医学论文发表-细胞器锚定蛋白通过线粒体发挥作用，以极化轴突生长以响应

 

内森·菲舍尔，弗拉迪斯拉夫·弗里德曼，米格尔·马丁内斯-雷耶斯，郝红艳，塔姆吉德·乔杜里，丹尼尔·斯塔尔，克里斯托弗·奎因

发布时间：2022 年 11 月 21 日

 

 

抽象

巨型KASH蛋白家族，包括C。秀丽隐杆线虫ANC-1 和哺乳动物 Nesprin-1 和 -2 参与细胞器锚定，并与多种神经发育障碍有关，包括自闭症、双相情感障碍和精神分裂症。然而，人们对这些蛋白质如何在神经元中发挥作用知之甚少。此外，细胞器锚定在轴突发育中的作用知之甚少。在这里，我们报告说ANC-1与SLT-1细胞外引导提示一起作用，以极化ALM轴突生长。ANC-1的这一作用特定于其较长的ANC-1A和ANC-1C亚型，这表明它在机械上与先前描述的ANC-1角色不同。我们发现ANC-1是线粒体簇定位到近端轴突基部所必需的。此外，遗传学和药理学研究表明，ANC-1与线粒体一起促进ALM轴突生长的极化。这些观察揭示了一种机制，其中ANC-1通过线粒体起作用，以极化轴突生长以响应SLT-1。

 

作者摘要

大脑由神经元网络组成，每个神经元延伸一个与其他神经元建立连接的轴突。这些轴突连接的改变被认为会导致脑部疾病，如自闭症、双相情感障碍和精神分裂症。线粒体的改变会增加这些疾病的风险，线粒体是神经元内的一种细胞器，是产生促进轴突连接正常发育的能量和信号所必需的。虽然线粒体对正常轴突发育至关重要，但介导轴突内线粒体正确定位和功能的机制尚不清楚。在这里，我们确定了一种促进线粒体正确定位到轴突基部的蛋白质。这种蛋白质的破坏会导致线粒体定位缺陷，并导致轴突发育缺陷。这种蛋白质的人类同系物的改变与脑部疾病有关，这表明这些疾病如何产生的可能解释。

 

引文：Fischer NC， 弗里德曼 V， 马丁内斯-雷耶斯 MA， Hao H， 乔杜里 TA， 斯塔尔 DA， 等人. （2022） ANC-1 （Nesprin-1/2） 细胞器锚定蛋白通过线粒体发挥作用，以极化轴突生长以响应 SLT-1。公共科学图书馆基因18（11）： e1010521. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521

 

编辑 器：Anne C. Hart，布朗大学，美国

 

收到：6月 6， 2022;接受：11月 11， 2022;发表：11月 21， 2022

 

版权所有：© 2022 菲舍尔等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

 

数据可用性：所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。

 

资金：这项工作由国家心理健康研究所拨款R01MH119157（CCQ）和国家普通医学科学研究所R35GM134859（DAS）资助。本文不代表美国国立卫生研究院的官方观点，作者对其内容承担全部责任。额外的资金来自威斯康星大学密尔沃基分校（UWM）向CCQ提供的研究增长计划赠款#101X356。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。

 

竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。

 

介绍

巨型蛋白质家族，包括哺乳动物Nesprin-1和-2（由SYNE1和SYNE2基因编码），C。秀丽隐杆线虫ANC-1和果蝇MSP-300的定义是包含一个N端肌动蛋白结合结构域、一个与光谱蛋白相关的长中央结构域和一个将蛋白质靶向外核膜的C端KASH结构域[1]。SYNE1的变异与神经发育、神经精神和神经退行性疾病有关。例如，SYNE1基因与自闭症有关，大规模测序研究在该基因中发现了几种与自闭症相关的从头变异[2-6]。同样，对一个近亲家庭的遗传分析确定了SYNE1中的纯合突变，该突变是自闭症的致病因素[7]。此外，全基因组关联研究还确定了SYNE1中与精神分裂症、双相情感障碍和重性抑郁相关的风险等位基因[8-10]。此外，SYNE1纯合子蛋白截短突变是隐性共济失调的常见病因，可导致小脑变性、神经肌肉变性和智力障碍[11-13]。尽管它们在神经系统疾病中发挥了广泛的作用，但神经元中巨型Nesprin蛋白的机制仍然知之甚少。

 

Nesprin-1和-2蛋白家族最容易理解的功能发生在核外膜，它们的管腔KASH结构域与内核膜中的SUN蛋白相互作用，形成横跨核膜的桥梁，称为LINC（核骨架和细胞骨架的连接子）复合物[1，14-17]。巨型雀巢的细胞质结构域与细胞骨架相互作用，以促进核锚定或核运动。例如，ANC-1是C的皮下细胞中的核锚定所必需的。秀丽隐杆线虫[16，18]。同样，在肌肉细胞中，Nesprin-1和-2促进神经肌肉接头处的细胞核聚集[19]。ANC-1还可以通过调节基因表达来调节蛋白质稳态[20]。在神经元内，Nesprin-1和-2调节促进神经发生和神经元迁移的运动间核运动[21，22]。此外，在C中。秀丽隐杆线虫神经元ANC-1与SUN蛋白UNC-84一起调节轴突终止和突触发生[23]。

 

