医学论文发表-黑腹果蝇血清素转运蛋白dSERT的突变影响睡眠、求偶和进食行为
伊丽莎白·纳普，安德里亚·凯撒，丽贝卡·阿诺德，莫琳·桑普森，曼努埃拉·鲁珀特，李旭，马修·安德森，希万·博南诺，亨里克·舒尔茨，杰弗里·唐利，大卫·克兰茨
发布时间：2022 年 11 月 21 日
抽象
血清素转运蛋白 （SERT） 调节细胞外血清素水平， 是目前用于治疗抑郁症的大多数药物的靶标.抑制SERT活性影响行为的机制知之甚少。为了在模式生物黑腹果蝇中解决这个问题，我们在果蝇SERT中开发了新的功能丧失突变（dSERT）。以前对苍蝇和哺乳动物的研究已经暗示血清素是睡眠的重要神经调节剂，我们新生成的dSERT突变体显示总睡眠增加和睡眠结构改变，这是通过喂食SSRI西酞普兰来模拟的。白天和夜间睡眠结构的差异以及基因拯救实验出乎意料地表明，不同的血清素能回路可能会调节白天和夜间睡眠。dSERT突变体也显示出交配和食物摄入的缺陷，类似于SSRIs的临床副作用，并且与血清素对D行为的多形性影响一致。黑腹肌。饥饿并没有克服突变体和雄性dSERT突变体的睡眠驱动力，交配的驱动力也未能克服睡眠驱动力。dSERT可用于进一步探索血清素调节睡眠的机制及其与其他复杂行为的相互作用.
作者摘要
许多用于治疗抑郁症和焦虑症的药物通过改变大脑中的血清素水平起作用。果蝇也使用血清素，可以作为研究大脑的模型。我们已经为血清素转运蛋白（SERT）制造了一种苍蝇突变体，它是人类抗抑郁药的目标。突变体睡得更多，吃得更少，下降。这些苍蝇可以用来研究血清素调节睡眠、饮食和性行为的神经元通路，并可能有助于我们了解抗抑郁药的行为影响。
引文：纳普 EM， 凯撒 A， 阿诺德 RC， 桑普森 MM， 鲁珀特 M， 徐 L， 等. （2022）黑腹果蝇血清素转运蛋白dSERT的突变会影响睡眠、求偶和进食行为。公共科学图书馆基因18（11）： e1010289. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289
编辑 器：莱斯利·格里菲斯，布兰代斯大学，美国
收到：6月 9， 2022;接受：11月 8， 2022;发表：11月 21， 2022
版权所有：© 2022 纳普等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性：所有相关数据都在手稿及其支持信息文件中。
资金：这项工作的资金包括R01 MH107390（DEK），R01 MH114017（DEK），加州大学洛杉矶分校抑郁症大挑战赛（DEK）的种子赠款，R01NS105967（JMD），睡眠研究学会基金会（JMD）的早期职业发展奖，人类前沿科学计划（CDA00026-2017-C）（JMD）的职业发展奖，蒂森基金会（HS）和TR 1340的赠款： 摄入行为：体内平衡和奖励（HS）。其他支持包括国家科学基金会GRFP（MMS），加州大学洛杉矶分校Cota-Robles奖学金（MMS），F99 NS113454（MMS）和F32 NS123014（EMK）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益：提交人声明不存在相互竞争的利益。
介绍
睡眠对生存至关重要，从昆虫到哺乳动物在进化上都是保守的[1-5]。睡眠的数量和结构都会影响认知，而人类睡眠中断与神经和精神疾病有关[6-8]。神经调节剂血清素（5-羟色胺，5-HT）是睡眠的关键调节因子，其参与睡眠已有数十年之广[9，10]。先前对脊椎动物的研究表明，5-羟色胺信号传导可以促进觉醒，而矛盾的是，其他研究表明，5-羟色胺是睡眠诱导和维持所必需的[11-15]。负责这些影响的回路和血清素调节睡眠的细胞机制尚不清楚。
二十多年来，D.黑腹肌已被用作研究睡眠[16，17]和血清素[18-22]以及其他神经调节剂[23，24]的模型系统，已被证明在调节睡眠持续时间和质量方面起着重要作用。血清素在促进D睡眠中的作用。黑腹肌已经部分通过喂食前体5-羟色氨酸（5-HTP）[18]或利用突变体进行5-羟色胺限速合成酶色氨酸羟化酶（TRH）[22]。此外，在D中表达的五种5-羟色胺受体中。黑腹肌突变3种（d5-HT1A、d5-HT2B和d5-HT7）突变会破坏睡眠行为，包括总睡眠量、睡眠反弹和/或睡眠结构[18，20，22]。苍蝇中强大的分子遗传工具使睡眠所需的一些结构和细胞得以识别[18，22，25-32]。这些工具有可能进一步剖析特定血清素能回路调节睡眠的机制。
血清素调节飞行中的各种其他行为，包括进食 [33-38] 和性行为 [38-43]。血清素对其他行为影响的一些电路可能由调节睡眠的途径共享。或者，不同行为的血清素能途径可能是分层的或以其他方式相互冲突。这些关系仍然知之甚少。
在哺乳动物和苍蝇中，从细胞外空间清除5-羟色胺的主要机制是通过5-羟色胺转运蛋白（SERT）的再摄取，该转运蛋白定位于5-羟色胺能神经元的质膜[44]。阻断SERT活性会增加可用于神经传递的血清素的量。它是目前大多数抑郁症和焦虑症治疗的主要靶标，包括广泛处方的选择性5-羟色胺能再摄取抑制剂（SSRIs）[45]。除了治疗效果外，SSRIs还可以显著影响各种其他生理功能和行为，如进食、和睡眠[46-49]。与5-羟色胺与睡眠之间的复杂关系一致，SSRIs常对睡眠产生多种多样且有时相互矛盾的缺陷，包括失眠、REM睡眠效率降低和日间嗜睡[11，49，50]。SERT活性的变化影响这些行为的具体电路和机制尚不清楚。
dSERT的亚型相对较弱已有报道[51]。dSERT MiMIC插入位于基因第一个编码外显子上游的第一个内含子内含子内，可将dSERTmRNA表达降低~50%[51]。它对睡眠的潜在影响没有报道，一般来说，很难对非零或至少是强亚态的突变做出确切的结论。
在这项研究中，我们使用P元素切除来产生新的突变等位基因，并发现dSERT是调节睡眠量和结构所必需的。我们的工作进一步阐明了这些dSERT突变体中表现出的睡眠驱动增加如何在由血清素信号传导调节的其他关键行为（包括交配和喂养）的背景下受到影响。我们的数据还表明，dSERT在白天和夜间睡眠中的作用可以通过不同的血清素能回路进行调节。
结果
dSERT的破坏会增加D的睡眠。黑腹肌
为了产生dSERT的新突变等位基因，我们对XP线中的转座元件使用了不精确的切除。编号： d04388（BDSC #85438）。为了确保一致的遗传背景，XP编号： d04388首先被超越为W1118和w1118作为我们初始检测的主要对照。XP中P元素的近端编号： d04388是dSERT预测转录起始位点的514 bp 5'（图1A）。我们筛选了P元件中白色微型基因的缺失，并恢复了1121bp和1178bp的两个不精确的切除等位基因，我们将其命名为dSERT。10和dSERT16分别（图1A）。两个dSERT10和dSERT16删除dSERT的第一个非编码外显子和第一个内含子。我们确定了另外两条线作为对照;dSERT1包含 41 个额外的碱基，这些碱基是前 P 元素插入的残余物，但不会破坏 dSERT 基因和dSERT4在前P元素插入位点没有可检测到的基因组改变。
