^RK]{0,1}[德].后一种定义几乎涵盖了在动质体及其亲戚(冠群Discoba)中观察到的所有经典、保守的LIR基序,只有零星的例外(非典型ATG3基序仅与此不同,在第二个疏水口袋中使用Thr)。在对大量经过实验测试的规范 LIR 基序(来自 H.智人,S.酿酒师和 A.拟南芥)在LIRcentral[61]上,我们发现这个严格的定义仍然恢复了所有已知的功能性LIR基序(以及所有核心自噬装置基序)的48%,同时拒绝了78%的非功能性基序(S20表)。然而,即使有这些限制,利什曼原虫蛋白质组中的基序命中数量仍然非常大。因此,我们只分析了少量精心挑选的例子,其中分子结构或进化背景暗示了可能的功能基序(如表1和S21所示)。
 
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表 1. 选择具有可能功能性 LIR 基序和基序进化保守的婴儿利什曼原虫蛋白。
 
图案核心加粗并带有下划线。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.t001
 
钙蛋白酶样蛋白酶在利什曼原虫中是一个庞大而多样但神秘的蛋白质家族,其中只有一部分蛋白质保留蛋白水解功能[62]。有趣的是,我们发现许多这些钙蛋白酶样蛋白携带LIR基序(F-LIR和W-LIR亚型),甚至包括基序倍数。这首次表明利什曼原虫钙蛋白酶样蛋白在自噬中具有潜在的重要生理功能。值得注意的是,我们的带有LIR基序的钙蛋白酶示例都没有完整、保守的催化位点,因此它们最有可能的目的在于介导蛋白质-蛋白质相互作用。我们还在利什曼原虫Neurobeachin/ALFY和FIS1直系同源物中鉴定了LIR基序(这两个蛋白家族都参与动物的自噬)[63,64]。其他 LIR 实例也显示出一些内在逻辑,例如这些基序与 LysM 结构域一起存在。后一个蛋白质结构域是一个聚糖感应模块(一些LysM结构域结合几丁质,其他肽聚糖),参与检测和清除其他真核生物中的入侵生物(作为细胞质传感器),但其在利什曼原虫中的配体特异性尚不清楚[65]。另一个有趣的发现是,在DnaJ伴侣上经常存在假定的LIR基序,DnaJ伴侣蛋白是一个在利什曼原虫物种中高度扩增的蛋白质家族[66]。已知DnaJ(HSP40)蛋白参与伴侣介导的自噬[67],因此至少其中一些基序可能具有功能意义。有趣的是,我们发现的大多数LIR基序实例都有非常浅的祖先。尽管ATG8总体上具有良好的表面保守性,但这些基序很少在利什曼原虫+钩端单胞菌(利什曼尼亚科)组之外保守。因此,我们假设利什曼原虫自噬网络可能在进化方面进行了广泛且相对较新的重新连接。
 
在保守的自噬调节因子中,ATG4.2也很有趣,原因有很多。在 ATG4 的极端 C 末端存在 LIR 基序几乎是有道理的,因为它在许多其他真核生物中也存在。有趣的是,所有利什曼原虫亲戚都拥有不是一个,而是两个明显可区分的 ATG4 旁系同源物(ATG4.1 和 ATG4.2),其中只有 ATG4.2 具有 LIR 基序。利什曼原虫过去,ATG4.1 和 ATG4.2 被建议选择性处理不同的 ATG8 样蛋白。然而,目前尚无进化或结构上一致的模式报道[54]。仅基于结构和进化论证,我们推测典型的利什曼原虫 ATG8 可能是由细胞中含有 ATG4.2 的匹配 LIR 基序处理的。这将使 ATG4.1 成为负责激活 ATG8B、ATG8C 和可能的 ATG8A 的主要蛋白酶,它们都具有相似的切割位点,但与 ATG8 的切割位点不同。为了证实这一理论,我们使用 AlphaFold2 多聚体构建了 ATG4.2 和 ATG8 之间假设复合物的完整结构。这种复合体(图 3/D)在伴侣之间具有出色的结构相容性,是一个完美契合的切割位点,并配有来自 C 端的 LIR 基序,该基序对接到 ATG8 中。我们还模拟了 ATG4.1 和 ATG8C 的潜在复合物,这给出了一个令人惊讶的建议:ATG4.1 的 C 末端具有与经典 LIR 基序非常不同的序列,但它有可能以类似的方式与非典型 ATG8 亲戚相互作用。不幸的是,我们还无法预测这些LIR等效的线性基序,至少需要一个例子首先进行实验验证。鉴于在其他真核生物中观察到的ATG8和/或ATG4旁系同源物的特化,我们不禁推测利什曼原虫寄生虫中也存在类似的现象[68,69]。
 