巨型Nesprin蛋白家族的一个不太为人所知的方面是其锚定ER和线粒体的非核功能，其独立于SUN（UNC-84）蛋白发生。例如，C中的突变。秀丽隐杆线虫ANC-1导致错位的ER和线粒体在C的皮下细胞中自由漂浮。秀丽隐杆线虫[18]。然而，锚定ER或线粒体不需要UNC-84[18]。在果蝇和C的肌肉细胞中也进行了类似的观察。秀丽隐杆线虫[16，24，25]。与这些发现一致，巨型Nesprin家族的成员已被定位于ER和线粒体[18，26，27]。尽管有这些初步发现，但巨型Nesprin家族的非核功能仍然相对未被探索。此外，非核功能尚未在神经元中进行研究。

 

线粒体参与神经元发育的几个方面，包括极性的建立、轴突生长、分支形成和生长锥转向[28，29]。然而，调节线粒体以促进发育的机制知之甚少。了解这一过程的一个关键方面是确定线粒体如何定位到神经元内的正确位置，以促进特定的神经发育步骤。例如，在近端轴突基部观察到一簇不动的线粒体，需要这簇线粒体来建立神经元极性[30，31]。然而，导致线粒体定位到近端轴突基部的机制尚不清楚。

 

在这里，我们报道了ANC-1在SLT-1信号通路中起作用，以促进ALM神经元中轴突生长的极化。我们发现ANC-1促进线粒体定位到近端轴突的基部，ANC-1与线粒体一起极化轴突生长。对亚型特异性突变的分析表明，ANC-1的轴突生长极化活性是由更长的ANC-1A和ANC-1C亚型介导的。与这些观察结果一致，我们发现ANC-1A和ANC-1C在ALM中富集，而在ALM中未检测到较短的ANC-1B亚型。相比之下，先前的研究表明，ANC-1在细胞核锚定中的作用是由较短的ANC-1B亚型介导的。总之，这些观察结果支持一个模型，其中SLT-1细胞外线索与ANC-1一起通过将线粒体募集到近端轴突的底部来极化轴突生长。

 

结果

UNC-6 和 SLT-1 细胞外引导线索极化 ALM 轴突生长

C.秀丽隐杆线虫ALM机械感觉神经元可以作为研究轴突生长两极分化的机制的模型。ALM通常从其前侧延伸单个轴突。然而，偏振成分的缺失导致多极表型，其中第二个过程从ALM的后侧生长。例如，卷曲受体或细胞外Wnt配体的缺失会在ALM中产生多极表型[32，33]。ALM还被用于研究其他几种受体、通道和细胞内信号蛋白，这些受体、通道和细胞内信号蛋白可以使轴突生长极化[34-41]。

 

为了进一步探索极化轴突生长的机制，我们试图确定可以极化ALM轴突生长的其他细胞外线索。我们认为UNC-6和SLT-1是候选者，因为已知两者都会影响神经元极性的各个方面[41-48]。在这些实验中，我们分析了unc-6和slt-1的零突变体中的ALM轴突生长。在野生型中，ALM轴突生长几乎总是极化，使得单个轴突从细胞体的前侧生长（图1A和1C）。在slt-1（eh15）null突变体中，我们发现第二个过程从ALM的后部生长，外显率为18%（图1B和1C）。我们在unc-6（ev400）null突变体中发现了类似的表型，尽管外显率要低得多。为了测试SLT-1受体SAX-3的作用，我们使用了sax-3（ky123）null突变。我们发现sax-3（ky123）空突变体表现出 ALM 轴突极性缺陷，其外显率与slt-1（eh15）突变体相似（图 1C）。为了解决SLT-1和UNC-6在ALM轴突生长极化中的关系，我们分析了unc-6（ev400）; slt-1（eh15）双突变体。我们发现UNC-6（ev400）; SLT-1（EH15）双突变体中轴突极性缺陷的外显率与SLT-1（EH15）单突变体中轴突极性缺陷的外显率没有显著差异（图1C），表明unc-6和slt-1不能平行地极化ALM轴突生长。

 

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图1.ANC-1与SLT-1一起作用，以极化ALM轴突生长。

 

（一）野生型ALM神经元的例子，具有从细胞体前侧生长的单个过程。（二）anc-1突变ALM神经元中多极缺陷的示例，第二个过程从细胞体的后侧生长（箭头）。（三）ALM轴突极性缺陷的量化。对双突变体的分析表明，anc-1和slt-1在遗传途径中共同起作用，以极化ALM轴突生长。此外，ANC-1与unc-6并行作用，使ALM轴突生长极化。ALM神经元使用编码Pmec-7：：rfp的jsIs973转基因在L4雌雄同体中进行分析。N>198适用于所有基因型。单个条形上方的星号表示相对于野生型对照、比例的“N-1”卡方检验（*p = .041， **p < .01， ****p < .0001）在统计上显著差异。括号上方的星号表示相对于野生型对照的统计学显着差异，比例的“N-1”卡方检验（**p < .01星号）。误差线表示比例的标准误差。前方在左边。比例尺为 5 μm。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.g001

 

ANC-1在SLT-1信号通路中起作用，以极化ALM轴突生长

我们使用候选方法来了解有关轴突生长极化的机制的更多信息。我们认为ANC-1是候选者，因为它的人类同系物与神经发育和神经退行性疾病有关，但对其在神经元中的功能知之甚少。为了破坏ANC-1功能，我们测试了ANC-1（e1873）空突变，我们称之为anc-1（Q1363*）（图2A）。我们发现anc-1（Q1363*）突变导致ALM神经元中的多极表型，表明需要ANC-1来极化ALM轴突生长（图1C）。为了证实这些结果，我们还使用了anc-1（oxTi902）null突变，这是将eft-3：：gfp转基因插入到anc-1的5'末端，预计会破坏anc-1功能（图2A）[49]。我们发现anc-1（oxTi902）也会导致ALM中的多极表型（图2B）。这些结果揭示了ANC-1在促进ALM轴突生长极性方面的新功能。