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图1.dSERT不精确的切除等位基因。
（A）dSERT基因示意图：灰色和蓝色框分别表示非编码外显子和编码外显子。删除 dSERT10和dSERT16苍蝇用红色虚线表示。（B）对由整只雄性果蝇合成的cDNA进行qRT-PCR，并使用普遍表达的核糖体RNARplP0作为参考。突变体中dSERT的基因表达标准化为对照，+1表示w中的表达1118.dSERT转录本水平在dSERT 中显著下调10（0.01±0.02） 和dSERT16（0.001±0.003） 与对照组相比。误差线表示 SD. P***≤0.001，学生 t 检验。（C）蛋白质印迹分析显示，在~65kD处代表dSERT的条带在两个突变体中强度降低。肌动蛋白被用作加载对照，并且在基因型之间没有差异（未显示）。（D） 每小时睡眠轨迹（以 w 为单位）1118（黑色）dSERT10（橙色）和dSERT16（红色）纯合子。（睡眠跟踪显示平均± SEM，n = 每组 31-32 只苍蝇）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.g001
确定dSERT的表达是否在dSERT中被破坏10和dSERT16，我们首先使用qRT-PCR来量化mRNA表达，使用w1118作为控件。在任何一个突变等位基因中都无法检测到dSERT转录本（图1B）。相比之下，先前发表的通过插入MiMIC盒产生的突变等位基因相对于野生型保留了~50%的表达[51]。为了确认这些结果并确定dSERT蛋白是否同样减少，我们使用先前验证的dSERT抗体进行了蛋白质印迹[52]。与w 相比1118控件，两个dSERT10和dSERT16显示dSERT蛋白表达降低（图1C）。目前尚不清楚蛋白质印迹中存在的微弱条带是否代表残留蛋白或非特异性背景，完整的编码序列表明它们可能不是空等位基因。尽管如此，由于它们似乎代表了相对强的亚型，具有无法检测到的mRNA水平，因此我们在行为分析之前进行了分析。
我们分析了dSERT突变体的睡眠，发现两种dSERT10和dSERT16与W相比，突变体的睡眠显着增加1118控制（图1D）。为了确认增加的睡眠表型是dSERT破坏的结果，而不是遗传背景的其他虚假变化，转杂合dSERT突变体（dSERT10/dSERT16）进行了测定，并显示与对照组相比，总睡眠时间显着增加（S1A-S1B图）。与这些发现一致，dSERT16与杂合子dSERT相比，纯合子的总睡眠量也显着增加16苍蝇（S1C-S1D图）。为了确定遗传背景如何影响我们观察到的行为，请在dSERT中睡觉16还与回复体dSERT 进行了比较4对照，其与不精确的切除在同一屏幕中获得，并具有相同的遗传背景。我们还测定了父母P元素线P{XP}d04388（S1E-S1F图）中的睡眠。我们没有发现w之间的睡眠有任何差异1118和dSERT4W之间只有轻微的差异1118和父线，与w 相比，父线显示睡眠略有下降1118.虽然不可能完全排除由遗传背景引起的微妙影响，但这些结果表明，dSERT的破坏是我们在dSERT突变体中观察到的整体睡眠和睡眠驱动增加的主要原因。
dSERT的缺失会显著增加白天和夜间的睡眠，并改变睡眠结构
我们观察到的睡眠表型在dSERT中更强16与dSERT 相比10，因此我们专注于dSERT16用于进一步分析。为了验证表型不是由于在试管的一端（例如，靠近食物来源）花费的时间偏差，也不是由于不能将苍蝇带到试管中线的有限运动，我们使用使用4个独立光束检测运动的监视器重复测定[53]。由于同时评估管内的多个部位的活动，因此多束监测仪可提供更灵敏的测定和更保守的睡眠评估。我们的结果表明，在单波束和多波束监视器中，dSERT16与对照组相比，突变体的总睡眠量显着增加（图2A）。
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图2.dSERT16突变体表现出增加的睡眠行为和睡眠结构的变化。
睡眠分别用单波束和多波束监视器记录。（A） 总睡眠量的量化（以 w 为单位）1118控件（灰色）和dSERT16纯合突变体（红色）。分析白天睡眠（B）和白天发作频率（C）。（D）dSERT中点灯后的延迟显着降低16突变 体。夜间睡眠（E）和夜间发作频率（F）的量化。图表显示了 SEM ±单个数据点和组均值，带有 Tukey 事后检验的双向方差分析，（p≤0.0021**，p≤0.0001****）。单光束与多光束数据的比较显示，图A、B、E没有显著差异;p<0.0332 * 用于面板 C;p<0.0021 ** 用于面板 D;和 p<0.0002 *** 用于面板 F。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.g002
先前的研究表明，刺激氨能通路可以增加修饰并改变可能影响睡眠的其他感觉运动行为[54-56]。因此，我们测试了dSERT突变体中梳理或阴性地理分类是否发生了改变。我们没有发现与对照组在疏导率（S2A图）或dSERT中负地理趋向性性能有任何差异16苍蝇（S2B图）。总体而言，这些发现表明，我们检测到的行为变化代表了dSERT突变体的睡眠增加，而不是由其他胺相关行为的变化引起的伪影。
对白天和夜间睡眠行为的更具体分析表明，dSERT16苍蝇白天睡眠增加（图2B）。与对照组相比，白天的比赛频率增加进一步突出（图2C）。此外，dSERT16突变体在夜间睡眠潜伏期降低（图2D）。夜间睡眠行为分析显示，dSERT16突变体同样表现出夜间睡眠显着增加（图2E），但与白天的行为相反，我们观察到夜间发作频率显着降低（图2F）。计算从清醒状态过渡到睡眠状态的概率P（打瞌睡）和从睡眠状态过渡到清醒状态的概率P（Wake），以进一步分析dSERT突变体中睡眠驱动和唤醒的变化[57]。与对照组相比，两种dSERT突变体均显示P（打瞌睡）（S1H图）显着增加，P（唤醒）减少（S1G图）。总之，这些数据表明，dSERT的中断会导致睡眠显着增加，并改变白天和黑夜的睡眠结构。
为了进一步确认睡眠增加是dSERT功能中断的结果，我们测试了给成年苍蝇喂食SSRI以阻断dSERT活动是否会影响睡眠。w1118喂食SSRI西酞普兰的苍蝇显示出总睡眠的剂量依赖性增加（图3A）。与我们对dSERT突变体的发现一致，在喂食西酞普兰的野生型苍蝇中，白天睡眠（图3C）和夜间睡眠（图3D）均显着增加。我们没有检测到dSERT中睡眠的进一步增加16喂食西酞普兰的突变体（图3B）支持西酞普兰对睡眠的影响是由抑制dSERT介导的观点，而不是虚假的脱靶效应。此外，这些发现表明，成人睡眠的增加可能是由仅在成人中而不是在发育过程中破坏dSERT引起的。然而，需要进一步的实验来确定突变体中是否可能发生额外的，可能更微妙的发育缺陷。
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Fig 3. Wildtype flies fed SSRIs exhibit increased sleep.