在本文研究的三种生化系统中,ATG8系统是最复杂的,但最不适合抗菌药物开发。利什曼原虫LIR基序与人类基序过于相似,我们仍然对新的动质体特异性蛋白质-蛋白质相互作用和线性基序没有足够的了解,无法确定确切的分子靶点。
 
总结
在这项工作中,我们研究了三类短线性基序,这些基序对与细胞膜系统相关的蛋白质很重要。在这三种情况下,已知和预测的SLiM及其相互作用者都与它们在动物,真菌和植物界中研究得更好的等价物不同。信号肽和KDEL基序相互作用都发生在其受体蛋白的深沟中。利什曼原虫系统的独特特征表明,这些系统可能直接靶向治疗发现。相比之下,经典的LIR基序与宿主生物的基序更相似,因此不太适合作为直接靶标。此外,很明显,这种利什曼原虫系统中的大多数主题尚未确定。然而,利什曼原虫中 LIR/ATG 系统的急剧扩展表明,鉴定这些不同的 LIR 等效 SLiM 可能会促进对动质体细胞生物学的富有成效的见解。我们希望这里介绍的三个基序类别的预测对利什曼原虫研究人员有用。
 
方法
信号肽预测
我们下载了利什曼原虫参考蛋白质组(L.少校,L.婴儿,L.墨西哥,L.巴西人,L.多诺瓦尼)来自 LeishMANIAdb 1.0 [30],而 SwissProt 2023_2 [33] 也被用作参考。使用SignalP6.0预测信号肽[32]。使用这些结果计算氨基酸分布,在 SignalP 预测的疏水区域和全长蛋白质上(S1 和 S2 表)。SRP54 蛋白折叠 (A.拟南芥,H.智人,S.solfataricus,B. 萨尔坦斯,T.克鲁兹,T.布鲁塞,L.西穆里,L.婴儿)结合信号肽(S.酿酒师,L.婴儿)使用 ColabFold 1.5.2 [70] 使用 archeal SRP54 晶体结构作为模板 [34] 进行预测(ptm 评分:S3 表)。为了使用第二种根本不同的方法,还使用Phyre2.0服务器预测了SRP54倍数[35]。我们使用 BLAST [71] 来搜索 L 的最近命中。考虑 S 的婴儿信号肽 (UniProt: A4HY78/A4HY79)。来自晶体结构的酿酒酵母序列(值得注意的是,SignalP6 也预测第一次命中具有 SP,图 1/B)。FoldX 5.0 [37] 用于松弛 ColabFold 1.5.2 生成的结构并计算其推断的结构稳定性(图 1/C 和 S4 表)。
 