 

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图2.ANC-1A和ANC-1C亚型是ANC-1基因轴突生长极化活性所必需的。

 

（一）ANC-1A，ANC-1B和ANC-1C蛋白的示意图。W621*突变去除了ANC-1A和ANC-1C的功能，oxTi902和Q1363*突变去除了所有三种亚型的功能。（二）ALM轴突极性缺陷的量化。ANC-1A和ANC-1C亚型是ALM轴突生长极化所必需的。ALM神经元在L4雌雄同体中使用编码Pmec-7：：gfp的muIs32转基因进行分析。N>194适用于所有基因型。星号表示相对于野生类型的比例“N-1”卡方检验在统计上的显著差异（***p = .007，****p < .0001）。误差线表示比例的标准误差。anc-1（W621*） 是 ANC-1（GK109018[W621*]）; anc-1（ΔCH-GFP）is anc-1（yc41[Δch：：gfp3xFLAG：：anc-1]）; anc-1（ΔF0）是 anc-1（syb5659）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.g002

 

为了进一步探索ANC-1在轴突生长极化中的作用，我们询问它是否在UNC-6或SLT-1信号通路中起作用。为了测试ANC-1在SLT-1信号通路中的作用，我们分析了ANC-1（oxTi902）;slt-1（eh15）双零突变体（图1C）。我们发现ANC-1（oxTi902）中ALM极性缺陷的外显率;SLT-1（EH15）双突变体与ANC-1（OXTi902）或SLT-1（EH15）单突变体无显著差异。这一观察结果表明，ANC-1和slt-1在共同的遗传途径中起作用，并且与SLT-1信号通路中ANC-1的功能一致。为了测试ANC-1在UNC-6信号通路中的作用，我们分析了ANC-1（oxTi902）;unc-6（ev400）双零突变体（图1C）。我们发现ANC-1（oxTi902）中ALM极性缺陷的外显率;unc-6（ev400）双突变体在ANC-1（oxTi902）和unc-6（ev400）单突变体中显著大于ALM极性缺陷的外显率。综上所述，这些观察结果支持ANC-1与SLT-1一起极化ALM轴突生长的观点。此外，UNC-6还可能通过可能独立于ANC-1的机制促进ALM轴突生长的极化。

 

ANC-1的轴突生长极化功能由其ANC-1A和ANC-1C亚型介导

anc-1基因表达为至少三种不同的蛋白质亚型（图2A）。ANC-1A 和 ANC-1C 亚型包括一个 N 末端延伸，其中包含两个钙蛋白同源 （CH） 结构域和三个光谱样重复序列。另一方面，ANC-1B亚型缺乏这种N末端延伸。先前的工作发现ANC-1B亚型足以介导ANC-1在皮下细胞核锚定中的作用[18]。然而，ANC-1A和ANC-1C亚型的作用以前尚未得到证实。我们使用两个突变来测试ANC-1A和ANC-1C在神经元极化中的作用。首先，我们测试了anc-1（gk109018）等位基因，我们称之为anc-1（W621*）。这种ANC-1（W621*）突变在W621处引入了终止密码子，导致ANC-1A和ANC-1C亚型提前终止，同时保留了ANC-1B亚型（图2A）[18]。我们发现ANC-1（W621*）突变引起ALM极性缺陷，其外显率与anc-1（oxTi902）空等位基因相似（图2B），表明ANC-1A和ANC-1C亚型是ANC-1基因神经元极化活性所必需的。我们还测试了第二个突变anc-1（yc41），我们称之为anc-1（ΔCH-GFP）（见图3H）。这种ANC-1（ΔCH-GFP）突变删除了ANC-1A和ANC-1C的CH结构域，并用GFP替换它们，同时保留了ANC-1B亚型[18]。我们发现anc-1（ΔCH-GFP）也引起ALM多极表型，其外显率与在anc-1无效等位基因中观察到的相似。综上所述，这些观察结果揭示了ANC-1A和ANC-1C在轴突生长极化中的作用。

 

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图3.ANC-1A和ANC-1C富集在触觉受体神经元中，并定位在近端轴突的基部。

 

（一）ANC-1ΔCH-GFP（ANC-1A和ANC-1C的标志物）在ALM神经元中的表达。（二）ANC-1ΔCH-GFP在PLM神经元中的表达。另请参阅S1图，了解与触摸受体神经元标记的共定位。（三）Scarlet：：ANC-1A在ALM（红色圆圈）和AVM（黄色圆圈）中的表达。在接缝细胞中也可见表达（见箭头）。（四）猩红色：：ANC-1A 在 PLM 中的表达（蓝色圆圈）。（五）Scarlet：：ANC-1C在ALM（红色圆圈）和AVM（黄色圆圈）中的表达。（六）猩红色：：ANC-1C 在 PLM 中的表达（蓝色圆圈）。（七）ANC-1通过分裂的GFP可视化。ANC-1蛋白用2XGFP11内源性标记，GFP1-10由转基因表达（Pmec-4：：gfp1-10）。（八）ANC-1突变形式的示意图。前方在左边。刻度条为5μm。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.g003

 