(A) Quantification of total sleep in w1118 control flies fed the indicated concentrations of citalopram (0- 6mM). (B) Total sleep in w1118 controls (grey) and dSERT16 mutants (red) fed vehicle (0mM) or citalopram (3 mM). Analysis of daytime sleep (C) versus nighttime sleep (D) for the flies tested in panel A. Graphs show individual datapoints and group means ± SEM. A,C,D one-way ANOVA; B two-way ANOVA, with Tukey post-hoc test (p≤0.0332*, p≤0.0002***, p≤0.0001****).
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.g003
dSERT16 mutants exhibit rhythmic circadian behaviors
除睡眠外，哺乳动物的5-羟色胺能途径也与昼夜节律的调节有关[58]。为了研究dSERT活性在维持昼夜节律中的可能作用，我们分析了dSERT中的昼夜节律运动行为16突变 体。控制和dSERT16突变体表现出稳健的运动节律，在12h/12h光/暗（LD）循环中具有双峰活性峰值（图4A和4B），其节律行为在自由运行的恒定黑暗（DD）循环中持续存在（图4E和4F）。dSERT的平均活性16清醒时的苍蝇（活动计数/清醒时间）与LD（图4C）和DD（图4G）中的对照苍蝇没有差异。此外，dSERT16突变体在LD（图4D）或DD（图4H）周期的早晨或晚上预期行为均未显着降低。周期图分析证实dSERT16突变体的行为与野生型对照没有区别（图4I和4J），自由运行的昼夜节律行为的量化表明，所有dSERT16苍蝇（tau=23.6±0.04）的节奏（图4K）与对照苍蝇（tau=23.5±0.01）相似。此外，dSERT的昼夜节律周期16突变体与对照图4L没有检测到差异）。总之，我们发现dSERT的缺失不会检测到昼夜节律的破坏。这些数据与先前的工作一致，表明喂食5-羟色胺前体5-HTP或SSRI氟西汀（百忧解），或d5-HT1B的过表达在自由奔跑条件下未检测到改变昼夜节律[19]。
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图4.dSERT16突变体表现出有节奏的昼夜节律行为。
（A-B） 12h：12h LD 和 （E-F） 12h：12h DD 运动活动组分析1118（A，E）和dSERT16（B，F）苍蝇。直方图表示24小时内的活动分布，三天的平均值，苍蝇数量以C，D，G，H表示.较亮和较暗的条表示昼和夜相，分别有0900个灯亮和2100个灯关闭，每列代表0.5小时的平均分箱活动，n = 25-29只苍蝇。每列上方的小点表示 SEM。 （C，G）dSERT 中清醒时的平均活动16突变体与 LD （C） 和 DD （G） 周期、单个数据点和组均值± SEM 中的对照没有什么不同。 学生的t检验，双尾未配对。（D， H）dSERT早晚预期指数的计算16并控制LD（D）和DD（H）循环中的苍蝇。（一至日）从个体的活动记录中得出的代表性周期图1118（一）和16（J）在持续的黑暗中飞行。（K）计算对照和dSERT的具有可检测节律性的苍蝇百分比16.（L）DD中的昼夜节律周期由每个基因型的节律性苍蝇平均，误差线表示SEM。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.g004
dSERT突变体中的性别依赖效应
我们所有的初始实验都分析了交配雌性的睡眠。男性和女性表现出不同的睡眠模式，男性表现出更明显的白天午睡[59，60]。此外，女性的交配后反应包括白天睡眠减少[61]。因此，我们比较了dSERT对雄配雌性和处女雌性的影响（S3图）。与交配雌性类似，与对照组相比，dSERT突变雄性和处女的总睡眠（S3A图）、日间睡眠（S3B图）和夜间睡眠（S3E图）显着增加。对于所有三组（交配雌性，雄性和处女雌性），我们还检测到与对照组相比，dSERT突变体的潜伏期减少，并且夜间睡眠结构的持续变化，观察到睡眠频率降低。有趣的是，与夜间睡眠架构相比，dSERT 的影响16在白天的建筑在三组之间有所不同;与未在雄性或处女中观察到的对照组相比，交配的dSERT雌性显示出白天发作频率的增加（S3C图）。
失去dSERT会破坏求爱和交配行为
白天睡眠结构中交配雌性和处女之间的差异表明，dSERT可能会影响其他性别依赖行为。因此，我们调查了dSERT是否16突变体可能会表现出求偶和/或交配方面的缺陷，以及这将如何与睡眠相互作用。先前的研究表明，由于求偶活动增加，雄性和雌性苍蝇配对过夜会显着抑制睡眠[62-64]。与这些发现一致，与孤立的雄性或雌性苍蝇或雌性对记录的睡眠相比，野生型雄性和雌性苍蝇共同居住在一起导致夜间睡眠显着减少（图5A）。与对照组相比，当男性和女性dSERT16突变体与单个突变果蝇或雌-雌对相比配对（图5A）。男女配对未能减少dSERT的睡眠16突变体表明，突变体中睡眠驱动力的增加超过了交配驱动力。这些数据还表明，dSERT的缺失可能会降低交配活动的驱动力，但由于这些对是同型突变体或WT，这些数据不能区分dSERT的雄性和/或雌性表型。
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图5.dSERT16突变体在求偶和交配方面表现出缺陷。
