抗毒素Na，K-ATP酶进化的限制对序列分化具有有限的依赖性
沙布纳姆·穆罕默德 ，圣地亚哥·埃雷拉-阿尔瓦雷斯 ，陆洋，玛丽亚·德尔皮拉尔·罗德里格斯-奥尔多涅斯，张凯伦，杰伊·斯托斯，苏珊娜•多布勒，安德鲁·克劳馥，彼得·安多尔法托
出版日期： 2022年08月16日
抽象
越来越多的理论和实验证据表明，分子内上位是蛋白质进化速率和模式的主要决定因素，并对新型蛋白质功能的进化施加了实质性的限制。在这里，我们研究了分子内上位在四足动物对强心子类固醇（CTS）的抵抗力的复发性进化中的作用，这是通过特定的氨基酸取代到na，K-ATP酶（ATP1A）的α亚基家族中发生的。在ATP1A的两个关键位点确定了一系列循环取代后，这些取代预计将在不同的四足动物中赋予CTS耐药性，然后我们进行了蛋白质工程实验，以测试将这些取代引入发散物种背景的功能后果。与之前的结果一致，我们发现这些位点的替代物可能对CTS耐药性产生实质性的背景依赖性影响。然而，在全球范围内，这些取代也具有多效性效应，与加性效应而不是背景依赖效应一致。此外，取代对活性的影响程度并不取决于物种之间ATP1A序列差异的总体程度。我们的结果表明，CTS抗性形式的Na，K-ATP酶进化的上位抑制可能取决于少数位点，而对蛋白质分化的总体水平几乎没有依赖性。我们提出，对有限数量位点的依赖可能是观测到在具有高度发散Na，K-ATPases的分类群中观察到的趋同CTS抗性取代的原因。
作者摘要
蛋白质中的单个氨基酸协同工作以产生功能相干的结构，该结构必须随着蛋白质随着时间的推移而发散而维持。鉴于这种结构 - 功能关系，我们预计新突变的影响将取决于整个蛋白质中其他位点的氨基酸状态（即背景依赖性），并且相同的突变将在更密切相关的物种中产生更相似的效果，而直系同源蛋白质的分化程度将较低。我们通过对ATP1A进行蛋白质工程实验来测试这一假设，ATP1A是一种介导对称为强心子类固醇（CTS）的毒素的抗性的蛋白质，以揭示代表性四足动物之间背景依赖的程度。我们发现，虽然与CTS耐药性有关的两个关键位点的突变效应确实通常是背景依赖性的，但这些效应的大小与ATP1A分化的总体水平无关。相反，我们的研究结果表明，背景依赖性效应是由整个蛋白质中少数位点的氨基酸状态决定的。相对较少的位点施加的进化限制可以解释高度发散动物的ATP1A蛋白中经常发生相同或相似的CTS抗性替代。
引文： Mohammadi S， Herrera-Álvarez S， Yang L， Rodríguez-Ordoñez MdP， Zhang K， Storz JF， et al. （2022） 抗毒素Na，K-ATP酶进化的约束对序列发散的依赖性有限。PLoS Genet 18（8）：e1010323。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323
编辑 器： Harmit S. Malik，Fred Hutchinson癌症研究中心，美国
收到： 三月 31， 2022;接受： 七月 4， 2022;发表： 八月 16， 2022
版权所有： © 2022 Mohammadi等人。这是一篇根据知识共享署名许可条款分发的开放获取文章，允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原作者和来源。
数据可用性： 本研究期间生成的数据可作为补充数据集，并通过“方法”部分中提供的数据存储库链接提供。本研究中使用的质粒已沉积到Addgene（参见S3表的名称和Addgene ID号）。本研究中使用和生成的序列的加入号在 S2 数据集中可用。
资金： 这项研究由美国国立卫生研究院（R01-GM115523），JFS（R01-HL087216）和SM（F32-HL149172），国家科学基金会向JFS（OIA-1736249），Deutsche Forschungsgemeinschaft to SD（Do 517/10-1）以及Alexander von Humboldt基金会，Humboldt研究奖学金计划资助。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
竞争利益： 作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
平行和收敛（以下简称“收敛”）进化的实例代表了一种有用的范式，可用于检查限制适应速度的因素以及适应性进化路径可预测的程度[1，2]。动物对强心肌类固醇（CTS）的抗性进化代表了收敛分子进化的最明显的例子之一。CTS是一个多样化的有毒化合物家族，具有相似的结构，可特异性抑制Na，K-ATP酶（NKA，图1A），这种蛋白质在维持膜电位方面起着关键作用，因此对于维持动物的许多生理过程和信号通路至关重要[3]。CTS通过与蛋白质α亚基（ATP1A）的高度保守结构域结合并阻断Na和K离子的交换来抑制NKA功能[3]。许多植物和动物群体已经独立进化出自生产生CTS的能力，分别用于防御食草和捕食[4]。同样，以产生CTS的分类群为食的食草动物和捕食者也必须进化出机制来规避CTS的毒性作用，并经常螯合CTS用于自身防御[5-11]。因此，NKA通常是CTS抗性在广泛分化物种之间趋同进化的目标。++
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图 1. Na，K-ATP酶结构与脊椎动物ATP1A副群的系统发育关系.