为了进行预测,我们使用以下方法准备了阳性(信号肽)和阴性数据集(其他):我们选择了具有预测信号肽的蛋白质(S5表),然后使用LeishMANIAdb将这些预测扩展到同源物(需要最大50%的间隙含量和超过50%的序列鉴定,相同的序列仅使用一次;S6 表)。阴性组包含CCTOP[38]预测的前50个残基中具有膜区域的蛋白质,以及其他蛋白质(没有任何类型的预测)(S6表)。阳性数据被多次使用,因此两个数据集的大小相等。将正数据集和负数据集分为训练(S7表)和测试(基准集1;S8 表)组(90% 和 10%)。同时,我们随机选择了 100 种蛋白质,并手动注释它们是否具有信号肽(其中 11 种蛋白质无法分类,这些蛋白质被省略; 基准集 2;S9 表)。为了开发预测方法,我们使用了迁移学习:语言模型使用预训练模型:esm2_t12_35M_UR50D [39],并在构建的训练数据集上进行了微调(图 1/D)。该预测以氨基酸序列为输入,并预测该序列是否具有信号肽(但无法预测切割位点)。在预测了5个利什曼原虫参考蛋白质组的信号肽后,我们将结果与其他方法进行了比较(图1/E和S10-S13表)。
 
至于我们预测算法的局限性,缺乏实验数据是一个关键问题。此外,我们无法确保测试集是完全独立的:将冗余减少到 70% 将删除 80% 的序列(因为这些序列是短的、只有 N 端段),因此这种方法不会留下足够的数据来训练和测试网络。因此,我们的结果应该更好地解释为对已经公认的信号肽预测方法的扩展(在某种程度上它反映了 SignalP6 参数,因为它对 SignalP6 训练集的预测达到了 91% 的准确率(S11 表))。来自阴性集的膜区域是否是真正的膜段,而不是信号肽,也存在高度的模糊性。尽管 CCTOP 具备歧视这些区域的能力,但它也依赖于我们打算在此处修改的早期版本的 SignalP。值得注意的是,这种相当严格的方法不太可能产生误报命中。
 
KDEL受体建模和ER驻留蛋白鉴定
为了探索动质体蛋白质组中的KDEL等效基序,我们首先观察了来自通用真核ER驻留蛋白家族(BIP1,HYOU1,内纤溶蛋白,钙网蛋白,硫氧还蛋白,亲环蛋白等,图2/A和S14表)的蛋白质的C端。下一步,我们利用观察结果在婴儿利什曼原虫和多诺瓦尼利什曼原虫蛋白质组中寻找具有 C 端 El 或 DL 共识序列的相似的信号肽蛋白(图 2/B)。然后,我们评估了命中率的守恒性,以增加我们对预测的信心。为了将它们与自由生活的Bodo saltans的ER驻留蛋白质组进行比较,我们应用了进化保守推论(在至少一个动质体蛋白质组中具有KDEL等效基序的所有蛋白质家族)。使用ClustalOmega[72]制备比对。我们使用IUPred3[73]和AlphaFold2[74]来寻找无序区域,并使用DeepLoc[75]来预测蛋白质定位。
 
图 2/B 中显示的动质体 KDEL 样基序标志包括已知和新颖(预测的 ER 居民)家族。对于非动质体真核生物,我们使用带注释的 ER 驻留示例来生成徽标,但肠贾第鞭毛虫除外,我们不得不求助于相同的 EL/DL C 末端搜索,并结合信号肽要求来预测 ER 保留的蛋白质。要查看我们完整的基序集合以及这些生物的进化比较,请参阅 S 材料。使用 UniProt BLAST 搜索和比对从进化角度分析新的动质体蛋白家族。以前没有已知同源物的家族,或者拥有多个旁系同源物,只研究了不同的分支,被赋予了新的、人类可读的名称和建议的缩写(图2/C)。
 