（A）男性（蓝色）和女性（红色）夜间睡眠的量化，分别安置在DAMs管中，用于两种对照w1118（开放条形/圆圈）和dSERT16（阴影条/圆圈）。在个人住房2天后，男性 - 女性（紫色）或女性 - 女性（深红色/勃艮第）在DAMs管中配对在一起，并量化夜间睡眠。1118（开放酒吧/圆圈）和dSERT16（阴影条/圆圈）。（B）dSERT夜间睡眠的量化16雄性（蓝色阴影）和雌性（红色阴影）单独饲养或成对男女（紫色阴影），对照雄性与dSERT混合合住16女性（带有红色圆圈的开放灰色条）或dSERT16男性与对照女性（带有蓝色圆圈的开放灰色条）。（C-G）交配对由野生型（WT，Canton-S）雄性（红色）或WT雌性（蓝色）组成，w1118控件（开口条）或dSERT16突变体（阴影条）。（C）在1小时内交配的配对的百分比。平均定向潜伏期（D）和翼鸣（E）的量化。产卵量（F）和产卵后24小时未能孵化的种蛋百分比（G）。所有图形（C除外）都显示均值±SEM。 A-B：单因子方差分析，带Tukey事后检验（p≤0.0002***，p≤0.0001****）;C，费雪精确检验（P****≤0.0001）;D-G，双尾不成对t检验（p≤0.0332*，p≤0.0021**，p≤0.0002***）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.g005
确定dSERT中的交配活性是否降低16突变体是雄性和/或雌性表型，我们将突变的雄性或雌性与异性的野生型苍蝇配对。配对dSERT16与dSERT相比，具有对照男性的突变女性显着减少睡眠16公母耦合。相比之下，我们没有检测到dSERT睡眠减少的统计学意义16雄性与野生型对照雌性偶联（图5B）。这些数据表明，dSERT16男性，但不是女性，表现出性行为缺陷。
为了更直接地测试dSERT突变雄性和/或雌性是否会表现出性别表型，我们测量了交配率（图5C）。我们没有观察到dSERT中交配成功率的显着差异。16雌性与野生型雄性配对时与对照雌性相比。相比之下，当dSERT16雄性与野生型雌性配对，没有一对在标准周期（一小时）内交配，与对照雄性的行为形成鲜明对比，其中95%在同一时间范围内与WT苍蝇交配（图5C）。由于交配和求偶在dSERT雄性中可能受到不同的影响，我们还分析了求偶行为。dSERT16雄性在求偶行为方面表现出显着缺陷，包括开始定向（图5D）和翼鸣（图5E）的延迟增加。
作为对男性性行为的进一步测试，我们测量了与dSERT配对2天的野生型雌性的生殖量16男性。野生型雌性与dSERT配对16雄性产卵率降低（图5F），未受精卵比例增加（图5G）。这些结果表明，虽然dSERT16雄性未能在一小时内交配，在增加的时间段内可能会发生交配，尽管与对照组相比，繁殖力降低。
dSERT的损失会减少食物摄入量
以前的研究表明，饥饿和交配会导致D的睡眠不足。黑腹胃可能是因为在通常被睡眠占据的时期，饥饿会增加寻找食物的动力[65]。因此，我们测试了饥饿是否足以抑制dSERT的睡眠。16突变 体。与之前的研究一致，对照果蝇在琼脂培养基上挨饿时，与基线或恢复日与标准食物的睡眠相比，显着抑制了它们的睡眠（图6A）。令人惊讶的是，饥饿对dSERT的睡眠没有显着影响16突变体（图6A）。我们直接测试了dSERT突变体的喂养，发现饥饿24小时后，dSERT中的食物摄取16与对照组相比显著降低（图6B-6D）。这些结果表明，dSERT的损失不仅可以增强睡眠，还可以减少食物摄入量。
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图6.dSERT16突变体在喂养中表现出缺陷。
（A）野生型w的夜间睡眠量化1118（灰色）和dSERT16（红色）在初始加载到 DAMs 管后 1 天开始的 3 天内。基线（第1天）：苍蝇保持标准食物。饥饿（第2天）：苍蝇转移到琼脂中以剥夺食物。恢复（第3天）：苍蝇转移到新鲜食物中。（乙-四）在饥饿的 dSERT 中，食物摄取显着降低16突变体（红色）与对照组（灰色）相比。（B）通过目视检查腹部染料水平（n = 10组10只苍蝇）计算平均喂养分数。（C）代表性图像描绘了用于测定食物摄取的视觉喂养评分。（D）通过分光光度法定量摄入的蓝色染料（n = 13组10只苍蝇）。饥饿胁迫（E）或干燥应激（F）下的苍蝇存活率。与干燥应激（F）下的对照组（黑色）相比，dSERT突变体（红色）在饥饿应激（E）下的存活率降低，存活率增加（每个基因型和实验n = 100只苍蝇）。图形 （A、B、D） 显示单个数据点和所有显示组均值± SEM。A，双向方差分析，带Tukey事后测试（p≤0.0002***，p≤0.0001****;B-D：双尾不成对t检验（p≤0.0001****）;E-F，对数秩Mantel-Cox检验，（p≤0.0021**，p≤0.0001****）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.g006
饥饿对dSERT突变体睡眠影响的降低可能是由于对饥饿或脱水的抵抗力增加。我们通过在琼脂基质上饲养苍蝇来测定饥饿抗性，发现与对照组相比，dSERT 突变体表现出显着降低的存活概率（图 6E），dSERT突变体达到 50% 的死亡率比对照组早约 15%。为了测试脱水/干燥的效果，我们将苍蝇放在空瓶中（没有食物和水）。与饥饿的影响相反，我们发现dSERT突变体表现出对干燥的抵抗力略有增加，并且比对照组存活~9%（图6F）。
dSERT突变体在饥饿（图6A）或与异性同住（图5A）时睡眠不足也可能是由于觉醒阈值较高。我们比较了睡蝇对dSERT的唤醒性16突变体和控制，在白天和夜间每小时将它们暴露在 5 秒的机械振动中。我们没有发现对照组和dSERT突变体在白天使用刺激（S4A图）或在夜间使用更强刺激（1.0g）进行机械刺激时，唤醒性有任何差异。相比之下，当暴露于不太强烈的振动刺激（0.5 g）时，与对照组相比，dSERT突变体表现出显着降低的唤醒性（S4B图）。这些数据表明，在夜间，dSERT突变体的唤醒阈值有所提高，睡眠强度增加。这种唤醒能力的降低可能导致在饥饿和共同居住条件下缺乏清醒。
dSERT在5-羟色胺能神经元中的转基因表达足以挽救夜间和/或白天睡眠缺陷