ANC-1A和ANC-1C位于ALM神经元的近端轴突和细胞体的基部

为了研究ANC-1a和ANC-1c的表达模式，我们研究了表达ANC-1ΔCH-GFP蛋白的anc-1（yc41）突变体中的GFP表达，其中ANC-1A和ANC-1C的CH结构域被GFP取代（图3H）。我们发现ANC-1ΔCH-GFP蛋白富集在触摸受体神经元（ALM，PLM，AVM和PVM）中（图3A，3B和S1）。此外，我们还观察到性腺内的表达（图3B）。为了证实这些发现，我们使用CRISPR创建了anc-1基因的两个内源性标记版本。anc-1（syb5433）等位基因表达N末端标记的ANC-1A（Scarlet：：ANC-1A），anc-1（syb5416）表达N末端标记的ANC-1C（Scarlet：：ANC-1C）。虽然这些蛋白质的表达不如ANC-1ΔCH-GFP蛋白，但我们发现Scarlet：：ANC-1A（图3C和3D）和Scarlet：：ANC-1C（图3E和3F）都富集在触摸受体神经元中。我们还在接缝细胞中发现了Scarlet：：ANC1A的表达（图3C）。综上所述，这些结果表明ANC-1A和ANC-1C的表达在触摸受体神经元中富集。

 

在发现ANC-1A和ANC-1C在触觉受体神经元中表达后，我们想知道ANC-1B是否也在这些神经元中表达。为了解决这个问题，我们使用了anc-1（yc93）突变[18]。这种突变内源性地用GFP标记ANC-1的所有三种亚型，但也将终止密码子引入ANC-1a和ANC-1c中，从而允许观察GFP：：ANC-1B表达。我们无法在ALM神经元中检测到GFP：：ANC-1B（S2图），这表明ALM仅表达ANC-1A和ANC-1C。

 

为了在ALM内特异性地观察ANC-1的亚细胞定位，我们使用了分裂的GFP方法[50]。我们使用CRISPR / Cas9创建ANC-1（yc112[2xgfp11]），表达ANC-1蛋白，其中2XGFP11片段内源插入ANC-1B的N末端和ANC-1A残基995的所有亚型中（ANC-1：：2XGFP11）。我们确定anc-1（yc112[2xgfp11]）等位基因具有功能性，因为它没有引起明显大于野生型对照的ALM轴突极性缺陷（yc112为4.8±3.3%，wt为5.6±1.5%）。然后，我们使用juIs438转基因，它使用mec-4启动子特异性地驱动GFP1-10在触摸受体神经元内的表达[51]，使我们能够可视化ANC-1：：2XGFP11的定位。我们发现ANC-1：：2XGFP11定位于细胞体，并延伸到近端轴突的基部（图3G）。

 

ANC-1A和ANC-1C的缺失会破坏ALM近端轴突中线粒体的定位

先前在培养的哺乳动物神经元中的研究表明，线粒体簇位于近端轴突的基部，并且该簇对轴突极性很重要[30，31]。这些观察结果促使我们问C是否.秀丽隐杆线虫ANC-1可以通过控制线粒体在近端ALM轴突内的定位来极化轴突生长。作为解决这个问题的第一步，我们询问ANC-1是否可以调节近端ALM轴突内线粒体的分布。在几乎所有野生型ALM神经元中，线粒体聚集在近端轴突的基部（图4A和4C）。然而，在anc-1（oxTi902）零突变体中，42%的ALM神经元的近端轴突基部没有线粒体（图4B和4C），表明ANC-1促进近端轴突基部的线粒体聚集。此外，我们还发现，相对于野生型，anc-1（oxTi902）中近端轴突基部线粒体簇的平均长度减小（图4D）。综上所述，这些结果表明ANC-1促进线粒体正确定位到近端ALM轴突的基部。

 

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图4.ANC-1A和ANC-1C促进近端轴突基部线粒体的聚集。

 

（A-B）（A）所示野生型ALM神经元和（B）所示anc-1（oxTi902）空突变体的示例。线粒体显示为红色，并用与TagRFP（MITO：：TagRFP）融合的COX8的线粒体靶向序列标记，该序列由jsIs1073转基因（Pmec-7：：mito：：tagRFP）表达。绿色标签是胞质GFP，用于可视化整个神经元，并由muIs32转基因（Pmec-7：：gfp）表达。比例尺为 5 μm。（三）近端ALM轴突基部线粒体聚集缺陷的定量。N>35适用于所有基因型。星号表示具有统计学意义的差异，比例的“N-1”卡方检验（*p = .016，***p < .001）。误差线表示比例的标准误差。数据显示为SEP±平均值（D）近端轴突底部线粒体簇长度的量化。N>35适用于所有基因型。使用Welch的方差分析和Dunnet的T3多重比较检验比较数据。星号表示具有统计学意义的差异，（*p = .011， **p < .01， ***p < .001， ****p < .0001）。数据显示为平均±SEM（E）近端轴突底部线粒体缺失与ALM轴突极性表型之间的相关性。星号表示具有统计学意义的差异，比例的“N-1”卡方检验 （*p = .017）。数据显示为平均± SEP。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.g004

 

为了解决线粒体定位缺陷与ALM轴突极性破坏之间的关系问题，我们寻找线粒体定位缺陷与轴突极性缺陷之间的相关性。我们发现表现出线粒体定位缺陷的anc-1（oxTi902）突变ALM轴突的ALM轴突外显率比不表现出线粒体定位缺陷的anc-1（oxTi902）突变ALM轴突高约两倍（图4E）。这一观察结果表明，ALM线粒体定位缺陷与ALM轴突极性缺陷之间存在相关性。