为了进行比较分析,我们使用了来自以下物种的直系同源 KDEL 受体的 AlphaFold2 (AF2) 预测模型:智人 (UniProt: P24390)、酿酒酵母 (UniProt: P18414)、裂原酵母 (UniProt: O94270)、拟南芥 (UniProt: P35402)、肠贾第鞭毛虫 (UniProt: A8B6P2)、博多盐 (UniProt: A0A0S4JT51)、克氏锥虫 (UniProt: Q4DMI8)、 布氏锥虫(UniProt:Q384K5)、塞莫里钩端单胞菌(UniProt:A0A0N1I068)和婴儿利什曼原虫(UniProt:A4I3D7)。通过将它们叠加在实验确定的KDEL受体复合物上来完成结构的视觉分析(图2 / D,pdb:6I6H)。扩展分析还使用了预测的 KDEL 受体结构 Hertigi (A0A836IGX2), Phytomonas spp.Hart1 (W6LFI0), 植物单胞菌属EM1 (W6KYJ3)、尖毛锥虫 (S9UDF7)、Deanei 锥虫 (A0A7G2CK51)、锥虫 (A0A1X0NYI5)、锥虫 ( A0A422Q6J1)、Neobodo designis (A0A7S1LPH7)、Perkinsela spp.CCAP1540/4 (A0A0L1KLY5) 和 Eutreptiella gymnastica(多个旁系同源物:A0A7S1IBA2、A0A7S1NIW0、A0A7S4G7V5)以及 Naegleria gruberi (D2V4W2)。间日锥虫的KDEL受体在UniProt中不可用。
 
对于上述所有物种,我们在UniProt(仅限于分类纲Discoba)中使用BLAST搜索来识别为核心物种建立的假定ER驻留蛋白的同源物。使用类似KDEL序列的同源物(见S15表)通过WebLogo生成所有序列徽标。进化树使用了文献中建立的裸虫和动质体物种的共识分支拓扑结构[76\u201278]。在所有模型叠加后,在 PyMol(1.8 版)中目视评估受体环的方向(向内、向外、非常向外暴露)。他们的 ClustalOmega 比对也被手动修改,通过考虑模型守门环上氨基酸的方向和 3D 距离(S4 和 S5 图),然后使用修改后的比对来建立序列-结构-功能相关性。
 
为了获得利什曼原虫C端DL(Asp-Leu-COOH)基序识别的工作模型,我们建立了一个最佳利什曼原虫配体的模型(使用pdb:6I6H中的肽作为指导),并使用HADDOCK 2.4将该肽对接到AlphaFold2预测受体中[40](图2/E)。灵活的对接方法被认为优于同源建模(包括AlphaFold2多聚体),因为预计主链几何形状与以前已知的例子有很大不同。将来自最佳能量簇的模型合并到一个多状态PDB(S材料:KDEL-best-HADDOCK-run-01.pdb)中,并通过将其叠加在动物受体-配体结构(pdb:6I6H)上,使用一个代表性实例生成图2 / D。
 
为了评估预测的内质网驻留酶的功能,我们对其可能的催化位点和 AlphaFold2 预测的利什曼原虫婴儿几丁质酶 (A4HWX6_LEIIN)、谷胱甘肽亚精胺酰胺结构域蛋白(锥虫硫酮合酶同源物 ERGAD)(A4I1M7_LEIIN)、ER 牵连的动质体 ATP 酶(torsin 同源物 ERIKA)(A4HU03_LEIIN)和希瓦氏菌样磷酸酶的结构模型进行了扩展(在 Discoba 上重复搜索后)(SHELP)(A4I008_LEIIN)。在所有情况下,负载有配体或底物的参考晶体结构作为比较点(PDB:分别为 1E6N、2VPS、5J1S 和 2Z72–S7–S7–S10 图)。
 