进一步确认在dSERT中看到的缺陷16突变体是由于dSERT的损失，我们使用“基因救援”并在dSERT中表达野生型dSERT转基因16背景，主要关注睡眠量的缺陷。虽然飞行中的睡眠通常被视为一种单一行为，但一些基因和环境因素可以优先影响一个阶段[66-69]。编码5-羟色胺生物合成色氨酸羟化酶（TRH）限速酶的基因调控序列已被用于产生多个Gal4系，靶向广泛的5-羟色胺能神经元群[22，70–73]。我们首先使用名为“TPH-Gal4”[71]的广泛血清素能驱动剂来表达UAS-dSERTsert。尽管使用TPH-Gal4表达UAS-dSERT并不能完全逆转整个24-LD周期中总睡眠的增加（图7A），但使用TPH-Gal4表达的dSERT足以将夜间睡眠模式恢复到接近对照水平（图7C）。相比之下，dSERT 中的日间睡眠没有改变16TPH-Gal4>UAS-dSERT（图7B）的突变体。为了扩展我们的分析，我们测试了另一种广泛的血清素能驱动因素TRH-Gal4[70]。虽然TRH-Gal4和TPH-Gal4都包含色氨酸羟化酶基因的片段，但据报道，它们在表达上表现出差异，包括在支配蘑菇体的过程中TRH-Gal4的表达相对较低[38]（另见S5图）。与TPH-GAL4类似，使用TRH-Gal4在dSERT中表达UAS-dSERT并不能完全挽救整个24小时一天的总睡眠水平。16背景（图7D）。然而，与TPH-GAL4相比，TRH-Gal4足以将白天的睡眠水平恢复到对照组的水平（图7E）。此外，与TPH-Gal4不同，TRH-Gal4不能挽救夜间睡眠水平（图7F）。接下来，我们测试了结合血清素能驱动因素是否可以在24小时内完全恢复睡眠水平。我们的结果表明，使用TPH-Gal4和TRH-Gal4在dSERT突变体中表达UAS-dSERT的基因拯救足以将白天和夜间的睡眠水平恢复到对照组的水平（图7G-7I）。总体而言，这些结果表明dSERT中的睡眠缺陷16突变体可以被基因拯救，证实这种表型是由于dSERT基因的破坏。此外，他们认为不同的血清素能回路可以调节白天和晚上的睡眠。
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图 7.同时使用“TPH”-Gal4和TRH-Gal4的dSERT的转基因表达足以挽救dSERT睡眠增加16突变 体。
（A-C）总睡眠 （A）、日间睡眠 （B） 和夜间睡眠 （C） 的量化在对照w1118;TPH-Gal4（灰色），w1118;TPH-Gal4，dSERT16（红色）和w1118;TPH-Gal4，dSERT16;UAS-dSERT（绿色）苍蝇。（D-F）总睡眠 （D）、日间睡眠 （E） 和夜间睡眠 （F） 的量化（以 w 为单位）1118;TRH-Gal4（灰色），w1118;d塞特16;TRH-Gal4（红色）和w1118;d塞特16;TRH-Gal4/UAS-dSERT（绿色）苍蝇。（G-I）总睡眠 （G）、日间睡眠 （H） 和夜间睡眠 （I） 的量化（以w 为单位）1118;TPH-Gal4;TRH-Gal4（灰色），w1118;TPH-Gal4，dSERT16;TRH-Gal4（红色）和w1118;TPH-Gal4，dSERT16;TRH-Gal4/ UAS-dSERT（绿色）苍蝇。图表显示单个数据点和组均值±SEM.单因子方差分析，具有Tukey事后检验（p≤0.0332*，p≤0.0021**，p≤0.0002***，p≤0.0001****）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.g007
讨论
我们发现dSERT作为睡眠的调节剂起作用，dSERT的损失导致白天和夜间睡眠的强劲增加。鉴于dSERT是5-羟色胺从细胞外空间清除的主要机制，dSERT突变体可用于神经传递的5-羟色胺量可能增加。它们的行为与由5-羟色胺能信号传导的其他变化引起的表型一致：喂食5-羟色胺前体5-HTP或在多巴胺能和5-羟色胺能细胞中过表达限速酶TRH[18]（使用Ddc-Gal4）增加总睡眠，类似于dSERT突变体。相反，TRH突变体表现出总睡眠时间的减少[22]。
5-羟色胺也被认为有助于雄性求偶和交配，部分基于对基因无果（fru）的研究[41，74]。男性特异弗鲁M支配生殖器官的腹神经节神经元阳性已被证明是5-羟色胺能的，FRU突变体在求偶和交配事件中表现出缺陷[41，74]。此外，5-羟色胺能神经元的激活会导致男配行为缺陷[38]。相反，另一项研究表明，敲除TRH或沉默5-羟色胺能神经元会导致处女接受能力降低[43]。我们的数据与先前关于5-羟色胺对男性性行为影响的研究结果一致[38]。在雌性中，在5-羟色胺能信号传导降低的苍蝇中观察到接受性降低[43]，而dSERT的缺失预计会增加细胞外5-羟色胺，从而增加5-羟色胺能信号传导。可以想象，dSERT女性可能比WT更容易接受，但我们还没有测试这种可能性。
以前的研究还解决了增加的血清素信号与D的进食行为之间的复杂关系。黑腹肌。使用TPH-Gal4或TRH-Gal4对广泛的5-羟色胺能细胞进行热遗传学去极化可显著减少食物摄入[33，38]。相比之下，特定5-羟色胺能细胞亚群的激活驱动了一种矛盾的行为，并诱导了饱蝇的摄食[33]。5-羟色胺能细胞的广泛活化减少摄食的发现与我们的数据显示全球表达的dSERT突变体表现出摄食行为的显着降低是一致的。测试dSERT的细胞特异性敲低是否可以模拟激活5-羟色胺能神经元亚群的效果将是有趣的[33，38]。
血清素也与肠道和小管（相当于哺乳动物肾脏的苍蝇）的生理功能有关[35，75-78]。例如，外源性向大脑或腹部注射5-羟色胺会改变作物的收缩力[75]。这些影响可能在我们在dSERT突变体中观察到的摄食行为的差异，它们对饥饿的敏感性和/或对干燥的适度抵抗力中发挥作用。与dSERT类似，敲低5-HT1A[37]或5-HT1B[35]可以降低对饥饿的抵抗力，但会增加对干燥的抵抗力。需要进一步的基因实验来确定这些影响是否通过独立的途径发生。我们注意到5-HT1A和5-HT1B在5-羟色胺能神经元以及突触后神经元中表达[79]，因此可能作为自身受体发挥作用。如果是这样，突触前与突触后细胞中受体的敲低可能会产生不同的效果，并且可能分别与dSERT表型相似或相反。
我们的工作表明，dSERT中整体睡眠的增加16突变体是由睡眠结构的至少两种变化介导的，这些变化在白天和夜间之间有所不同。在夜间，dSERT 睡眠增加16苍蝇的特征是发作次数显着减少（合并睡眠），而在白天，睡眠次数增加。此外，与对照组相比，交配的dSERT雌性显示出发作频率的增加，但仅在白天，并且在雄性或处女中未观察到这种影响。性肽还会引起交配雌性白天睡眠的变化[61]，性肽和交配后的反应可能会改变dSERT的影响。
分别通过TPH-Gal4或TRH-Gal4对夜间或白天睡眠的差异救援支持了不同的血清素能回路可能调节夜间和白天睡眠的观点。先前的研究表明，支配MB的背对正中（DPM）神经元中TRH的敲低会导致夜间睡眠减少[21]。虽然对日间睡眠的影响尚不清楚，但d5-HT1A受体突变体在夜间睡眠、夜间回合长度和夜间回合次数增加方面表现出明显的减少，所有这些行为都可以通过在MBs中表达d5-HT1A转基因进行遗传拯救[18]。TPH-GAL4而非TRH-Gal4驱动的UAS-dSERT表达挽救了dSERT的夜间睡眠表型16，TPH-GAL4在MB中的表达可能高于我们研究中使用的TRH-Gal4驱动[20]（S5A-S5B图）。我们推测，在dSERT中看到的夜间睡眠增加和巩固16可能是由MB中细胞外血清素的增加以及MB中5-HT1A活化增加引起的;然而，需要进一步的实验来直接验证这一假设。