 

ANC-1A和ANC-1C都包含一个N端扩展，这是ANC-1B中不存在的（图2A）。这个N端扩展由两个CH域组成，以及一个我们称之为F0域的区域。为了确定线粒体定位到近端轴突基部是否需要ANC-1A和ANC-1C亚型，我们观察了线粒体在ANC-1（W261*）突变体中的定位。anc-1（W621*）突变体在anc-1a和anc-1c亚型中产生过早终止密码子，但不改变较短的anc-1b亚型。我们发现anc-1（W261*）突变导致38%的ALM神经元中线粒体定位到近端轴突基部的失败，这与在anc-1零突变体中观察到的外显率没有显着差异（图4C）。此外，我们还发现，相对于野生型，anc-1（W261*）突变体在近端轴突基部线粒体簇的平均长度减少（图4D）。这些观察表明，ANC-1A和ANC-1C亚型负责近端轴突基部线粒体的聚集。

 

为了研究F0结构域在线粒体定位到近端轴突基部的潜在作用，我们使用了anc-1（syb5659）突变。这种突变在F0结构域中产生帧内缺失，以下称为anc-1（ΔF0）突变。我们发现anc-1（ΔF0）突变导致24%的ALM神经元中线粒体定位到近端轴突基部的失败（图4C）。这种外显率明显小于我们对anc-1（oxTi902）null和anc-1（W621*）等位基因的观察。我们还发现，anc-1（ΔF0）突变导致近端轴突基部线粒体簇相对于野生型的长度减少，小于anc-1（oxTi902）空等位基因和anc-1（W621*）等位基因引起的减少（图4D）。综上所述，这些观察结果支持了F0结构域部分负责ANC-1A和ANC-1C促进线粒体定位到近端轴突基部的能力的观点。然而，我们不能排除ANC-1（ΔF0）突变降低ANC-1A和ANC-1C总体表达水平的可能性。

 

为了研究CH结构域在线粒体定位到近端轴突基部的潜在作用，我们使用anc-1（ΔCH-GFP）突变删除CH结构域并用帧内GFP插入替换它们（图3H）。我们计算了表现出线粒体定位完全丧失到近端轴突基部的ALM轴突的数量，发现anc-1（ΔCH-GFP）突变体和野生型之间没有显着差异（图4C）。然而，当我们测量近端轴突底部线粒体簇的长度时，我们发现anc-1（ΔCH-GFP）突变导致相对于野生型的减少（图4D）。虽然小于野生型，但相对于anc-1（oxTi902）零突变体和anc-1（W621*）突变体，anc-1（ΔCH-GFP）突变体的线粒体簇长度显着更大。综上所述，这些观察结果支持这样一种观点，即CH结构域部分负责ANC-1A和ANC-1C亚型在促进线粒体定位到近端轴突基部中的作用。然而，我们不能排除ANC-1其他结构域的功能可能因ANC-1（ΔCH-GFP）突变体中GFP的存在而间接破坏的可能性。

 

由于我们的结果表明SLT-1与ANC-1在促进ALM轴突生长的极化途径中起作用，我们询问slt-1功能的丧失是否会破坏线粒体向近端轴突基部的定位。我们发现slt-1（eh15）空等位基因不会改变线粒体向近端轴突基部的定位（图4C和4E）。此外，我们发现unc-6（ev400）空等位基因也不会改变线粒体向近端轴突基部的定位（图4C和4E）。这些观察结果可能反映了SLT-1可能影响线粒体活性而不影响其定位的可能性。与这一观点一致，先前的研究表明，各种引导线索可以在不改变线粒体定位的情况下改变线粒体膜电位[52，53]。此外，我们发现用鱼藤酮处理不会改变线粒体向近端轴突基部的定位（图4C和4D），这表明线粒体向近端轴突基部的定位与线粒体膜电位无关。

 

ANC-1与线粒体一起极化轴突生长

先前的工作表明，近端轴突基部的一簇线粒体可以调节哺乳动物神经元的弘-树突极性[30，31]。我们发现ANC-1需要极化轴突生长并将线粒体聚集到近端轴突的基部，这表明ANC-1可以通过线粒体来极化轴突生长。作为研究这一假设的第一步，我们询问是否需要线粒体功能来极化ALM轴突生长。在这个实验中，我们使用亚态性功能丧失突变来部分破坏线粒体功能所需的三个基因的功能。spg-7基因编码一种AAA金属蛋白酶，该酶是组装构成电子传递链的蛋白质复合物所必需的[54]。isp-1基因编码电子传递链复合物III的一个组分，gas-1编码电子传递链复合物I的一个组分[55]。我们发现这三个基因中的任何一个的功能降低都会导致ALM极性缺陷（图5A）。这些观察结果表明，需要正常的线粒体功能来极化ALM轴突生长。

 

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图5.ANC-1与线粒体一起作用，使ALM轴突生长两极化。

 

（一）破坏电子传递链的突变会导致ALM轴突极性缺陷。（二）抗霉素和鱼藤酮对ALM轴突极性的剂量依赖性破坏。（三）抗霉素破坏ALM轴突极性，但不能增强由anc-1（oxTi902）空突变体引起的ALM轴突极性缺陷。（四）鱼藤酮破坏ALM轴突极性，但不能增强由ANC-1，SLT-1或UNC-6中的零突变体引起的ALM轴突极性缺陷。每种浓度为N>196。星号表示具有统计学意义的差异，比例的“N-1”卡方检验（*p < .05，**p < .01）。误差线表示比例的标准误差。比例尺为 5 μm。等位基因是：ANC-1（oxTi902），mcu-1（ju1154），spg-7（ad2249），ISP-1（qm150），gas-1（fc21），unc-6（ev400）和slt-1（eh15）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.g005