ATG8结构分析和含LIR基序的伴侣预测
为了在动质体中构建 ATG8/ATG12 家族蛋白树,我们从 UniProt 中检索了单个样本蛋白,并进行了 BLAST 搜索以获得同一家族的更多代表。作为参考,我们纳入了来自各种动物、真菌和植物蛋白质组的注释更好的 ATG8 和 ATG12 蛋白序列。对齐是使用具有默认设置的 UniProt 接口完成的(有关结果树,请参见 S11 图)。这些多重排列表明树的生根是有问题的,虽然利什曼原虫 ATG8A、ATG8B、ATG8C 和 ATG12 显然属于同一家族,并且仅在利什曼尼科中分化,但更深层次的关系尚不清楚。生成婴儿利什曼原虫 ATG8 (A4HYJ2)、ATG12 (E9AH00)、ATG8C.x (A4HTT6)、ATG8B.2 (A4HYA4) 和 ATG8A.1 (E9AGS4) 蛋白的 AlphaFold2 模型结构并叠加在 PyMOL 1.8 中,并手动着色关键氨基酸(图 3/A)。为了进行表面保护分析(S12图),对齐了以下序列(UniProt登录号),以对上述婴儿利什曼原虫ATG8家族蛋白的表面着色:ATG8:A4HYJ2,Q4QD46,A4HAB2,A0A0M9G613;ATG12:E9AH00、Q4QBL7、A4HCG9、A0A0N0DZX5;ATG8C:A4HTT6、Q4QI09、Q4QI15、Q4QI18、Q4QI08、Q4QI19、Q4QI13、Q4QI11、A4H5J3、A4H5J2、A0A381MCF0、A0A381MAT2、A0A381MBG2、A0A0M9FWM3、A0A0M9FWE5、A0A0N0VEA7、A0A0N0DTH2;ATG8B:A4HYA4、A0A381MFR9、A4HYA5、Q4QDD6、Q4QDD3、Q4QDC5、Q4QDD0、Q4QDC8、A4HA43、A4HA42、A0A0M9G5V4、A0A0M9G5H5;对于 ATG8A:E9AGS4、Q4QDD1、Q4QDD4、A4HA39、A0A0N0DXB5(来自婴儿乳杆菌、杆菌、巴西乳杆菌和热血钩端单胞菌的所有结构完全完整、非冗余的 ATG8 家族蛋白序列)。在PyMol 1.8中,根据每个Clustal Omega对齐(*:0.0,::0.33,.:0.67,_:1.0)中的ClustalOmega相似性符号重载其B因子后,在PyMol 1.8中制备叠加结构的图形。
 
为了识别具有 LIR 基序的保守 ATG8 伴侣,我们使用 UniProt BLAST(具有默认设置)查询一组已知的含有自噬的蛋白质(智人、酿酒酵母、拟南芥)的蛋白质,以搜索仅限于分类类 Discoba 的蛋白质。我们只接受LIR基序也位于同一区域(+50/-50个氨基酸)对齐的命中,以防它们不完美匹配。使用ClustalOmega通过Jalview[79]重新对齐同源蛋白,以审查与参考序列的基序匹配(S13–S15图)。使用WebLogo服务器在频率图模式下制备图案标志[80]。为了深入了解这些命中物的功能,我们在 ColabFold 平台上使用 AlphaFold2 多聚体对全长婴儿利什曼原虫 ATG3 (A4I8P6_LEIIN) 和末端处理的 ATG8 (A4HYJ2_LEIIN 1-120) 进行了建模(S 材料:LeiATG3ATG8.pdb;ptm 评分:S3 表)。我们对婴儿利什曼原虫 ATG2 (A4IBB7_LEIIN) 的短肽片段重复了相同的过程,因为整个蛋白质几乎有 3000 个氨基酸长(S 材料:LeiATG2pepATG8.pdb;ptm 评分:S3 表)。ATG8-ATG4复合物(A4HYJ2 [ATG8]与A4I521 [ATG4.2]和A4HTT6 [ATG8C.x]与A4I8K7 [ATG4.1])也通过Colabfold平台使用AlphaFold2多聚体生成。S13 和 S14 图以及图 3/D 中显示了 5 个输出模型的一个代表性结构,每个复合物(S 材料:LeiATG41ATG8C.pdb LeiATG42ATG8.pdb;ptm 分数:S3 表)。含有LIR基序的样品L。婴儿AlphaFold2 多聚体也生成了 ATG8 复合物模型,并在 PyMol 1.8 中手动调整了侧翼的单个氨基酸,以更好地说明所有极性氢键的可能性(图 3/B,S 材料:Lei-ATG8-LIR-best-model.pdb)。相同的肽轮廓覆盖在图 3/A 的第一行结构上,以指示 LIR 结合界面。利什曼原虫 ATG12 LIR 界面与 AIM12 基序的不相容性是通过将其 AlphaFold2 模型叠加在后者与植物 ATG12 复合物的实验晶体结构上来评估的。
 