我们还推测，白天dSERT睡眠表型的某些方面，例如白天睡眠频率的增加，可能是由椭球体和d5-HT7受体介导的。EB神经元的激活导致睡眠发作次数增加，特别是在白天[20]。d5-HT7突变体和5-HT7拮抗剂治疗同样可降低睡眠发作频率[20]。然而，白天的dSERT睡眠表型也可能依赖于其他回路和/或受体，因为dSERT16表现出在d5-HT7突变体中未检测到的睡眠量增加[20]。
血清素先前已被证明影响哺乳动物的发育 （80，81） 和D.黑腹果[82-91]。有趣的是，自闭症风险基因CHD8突变的患者在睡眠启动和维持方面表现出缺陷，以及D突变。黑腹果蝇直系同源基斯梅特在发育过程中破坏睡眠结构并增加肠道的5-羟色胺标记[92]。在发育过程中观察到的高血清素能状态似乎减少而不是增加睡眠[92]，与大多数报道的5-羟色胺对成蝇的影响相反。dSERT的发育效应可能会影响成人睡眠表型，在未来的实验中，我们将使用发育期间与成年期的遗传拯救来探索这一想法。目前，我们强调我们观察到睡眠的增加与dSERT中看到的表型相当16在将SSRI西酞普兰给药给野生型成虫后。dSERT遮挡药物对睡眠的影响16突变体证实它们是由抑制dSERT而不是非特异性靶标引起的（图3B）。这些数据表明，成人dSERT的抑制足以引起睡眠表型的至少某些方面，但不排除额外甚至相反的发育影响的可能性。
对小鼠的研究强调了血清素对睡眠影响的复杂性。例如，由5-羟色胺能细胞活性增加引起的5-羟色胺能信号传导增加会降低REM睡眠[93-95]，而SERT KO小鼠引起的5-羟色胺水平升高会产生相反的效果并增加REM[96，97]。5-HT1B或5-HT1A的敲除也表现出更多的REM [98，99]，但SERT KO引起的REM增加可以通过5-HT1A的发育阻断来减少[97]。
在人类中，睡眠，抑郁和SSRIs影响之间的复杂关系强调了理解SERT在睡眠中的作用的重要性。人类SERT基因5'侧翼区域的变异与体外SERT表达水平的变化有关[100]，这与SSRIs的疗效[101]和睡眠剥夺[102]有关。除了睡眠，SSRIs还影响其他关键行为，如进食和交配。SSRIs可诱发低吞噬作用并干扰正常进食行为[103-106]，性功能障碍是SSRI治疗的副作用[46，47]。我们的工作开始解决在D的背景下调节这些影响的途径之间的竞争。黑腹肌睡眠，因为我们证明dSERT的丧失会导致睡眠驱动力增加，这似乎超过了正常进食和交配行为的驱动力（图5-6）。我们推测，对dSERT突变体的进一步研究可能有助于揭示调节哺乳动物和苍蝇常见复杂行为（如攻击性）的其他5-羟色胺能途径之间的关系，并可进一步用作SSRIs行为影响的遗传模型[70，107-111]。
材料和方法
苍蝇菌株
在标准玉米面培养基上饲养苍蝇种群（每1升小时20：琼脂12克，红星酵母29克，玉米面71克，糖蜜92克，对羟基苯甲酸甲酯16毫升10%乙醇溶液，10毫升丙酸50%H溶液20）在25°C，60%相对湿度下，并夹带至每天12小时光照，12小时黑暗时间表（12小时：12小时LD）。w1118苍蝇是从亨里克·舒尔茨博士那里获得的。UAS-dSERT（BL24464）和UAS-MCD8：：GFP（BL32185）是从布卢明顿果蝇种群中心获得的。TPH-Gal4是钟钟钟博士[71]的礼物，TRH-Gal4是爱德华·克拉维茨博士的礼物[70]。
P元素诱变
dSERT 等位基因是通过不精确切除P{XP}d04388转座子产生的，该转座子插入第二条染色体上dSERT基因上游的 514 个碱基。首先，将P{XP}d04388线反向交叉五代到w1118Scholz实验室的线，以同质化遗传背景。其次，P{XP}d04388的雌性被杂交到w1118; CYO/+;[Δ2–3;Ki]/TM2雄性。下一个，w1118;P{XP}d04388/CYO;[Δ 2–3;Ki]/+雄性与P{XP}d04388雌配。在下一代中，200只携带P{XP}d04388可能缺失的单只雄性果蝇被杂交到携带基因组病变（包括完整的dSERT基因）的Df（2R）PX2 / CYO雌性。新的dSERT等位基因补充了与缺乏相关的致死性。对F1一代的雄性进行P元素插入缺失的筛查，例如携带CYO染色体的白眼雄性苍蝇。建立了89条生产线作为库存。使用PCR分析新的等位基因的基因组病变。以下引物用于确认病变和扩增DNA以进行测序：5'-TGACCCACTAAATGCCATGA-3'和5'CCAGAAAAAGCGAAATCTGC-3'。
实时定量荧光定量链反应 （qRT-PCR）
使用Trizol分离30只雄性果蝇的总RNA，然后在37°C下进行DNA酶消化30分钟。合成cDNA，SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）和寡核苷酸dT根据制造商的说明使用引物。对于qRT-PCR分析，使用MESA BLUE qPCR MasterMix Plus进行SYBR测定（Eurogentec），以100 ng cDNA为模板。使用iCycler iQ5多色实时荧光定量PCR检测系统进行检测。使用ΔΔCt方法分析数据[112]。NormFinder软件[113]用于对照引物选择。选择以下识别RpLPO的对照引物：5'-CAG CGT GGA AGG CTC AGT A-3'和5'-CAG GCT GGT ACG GAT GTT CT-3'。对于dSERT，使用以下引物识别第三和第四外显子中的序列：5'-GTTGCCTCAGCATCTGGAAG-3'和5'-CAGCCGATAATCGTGTTGTA-3'。数据显示为dSERT相对于对照的倍数变化。
蛋白质印迹分析
为了分离苍蝇头（雄性和雌性）的蛋白质，将500-1000只苍蝇在液氮中冷冻，并用筛子分离头。用无菌杵粉碎头部，并重悬于含有10mM NaCl，25 mM Hepes，pH 7.5，2mM EDTA和1x cOmplete™ Mini蛋白酶抑制剂（Merck）的缓冲液中。将悬浮液在冰上保持10分钟，轻轻混合，然后在4°C下以18300×g离心15分钟。将含有较大膜颗粒和大量dSERT的沉淀重悬于含有10mM NaCl，25 mM Hepes，pH 7.5，1x cOmplete™ Mini蛋白酶抑制剂（Merck）和0.5%CHAPS的缓冲液中，并在4°C下温和混合孵育10分钟。将溶液以3000×g离心5分钟以回收膜提取物。根据标准程序，将每个样品的20 μg蛋白质用于蛋白质印迹。将膜封闭在5%牛奶中，并以1：20 000的稀释度使用主要的兔抗dSERT抗体（Giang等人，2011），小鼠抗β-肌动蛋白（mAbcam 8224）以1：10 000用作上样对照。