 

考虑到线粒体功能是ALM轴突生长极化所必需的，我们接下来询问线粒体是否与ANC-1一起极化ALM轴突生长。如果是这样，我们预计线粒体功能的抑制将无法增强anc-1零突变体背景中的ALM轴突极性缺陷。我们无法获得anc-1和spg-7，gas-1或ISP-1之间的双突变体。作为替代方案，我们通过使用抗霉素抑制电子传递链的复合物III和鱼藤酮来抑制电子传递链的复合物I来破坏线粒体功能。我们发现抗霉素和鱼藤酮都诱导ALM极性缺陷的剂量依赖性增加（图5B）。然而，相对于未经治疗的anc-1无效突变体，用抗霉素治疗anc-1无效突变体未能增强ALM轴突极性缺陷（图5C）。同样，相对于未经治疗的anc-1无效突变体，用鱼藤酮处理anc-1无效突变体也未能增强ALM轴突极性缺陷（图5D）。总之，这些观察结果表明，ANC-1与线粒体一起起作用，以极化ALM轴突生长。

 

我们的结果表明，SLT-1与ANC-1在促进ALM轴突生长的极化途径中起作用。此外，我们的结果还表明ANC-1通过线粒体促进ALM轴突生长的极化。因此，我们假设SLT-1通过线粒体起作用，使ALM轴突生长极化。为了验证这一假设，我们用鱼藤酮处理slt-1（eh15）null突变体。我们发现鱼藤酮处理未能增强slt-1（eh15）空突变体中ALM轴突极性缺陷的外显率（图5D），支持SLT-1通过线粒体极化ALM轴突生长的假设。在类似的实验中，我们还发现鱼藤酮无法增强unc-6（ev400）空突变体的ALM轴突极性缺陷。

 

讨论

线粒体对神经元发育的许多方面都很重要，线粒体功能障碍与神经发育障碍有关。尽管关于调节轴突内线粒体运输的机制已经了解了很多，但对线粒体如何锚定在神经元内的特定位点以及这种锚定如何协调轴突发育的特定方面知之甚少。我们的工作通过确定一种机制来解决这些问题，该机制导致线粒体定位到近端轴突的基部并促进轴突生长的极化。我们的结果表明，ANC-1在SLT-1信号通路中起作用，促进线粒体向近端轴突基部的定位，ANC-1功能的破坏会导致ALM极性缺陷。此外，遗传和药理学实验表明，ANC-1与线粒体一起起作用，以极化ALM轴突生长。这些结果提供了如何调节线粒体定位以促进神经元发育的见解，并提出了一种模型，其中ANC-1通过将线粒体募集到近端轴突的底部来极化轴突生长。

 

ANC-1A 和 ANC-1C 的函数

我们的结果首次鉴定了ANC-1A和ANC-1C的功能。我们报告说，ANC-1A和ANC-1C亚型是ALM轴突生长的极化和线粒体募集到近端轴突基部所必需的。先前的研究表明，ANC-1A和ANC-1C对于将细胞核锚定在皮下细胞中是可有可无的[18]。同样，哺乳动物Nesprin-1的N末端部分（由SYNE1编码）的功能尚未确定，对于小鼠表皮和肌肉的发育是可有可无的[56，57]。然而，Nesprin-2的N端CH结构域是某些类型的肌动蛋白依赖性核迁移所必需的[58，59]。Nesprin-2在神经元中的作用尚不清楚，因为Nesprin-2（由SYNE2编码）对于大鼠大脑中的神经元迁移是可有可无的[60]。此外，SYNE1和SYNE2都与肌肉疾病有关[26]。然而，只有SYNE1与神经系统和神经精神疾病相关[10，13]。

 

ANC-1A 和 ANC-1C 包含不与 ANC-1B 共享的 N 端子扩展。这个N端扩展包括两个钙蛋白同源结构域，后跟一个我们称之为F0结构域的未表征区域。F0结构域以前没有被表征过，它由676个氨基酸组成。有趣的是，F0结构域的前309个氨基酸与哺乳动物Nesprin-1的前三个光谱样重复序列一致（43%相似性和22%同一性）。在光谱超家族中，CH结构域通常与光谱样重复序列相邻[61]。此外，结构研究表明，CH结构域可以与光谱样重复协同作用，介导肌动蛋白结合[62]。因此，我们假设ANC-1A和ANC-1C的CH结构域和F0结构域共同起作用，以促进ALM轴突生长的极化。需要未来的研究来验证和表征这些领域在这一过程中的功能。

 

虽然我们的结果表明ANC-1A / C促进线粒体定位到近端轴突的基部，但他们并没有确定这种情况如何发生的确切机制。一种可能性是CH结构域可以与F0结构域一起发挥作用，以促进近端轴突底部f-肌动蛋白结构的积累。与这一观点一致，先前的工作表明，f-肌动蛋白集中在培养的大鼠皮质神经元的近端轴突中[63]。此外，其他研究表明，f-肌动蛋白对线粒体定位很重要[64]。

 