通过将UniProt注释蛋白重新映射到NCBI的染色体模型(婴儿利什曼原虫JPCM5、主要利什曼原虫Friedlin、巴西利什曼原虫MHOM/BR/75/M2904和Leptomonas pyrrhocoris)来分析ATG8/ATG12家族ORFs的遗传结构。尽管还发现较短、散布、未注释的 ORF 与 ATG8 序列一致,但我们只计算了要生成的完整、全长 ATG8 家族蛋白(图 3/C)。但是,所有 ORF 都列在 S18 和 S19 表中。
 
对论文中提出的基序进行蛋白质组范围的扫描
我们开发的用于对利什曼原虫蛋白质组进行信号肽预测的 LeiSig 方法可在 https://leishmaniadb.ttk.hu/files/LeiSig.zip 和 https://zenodo.org/records/10201868 使用。
 
修改后的 KDEL 图案可以使用正则表达式(S14 表;另请参阅 S 材料以获取简短脚本)进行搜索。
 
修改后的 LIR 基序可以使用正则表达式(S21 表;另请参阅 S 材料以获取简短脚本)进行搜索。
 
手稿中分析的蛋白质的结构模型
用于分析的所有结构都列在“补充结构”文件中。
 
支持信息
信号肽疏水区域的氨基酸分布。
 
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S1 表。 信号肽疏水区域的氨基酸分布。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s001
 
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S2 表。 全长蛋白质氨基酸分布。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s002
 
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S3 表。 AlphaFold2 ptm 分数。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s003
 
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S4 表。 SRP54 + 信号肽的能量计算。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s004
 
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S5 表。 通过 SignalP6 在 LeishMANIAdb 中检测到的信号肽。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s005
 
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S6 表。 通过考虑直系同源物来定位信号肽。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s006
 
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S7 表。 神经网络的训练集。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s007
 
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S8 表。 用于信号肽预测的基准集 1。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s008
 
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S9 表。 用于信号肽预测的基准集 2。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s009
 
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S10 表。 神经网络的评估。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s010
 
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S11 表。 SignalP6 训练集上的预测结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s011
 
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S12 表。 5种利什曼原虫的阳性预测结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s012
 
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S13 表。 5种利什曼原虫的信号肽预测统计。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s013
 
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S14 表。 核心物种的预测 ER 驻留蛋白列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s014
 
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S15 表。 扩展物种的同源 ER 驻留蛋白列表。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s015
 
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S16 表。 kinetoplastid KDEL 正则表达式的搜索结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s016
 
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S17 表。 PSSM 用于修改后的 KDEL 图案。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s017
 
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S18 表。 ATG8染色体位置。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s018
 
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S19 表。 ATG8 99% 相同的序列。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s019
 
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S20 表。 LIRcentral 中用于建立正则表达式的 LIR 基序。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s020
 
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S21 表。 kinetoplastid LIR 正则表达式的搜索结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s021
 
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S1 图。
左图:酿酒酵母 SRP54 与信号肽的 X 射线结构 (PDB: 3KL4) —绿色:介导与信号肽相互作用的 SRP54 螺旋;橙色:保守性差的环;灰色:信号肽。右图:动质体SRP54蛋白的结构叠加。蛋白质片段名称取自 Janda 等人,Nature,2010 年。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s022
 
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S2 图。
SRP54婴儿利什曼原虫的叠加Phyre2(蓝色)和AlphaFol2(橙色)模型
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s023
 