行为分析
睡眠：如前所述测量睡眠[114]。简而言之，将3-5天大的交配雌性苍蝇（除非另有说明）单独装入65毫米长的玻璃管中并插入果蝇活动监测器以测量运动活动（Trikinetics公司;美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和至少5分钟的不活动期被归类为睡眠。睡眠时间和结构分别量化为白天（开灯）和夜间（关灯）、Zeitgeber 小时 0 至 12 和 13 至 24。DAM2 用于单波束监视器，DAM5M 用于多光束监视器（每管 4 个独立光束，相邻光束间距为 9.1 mm）。Microsoft Excel中的自定义Visual Basic脚本[114]或MATLAB中的SCAMP分析脚本用于分析睡眠行为的Trikinetics活动记录。
通过将Trikinetics活动监测器固定在涡旋器（VWR）上的微孔板适配器上来测定唤醒阈值。用0.5g或1g力每小时刺激苍蝇5 s，持续24小时。单位 g 用于表示 1 g 等于重力常数的振动幅度。实验进行两次，唤醒率一起平均。
SSRI喂养和睡眠
对于SSRIs的睡眠实验，将苍蝇加载到含有载体或载体中不同浓度的氢溴酸西酞普兰（Sigma PHR1640）（dH中的5%蔗糖，1%琼脂和1%蓝色食用染料）的管中20）并在分析睡眠前喂食20小时。在车辆中使用蓝色食用染料来确保每只苍蝇在最初的20小时内进食。
饥饿
对于3-5天大的饥饿和睡眠实验，交配的雌性被装入带有标准食物的DAMs管中以进行适应。适应 1 天后，测量基线睡眠 24 小时（第 1 天）。在实验日（第2天），将苍蝇转移到ZT7下含有1%琼脂的试管中，使其饥饿17小时。然后将苍蝇转移回ZT0（第3天）含有标准食物的新鲜试管中，并记录24小时恢复期的活动。
合住
对于共同住房睡眠实验，将苍蝇单独装入DAMs管中，并记录基线睡眠2天。在ZT0的实验日，将苍蝇在新的DAMS管中组合成雄性 - 雌性或雌性 - 雌性对（相同基因型或文本中指定的混合），并记录睡眠24小时。
美容
对于梳理实验，使用Dinolite USB摄像机AM7023CT在单独的房间中观察3-5天大的交配雌性。当苍蝇在头部或腹部摩擦腿或将腿摩擦在一起时，就会获得一次梳理活动。对于每只苍蝇，在三个单独的2分钟内分析梳理，并量化为每分钟梳理事件的平均数量。每 2 分钟的评分期通过观察梳理事件开始。
负地理趋向性
对于负地理分类实验，将3组10只3-5天大的苍蝇放置在两个空的28.5 x 95毫米聚苯乙烯小瓶中，这些小瓶的开口端彼此相对，形成一个连续的190毫米空间。连接管的长轴垂直定向在实验室工作台上方。在工作台上轻轻敲击小瓶后，让苍蝇爬升 10 秒。每组的苍蝇数量都攀升到8厘米标记以上（从面向实验室工作台的管底部测量）与保持在8厘米标记以下的苍蝇数量进行评分。每组测试5次（每次试验之间恢复1分钟），并量化五项试验的平均值并用于分析。
运动活动和昼夜节律
对D中3-5日龄的女性进行实验。黑腹肌活动监测器（Trikinetics公司;美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在 12 小时：12 小时 LD 内首次夹带 2-3 天。对于DD分析，从DD的第二天开始分析数据3-6天。 数据分析使用Faas软件1.1（Brandeis Rhythm Package，Michel Boudinot）完成。有节奏的苍蝇由χ2周期图分析具有以下标准：功率≥20，宽度≥2小时，选择24小时±8小时。幂和宽度分别是周期图峰值的高度和宽度，并给出计算周期的显著性。在LD或DD条件下计算3天内清醒时的平均活动（活动计数/清醒时间±SEM）的平均活动。早晨预期指数计算为（开灯前3小时的活动）/（亮灯前6小时的活动），晚间预期指数计算为（熄灯前3小时的活动）/（熄灯前6小时的活动）。
求爱和交配测定
处女雌性以~10为一组，年龄为3-5天，天真的雄性单独老化4天。将一对雌性和雄性苍蝇轻轻吸入定制丙烯酸装置的腔室中，并开始视频录制。测量雄性在1小时内实现交配的百分比，以及从引入室内到雄性展示求偶步骤（包括方向和翅膀伸展）之间的时间。求爱行为分析被盲目评分。
种蛋产蛋和孵化率
将用湿酵母喂养一天的五天大的处女雌性与雄性（5雌性至10只雄性）放在一个瓶子中，在糖蜜盘上产卵2天（每24小时取出和更换一次盘子）。取出糖蜜板后，将它们保存在密封的特百惠器皿中，并在25°C下24小时后，使用解剖显微镜手动计数未孵化的卵的数量。
饲喂试验
将10只3-5天大的苍蝇在1%琼脂培养基上作为水源饥饿24小时。饥饿后，将苍蝇转移到蓝色食物（10%蔗糖，5%活性酵母，1%琼脂和4%蓝色食物染料（McCormick）中，并使其进食15分钟。如前所述，使用目视检查喂养评分或蓝色染料分光光度法测量蓝色食用色素的摄入量[33]。为了目视检查，每只苍蝇的评分为0，定义为腹部没有可见的染料，1表示染料只是作物中的一个小斑点，2表示染料的作物延伸了腹部长度的1/3-2/3，3，腹部肿胀并充满染料。通过平均小瓶中每只苍蝇的喂养分数来量化平均喂养分数。对于蓝色染料的分光光度定量，将10只苍蝇在400μlPBS中匀浆并离心（在环境温度下14，000rpm3分钟）。将250μl上清液吸入新管中，避免沉淀碎片并重新离心（速度，3分钟，温度）。将200μl上清液加载到96孔微孔板中用于吸光度读数（Biotek Synergy 2多模式酶标仪）。如前所述，通过从630nm处的吸光度（蓝色染料峰）中减去750nm处（蓝色染料光谱外）处的吸光度来计算染料的校正吸光度[33]。
干燥和饥饿测定
分离3日龄雌性，并将10人一组置于空小瓶（用于干燥）或含有dH中1%琼脂底物的小瓶中20（表示饥饿）。每6小时目视检查一次苍蝇，并手动计算存活的苍蝇。该测定被指定在每个基因型的最后一只苍蝇死亡时完成。数据显示为活蝇随时间推移的百分比。对于这两个实验，针对每种基因型测定了10组10只苍蝇。
免疫组化
免疫染色按照标准程序进行，包括脑解剖，在3%乙二醛中固定25分钟，在PBTG中封闭（PBS加0.2%Triton，