线粒体在近端轴突基部的作用

我们的研究结果表明，近端轴突底部的线粒体对轴突生长的极化很重要。这一观点得到了我们的观察的支持，即ANC-1与线粒体一起调节轴突生长的极化，并且线粒体定位到近端轴突的基部取决于ANC-1功能。虽然既往研究尚未研究线粒体在轴突生长极化中的作用，但两项研究认为近端轴突基部的线粒体与轴突极性调控有关[30，31]。剩下的一个关键问题是极化是否由近端轴突底部的线粒体引起，或者神经元中其他地方的其他线粒体是否负责。之前的一项研究发现，选择性破坏近端轴突底部的线粒体确实会破坏轴突状极性，尽管程度低于线粒体的整体破坏[31]。

 

ANC-1的线粒体非依赖性作用在轴突生长的极化中

除了与线粒体合作促进轴突生长的极化外，我们的结果表明ANC-1也可能独立于线粒体来极化轴突生长。我们报告说，ANC-1（ΔCH-GFP）突变导致ALM轴突极性缺陷，其外显率等于anc-1（零）等位基因。然而，我们还发现，相对于anc-1无效等位基因，anc-1（ΔCH-GFP）突变对线粒体的影响很小。综上所述，这些观察结果与ANC-1的CH结构域既与线粒体起作用，又独立于线粒体以极化轴突生长的假设一致。另一方面，anc-1（ΔF0）突变导致轴突极性和线粒体定位缺陷与anc-1（null）突变体相似，这表明F0结构域可能在轴突极化中起作用，对线粒体更具特异性。未来的研究可能有助于进一步定义CH和F0结构域在促进轴突生长极化中的作用。

 

SLT-1和UNC-6信号通路在轴突生长极化中的作用

虽然我们的结果表明SLT-1，ANC-1和线粒体共同促进轴突极性，但我们的结果与线性模型不一致。如果SLT-1，ANC-1和线粒体在线性通路中起作用，我们预计SLT-1或ANC-1功能的丧失会破坏线粒体在近端轴突底部的定位。然而，我们发现线粒体定位被ANC-1功能的丧失所破坏，而不是SLT-1功能的丧失。因此，我们提出SLT-1，ANC-1和线粒体在非线性途径中起作用以调节轴突极性（见S3图）。在该模型中，ANC-1调节线粒体向近端轴突基部的定位。我们假设SLT-1不调节线粒体的定位，而是调节线粒体的功能。该模型预测轴突极性需要线粒体在近端轴突基部的正常功能和正常定位，因此与我们的发现一致，即ANC-1和SLT-1中的零突变体不会增强彼此的轴突极性表型。

 

我们无法直接测试SLT-1可以调节线粒体功能的想法。然而，我们发现线粒体功能的药理学破坏无法增强slt-1突变体的轴突极性缺陷。这一观察结果与SLT-1可以通过调节线粒体功能促进轴突极性的观点一致。此外，其他系统的先前研究发现，其他引导线索会影响线粒体膜电位。例如，信号蛋白3A和CSPG可以在不影响线粒体定位的情况下调节线粒体膜电位[52，53]。

 

虽然我们的工作表明SLT-1细胞外线索及其SAX-3受体在轴突生长的极化中的作用，但需要更多的工作来充分了解这种引导线索和受体如何促进极化。例如，我们已经报道SLT-1和SAX-3都促进轴突极性。然而，我们尚未检查SAX-3功能的丧失是否会破坏线粒体定位。我们也没有确定sax-3;anc-1双突变体如何影响轴突极性或线粒体定位。在这方面，我们无法获得这些双突变体，可能是由于sax-3 的强致死表型。事实上，先前的工作表明SLT-1和SAX-3确实具有彼此独立的功能[65-68]，这表明需要进一步研究它们如何相互作用以控制轴突极化。因此，未来的工作可能会扩展我们的发现，以更好地理解SLT-1和SAX-3如何相互作用以控制轴突极性。

 

UNC-6在轴突生长极化中的作用也将是未来研究的一个领域。我们发现unc-6中的零等位基因会导致弱极性表型。此外，这种unc-6零突变增强了anc-1突变背景中的极性缺陷，进一步支持了UNC-6在轴突生长极化中的作用。出乎意料的是，我们还发现unc-6零突变不会增强SLT-1零突变背景中的极性缺陷。这是令人惊讶的，因为先前的工作表明，UNC-6和SLT-1平行地介导AVM和PVM轴突的腹侧引导[45，66，69]。因此，未来的工作将需要了解UNC-6，SLT-1及其受体如何相互作用以极化轴突生长。

 

材料和方法

遗传学

三.秀丽隐杆线虫菌株按照标准程序进行维护。菌株在接种有OP50的NGM板上培养并保持在20°C。 进行标准杂交以获得本研究中使用的一些菌株，并通过PCR和/或测序对蠕虫进行基因分型。本研究中使用的等位基因为：slt-1（eh15），unc-6（ev400），anc-1（oxTi902），anc-1（e1873），anc-1（syb5433），anc-1（syb5416），anc-1（syb5659），anc-1（gk109018[W621*]）; anc-1（yc41[Δch：：gfp3xFLAG：：anc-1]），mcu-1（ju1154），spg-7（AD2249），ISP-1（QM150），GAS-1（FC21），ANC-1（YC93）和ANC-1（YC112）.本研究中使用的转基因是：cueSi31[Pmec-7：：CH：gfp：：tbb-2 3'UTR]，muIs32 [Pmec-7：：gfp]和jsIs973[Pmec-7：：mRFP]，jsIs1073[Pmec-7：：MTS：：TagRFP]。MTS是COX8的线粒体靶向序列。这些等位基因和转基因之前已经描述过，但以下情况除外：