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S3 图。 对 Discoba(n = 17 种)的 KDEL 受体和基序进行详细的进化轨迹分析。
分支根据观察到的KDEL受体守门环的结构进行着色。图2中物种的KDEL图案的标志是相同的。其他物种(n = 12)的标志来自基于同源性的BLAST搜索,以预测动质体ER驻留蛋白(见补充表)。徽标下方的小数字表示每个物种携带KDEL的单个序列的数量(这可能因基因重复、丢失或未完全注释的蛋白质组而有所不同)。树的整体拓扑结构基于文献。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s024
 
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S4 图。
对KDEL受体的详细分析,每个受体(上图)及其叠加结构(下图)的守门环的结构引导排列。用脊椎动物KDEL受体(pdb:6I6H)结晶的基序显示为小麦,而使用HADDOCK建模的xxDL基序显示为橙色。箭头显示了由于锥虫科中朝内的环而导致的主链位移。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s025
 
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S5 图。 从不同的角度观察相同的KDEL受体(如S4图)和配体肽。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s026
 
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S6 图。 在 AlphaFold2 模型(来自 EBI)的 S3 图对齐上确定的动质体 KDEL 受体守门环的特征。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s027
 
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S7 图。 来自不同裸虫的预测内质网驻留几丁质酶的核心催化区域的 ClustalO 序列比对,具有不同的活性和非活性几丁质酶(GH18 家族,上图)。
尽管催化位点 Asp 与 Asn 的交换一致,但这些蛋白质似乎都具有催化活性(红色 = 催化位点残基)。婴儿利什曼原虫 (A4HWX6_LEIIN) 预测的内质网驻留几丁质酶催化位点的结构模型(下图),AlphaFold 模型叠加在细菌几丁质酶晶体结构 (pdb:1E6N) 上,显示底物低聚糖(黄色)、选定的重要底物配位残基(棒)和保守的催化残基(红色棒)
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s028
 
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S8 图。
细菌和动质体锥硫酮合酶 (A) 和相关 ERGAD 蛋白 (B) 中催化三联体残基(上图)的结构域结构和 ClustalO 序列比对示意图,表明后者可能作为水解酶无活性。AlphaFold的结构模型预测了来自婴儿利什曼原虫(A4I1M7_LEIIN,小麦)的ER驻留谷胱甘肽酰亚胺酰胺结构域蛋白(下图),叠加在利什曼原虫主要双功能锥虫合酶-酰胺酶蛋白(pdb:2VPS,红色)的酰胺酶催化位点。这些假定的靶向内质网动质体蛋白缺乏Cys氨基酸,使它们作为水解酶无活性,这与它们密切相关的细胞质同源物不同。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s029
 
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S9 图。
当前研究中确定的动质体躯干的两个同源亚家族的 ATP 结合口袋的 ClustalO 序列比对(上图)。更传统的躯干(缺乏KDEL样基序)和含有ER牵连的动质体ATP酶(ERIKA)的保留信号都保留了完整的ATP酶催化位点。超保守的ATP配位残基(也存在于人类躯干中)以红色突出显示。AlphaFold 的 ATP 酶催化位点的结构模型(下图)预测了含有动质体特异性 torsin 旁系同源物 ERIKA(A4HU03_LEIIN,ER 牵连的动质体 ATP 酶)的婴儿利什曼原虫 ER 保留信号。超保守的残基显示为红色棒状,而其他重要的ATP配位残基也以棒状表示。ATP的位置是通过叠加到人Torsin 1A(pdb:5J1S)的晶体结构上推断出来的。完美的ATP配位意味着一种活性酶。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s030
 
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S10 图。 AlphaFold的结构模型预测了来自婴儿利什曼原虫(A4I008_LEIIN,橙色)的ER驻留希瓦氏菌样磷酸酶(SHELP)叠加在希瓦氏菌属细菌(pdb:2Z72,浅蓝色)磷酸酶晶体结构的催化位点。
所有金属离子配位和其他催化位点残基都完全保守,这意味着存在活性酶。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s031
 