0.5%BSA和2%正常山羊血清），一抗和二抗染色稀释在PBTG中。使用以下一抗：兔抗GFP（1：500，Invitrogen）和小鼠抗DLG（1：20，4F3 - 发育研究杂交瘤库）。Alexa Fluor 488 和 Alexa Flour 555 山羊二抗（1：500;Invitrogen）用作二抗。
共聚焦图像是使用蔡司LSM 880共聚焦显微镜和Zen软件获得的。
使用斐济/图像J软件处理图像。
统计学
在棱镜9（GraphPad;美国加利福尼亚州圣地亚哥）。使用双尾t检验或单因素或双向方差分析比较组均值，并在适当的情况下重复测量，然后进行Tukey的事后多重比较检验。每个实验的样本量在每个图形面板或相应的图形图例中描述。数据面板中显示的所有组平均值均表示 SEM ±平均值。
支持信息
基因对照，P（打瞌睡）和P（唤醒）。
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苏普莱姆图1.基因控制, P(打盹） 和P(唤醒).每小时睡眠轨迹 （一个） 和总睡眠（B） 中w1118控制（灰色），转杂合子dSERT10/dSERT16突变体（黄色），纯合子dSERT10突变体（橙色），以及纯合子dSERT16突变 体（红色）。每小时睡眠轨迹 （C）和总睡眠的量化（D） 中w1118控制（灰色），dSERT16杂合子（紫色），以及dSERT16纯合子突变体（红色）。每小时睡眠轨迹(E）和总睡眠的量化（F） 中w1118续罗尔斯（灰色），dSERT4 回复（浅蓝色），编号： d04388父母P元素线（蓝绿色），以及dSERT16突变体（红色）。(G-H） 量化P(唤醒) (G） 和 P（打盹) (H）在光照期间（LP,时代精神小时 1-12）和黑暗期（DP,时代精神小时13-24） 中w1118控制（灰色），dSERT10突变体（橙色），以及dSERT16突变体（红色）。对于所有面板，sLEEP 迹线显示 SEM 和 SEM ±平均值直方图显示双单个数据点和组意味着± SEM.单向方差分析与图基帖子-临时测试(p≤0.0332*, p≤0.0021**, p≤0.0002***, p≤0.0001****）. LP和DP分别在G， H.
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S1 图基因对照，P（打瞌睡）和P（唤醒）。
每小时睡眠轨迹 （A） 和总睡眠量 （B） 以w 为单位1118对照（灰色），转杂合子 dSERT10/dSERT16突变体（黄色），纯合子dSERT10突变体（橙色）和纯合子 dSERT16突变体（红色）。每小时睡眠轨迹 （C） 和总睡眠量 （D） 以w 为单位1118控件（灰色），dSERT16杂合子（紫色）和dSERT16纯合突变体（红色）。每小时睡眠轨迹 （E） 和总睡眠量 （F） 以w 为单位1118控件（灰色），dSERT4还原体（浅蓝色）、d04388亲体、P元素线（蓝绿色）和dSERT16突变体（红色）。（G-H）在光照期（LP，Zeitgeber 小时 1-12）和黑暗期（DP，Zeitgeber 小时 13-24）期间 P（唤醒）（G） 和 P（打瞌睡）（H） 的量化w1118控件（灰色），dSERT10突变体（橙色）和dSERT16突变体（红色）。对于所有面板，睡眠轨迹显示 SEM ±平均值，直方图显示 SEM ±单个数据点和组平均值。带Tukey事后检验的单因素方差分析（p≤0.0332*，p≤0.0021**，p≤0.0002***，p≤0.0001****）。LP和DP分别在G，H中进行分析。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.s001
（英文）
S2 图dSERT16突变睡眠表型不是其他胺相关行为的伪影。
（一）dSERT16与W相比，突变体（紫色）在梳理行为方面没有变化1118控件（灰色）。显示了三个独立的 2 分钟周期内每分钟的平均梳理事件数，具有三个实验重复。在每个实验重复中，每个基因型n = 5只苍蝇。平均值± SEM，未配对的学生 t 检验。（B） 男性和女性dSERT16突变体的行为与阴性地质定位测定中的对照苍蝇没有区别。平均± SEM，单向方差分析。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.s002
（英文）
S3 图睡在不同性别和交配状态的dSERT突变体中。
（A） 总睡眠量的量化（以 w 为单位）1118和dSERT16雄性（蓝色）、处女雌性（粉红色）或交配雌性（红色）。分析白天睡眠（B）和白天发作频率（C）和潜伏期（D）。夜间睡眠（E）和夜间回合数（F）的量化。图表显示单个数据点和组均值±SEM。 双向方差分析，带Tukey事后测试（p≤0.0332*，p≤0.0002***，p≤0.0001****）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.s003
（英文）
S4 图dSERT 的唤醒阈值16苍蝇。
w的比例1118（黑色）和dSERT16（红色）苍蝇在白天（A）或夜间（B）进行0.5g或1g振动刺激5秒后醒来（每组n = 24次试验，n = 每组30-32只苍蝇）。平均值± SEM，带Tukey事后检验的双向方差分析（≤0.0021**）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.s004
（英文）
S5 图
（A-B）代表性图片显示了由TRH-Gal4（A）或“TPH”-Gal4（B）驱动的UAS-MCD8：：GFP（绿色）的表达，并在蘑菇体内用DLG（洋红色）抗体标记。蘑菇体叶标有白色文字。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.s005
（英文）
S1 数据。原始数据。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010289.s006
（邮编）
确认
我们感谢钟钟庆博士和爱德华·克拉维茨博士分享飞行线。我们感谢J.D.实验室的Ceazar Nave博士和Prabhjit Singh的技术支持和讨论。我们感谢Tim Lebestky博士和Mikhayla Armstrong博士对dSERT突变体分析的早期贡献。
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