 

ANC-1（氧Ti902）

由Christian Frøkjaer-Jensen生成，并从CGC获得。这个等位基因是由miniMos制造的Peft-3：：gfp的单拷贝插入[49]。将Peft-3：：gfp随机插入anc-1基因中，通过反向PCR和侧翼DNA序列测序确定[49]。

 

CRISPR等位基因由SunyBiotech产生，包括：anc-1（syb5433）：CRISPR / CAS9用于将编码3xFLAG：：Scarlet：：3xGAS的序列插入anc-1基因中，就在ANC-1A的起始密码子之前;ANC-1（syb5416）：CRISPR/CAS9用于将编码3xFLAG：：Scarlet：：3xGAS的序列插入ANC-1基因中，就在ANC-1C的起始密码子之前;ANC-1（SYB5659）：CRISPR/CAS9用于创建删除F0结构域（ANC-1A中的氨基酸#524-931）的帧内缺失。

 

表型分析

为了分析ALM轴突极性缺陷，将L4蠕虫安装在5%琼脂糖载玻片上，并用左旋咪唑麻醉，用40倍物镜观察。如果异位过程长于细胞体的长度，则ALM神经元被评分为具有轴突极性缺陷。ALM神经元用编码Pmec-7：：gfp的muIS32转基因可视化。

 

对于线粒体分析，用左旋咪唑麻醉L4蠕虫，并用盖玻片安装在5%琼脂糖载玻片上。使用jsIs1073转基因在近端ALM中可视化线粒体，并使用60倍使用用于定量的图像使用配备旋转盘共聚焦系统（Crest Optics）和双sCMOS相机（Teledyne Photometrics）的尼康Ti倒置显微镜获取。评估近端ALM轴突中线粒体的最大强度合成图像，以确定近端轴突底部是否存在线粒体簇。ALM神经元根据从体细胞延伸到轴突初始部分的一条狭窄的线粒体条的存在进行二元评分。为了量化这种延伸的长度，斐济的线工具用于测量线粒体簇最远端到缺乏线粒体荧光的躯体内核空间边界的距离（见S4图）。

 

药物治疗

分别在DMSO和乙醇中制备新鲜制备的鱼藤酮和抗肌素储备溶液。将储备溶液用M9缓冲液稀释并涡旋，然后铺展在含有9 mL NGM的平板上。最终板浓度为2 um鱼藤酮（.08% DMSO）和2 um抗霉素（0.16%乙醇）。控制板接受等量的适当车辆稀释在M9中。然后将板用箔纸包裹过夜以均匀扩散，然后涂上65 ul的OP50并使其干燥24小时。然后将四个L4蠕虫放置在每个板上，在L4阶段对其后代的ALM进行ALM极性缺陷筛查。

 

支持信息

ANC-1A和/或ANC-1C在ALM和PLM神经元中表达。

 

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S1 图ANC-1A和/或ANC-1C在ALM和PLM神经元中表达。

为了可视化ANC-1A / C的表达，我们使用了anc-1（yc41）突变。这种突变删除了ANC-1A和ANC-1C的CH结构域，并用GFP取代它们，从而导致ANC-1ΔCH-GFP突变蛋白在正常表达ANC-1A和ANC-1C的细胞中表达。我们还使用Pmec-7：：rfp转基因来标记触摸受体神经元，包括ALM和PLM。我们发现ANC-1ΔCH-GFP在对应于触摸受体神经元的细胞中表达。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.s001

 

（英文）

 

S2 图ANC-1B不在ALM神经元中表达。

为了可视化ANC-1B的表达，我们使用了anc-1（yc93）突变。这种突变在ANC-1B的N末端插入GFP，并将终止密码子插入到ANC-1A和ANC-1C的序列编码中，从而在没有ANC-1A和ANC-1C的情况下引起GFP：：ANC-1B的表达。我们还使用Pmec-7：：rfp转基因来标记触摸受体神经元，包括ALM。我们无法在ALM神经元或任何其他触摸受体神经元中检测到ANC-1B。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.s002

 

（英文）

 

S3 图SLT-1、ANC-1 和线粒体在轴突生长极化中的作用的假设模型。

我们的遗传分析表明，SLT-1和ANC-1在极化轴突生长的途径中起作用。此外，我们的药理实验表明，SLT-1和ANC-1都调节线粒体功能以促进轴突生长的极化。然而，ANC-1功能的丧失会破坏线粒体定位，SLT-1功能的丧失不会破坏线粒体定位。因此，我们得出结论，ANC-1调节线粒体向近端轴突基部的定位（见实心箭头）。我们还假设SLT-1调节线粒体的功能而不影响其定位（见虚线箭头）。该假设预测轴突极化需要线粒体在近端轴突底部的适当功能和定位。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.s003

 

（英文）

 

S4 图测量近端轴突基部线粒体簇的长度。

上图显示了野生型ALM神经元中线粒体簇的示例。下图显示了anc-1（ΔCH-GFP）中线粒体簇的示例。每个线粒体簇的长度是使用斐济的线工具测量的（见材料和方法）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.s004

 

（英文）

 

S1 数据。包含图1–5 数值数据的 Excel 文件。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010521.s005

 

（三十）

 

确认

我们感谢Michael Nonet和Caenorhabditis遗传学中心的菌株。Caenorhabditis遗传学中心由NIH P40 OD010440资助。我们还要感谢克莱尔·德拉科瓦（Claire de la Cova）在成像实验方面的帮助。

 

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