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S11 图。 动质体中基于 ATG8/ATG12 家族蛋白的 ClustalO 树。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s032
 
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S12 图。 利什曼尼科典型和非典型ATF8家族蛋白的表面保守性分析(同一蛋白的正面和背面)。
残留物的着色反映了 ClustalO 使用的对齐符号。保守(相同)区域以红色显示。推定的蛋白质-蛋白质相互作用表面表示在每种蛋白质上,而 +++ 符号表示每个非典型 ATG8 亚家族中最保守的表面。括号中的数字表示用于对齐的不相同序列的数量。这些结构是 AlphaFold2 预测的婴儿利什曼原虫蛋白,(A4HYJ2_LEIIN、E9AH00_LEIIN、A4HTT6_LEIIN、A4HYA4_LEIIN、E9AGS4_LEIIN),可从 EBI 网站访问(与主图 3 相同)
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s033
 
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S13 图。 围绕保守的 ATG8 结合 LIR 基序的动质体 ATG2 蛋白序列的 ClustalO 排列(上图)。
为了说明保守性,秀丽隐杆线虫基序(保守至人类 ATG2A 和 ATG2B)作为参考。某些物种缺乏完美的对齐可能是由于周围序列的保守性非常低。LIR 基序位于蛋白质的无序环上,如 AlphaFold2 模型所示(下图)。婴儿利什曼原虫 ATG8 与 ATG2 肽的 AlphaFold2 多聚体模型结构也显示出优异的表面相容性。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s034
 
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S14 图 来自 Discoba(动质体及其亲属)的 ATG3 蛋白序列的 ClustalO 比对围绕着保守但非典型的 ATG8 结合 LIR 基序,以及仅在动质体之外保守的 ATG12 结合 AIM12 基序。
人类蛋白质在对齐中显示以说明保护。该复合物的 AlphaFold2 多聚体建模结构如下所示。非典型 LIR 基序位于适合婴儿利什曼原虫 ATG8 表面的环上。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s035
 
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S15 图。 来自 Discoba(动质体及其亲属)的 ATG4 (ATG4.2) 蛋白序列的 ClustalO 排列和频率标志,围绕保守的 ATG8 结合 LIR 基序。
该基序在某些动质体属(锥虫属和博多盐属)中变成了非典型(可能是反向)变体,但在其他属中保留了其原始形式。多个人类、酵母和拟南芥参考序列说明了保护性。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s036
 
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S1 材料。 S 材料包括补充图、用于筛选利什曼原虫蛋白质组中正则表达式定义的 LIR/KDEL 基序的脚本、用于筛选由正则表达式定义的 LIR/KDEL 基序的 Web 服务器;KDEL 受体和 ER 驻留蛋白和 ATG8 家族蛋白比对的鉴定。
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s037
 
(PDF格式)
 
S1 结构。 SRP54信号肽模型:signal_*_lei.pdb。signal_*_sc.pdb。
L infantum KDEL 模型的最佳能量 HADDOCK 结构:KDEL-best-HADDOCK-run-01.pdb。ATG8-ATG2 肽复合物的 AlphaFold2 多聚体输出:Lei-ATG2pep-ATG8.pdb。ATG8-ATG3 复合物的 AlphaFold2 多聚体输出:Lei-ATG-3ATG8.pdb。用于 ATG8-ATG4 复合物的 AlphaFold2 多聚体输出:LeiATG41ATG8C.pdb。LeiATG42ATG8.pdb. 以 L infantum ATG8 蛋白为模型的同源理想化 LIR 肽:Lei-ATG8-LIR-best-model.pdb。
 
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1011902.s038
 
(邮编)
 
确认
我们向ELM资源的贡献者表示感谢。我们还要感谢 Jesús Alvarado-Valverde、Renato Alves、Zsofia E. Kalman 和 Manjeet Kumar 在这项工作的早期阶段进行的讨论。
 
引用
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