（A）Na，K-ATP酶（NKA）的晶体结构与蓝色的代表性CTS布法林结合（PDB 4RES）。放大的面板显示了H1-H2细胞外环，突出显示了两个氨基酸位置（红色的111和122），它们反复与CTS耐药性有关。在图3中，我们强调了与CTS耐药性相关的H1-H2细胞外环中氨基酸取代位点的氨基酸置换收敛的关键例子。（B）脊椎动物ATP1A副群与昆虫ATPα的系统发育关系。++
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.g001
适应性蛋白进化中的趋同模式受突变靶标大小（即潜在适应性突变的数量）、多向性程度（即给定突变对多种表型的影响）和上位（即同一蛋白质突变位点之间的非增进相互作用）的影响[12-20]].如果突变的表型和适应性效应取决于它们产生的蛋白质序列背景（即存在分子内上位），则预计给定的突变在来自密切相关物种的同源物中具有更相似的表型和适应性效应。因此，随着不同物种直系蛋白质之间序列分歧的增加，收敛取代的概率有望降低。与这一期望一致，在线粒体[21]和核[22，23]蛋白的大规模系统发育比较中观察到这种下降。虽然这些结果表明，上位是趋同蛋白质进化模式的重要全球决定因素，但缺乏将这些大规模观察与单个蛋白质水平的功能数据联系起来的研究。
对果蝇ATP1A同源物[24，25]和新热带草蛙[26]中两个关键位点（111和122）的CTS抗性赋予取代的功能研究揭示了对蛋白质功能的相关负多效性效应，并表明蛋白质中其他位点的进化减轻了这些有害作用。鉴于这些多效性和上位约束，奇怪的是，在高度发散物种的ATP1A同源物中经常观察到收敛的CTS抗性取代。由于比较功能数据有限，对ATP1A介导的CTS耐药性的多效性和上位性约束的普遍性，特别是对进化距离的预测依赖性，仍然知之甚少。
为了更清楚地了解CTS抗性取代的系统发育分布，需要在脊椎动物中对ATP1A进行更完整和一致的采样。脊椎动物中广泛的系统发育比较主要集中在ATP1A的H1-H2细胞外环上，它仅代表CTS结合结构域的一个子集。此外，大多数脊椎动物具有3种ATP1A副结构，它们具有不同的组织特异性表达谱，并且与不同的生理作用相关（图1B）[3，27]。先前关于脊椎动物分类群ATP1A副群的研究集中在爬行动物中的ATP1A3[8，9，28，29]、鸟类和哺乳动物的ATP1A1和/或ATP1A2[10，29]，以及两栖动物的ATP1A1或ATP1A3[11，29]。因此，我们缺乏对脊椎动物ATP1A蛋白家族氨基酸变异的全面和系统的调查。
为了弥合这一差距，我们首先调查了三个NKA α亚基副群（ATP1A1，ATP1A2，ATP1A3）的近全长编码序列的变化，这些变异在主要的现存四足动物群（哺乳动物，鸟类，非鸟类爬行动物和两栖动物）中共享，并确定了在发散谱系中反复发生的替换。如果这些取代的表型效应取决于整个蛋白质中大量位点的状态，我们预计相同的取代应该对更高度发散的蛋白质产生越来越明显的影响。我们专注于与动物CTS耐药性有关的两个关键位点（111和122），测试了这些位点的替代是否对更不同的遗传背景具有越来越明显的表型效应。具体而言，我们在ATP1A1的111和122位点设计了几种常见的替换，这些位点在物种之间有所不同，以揭示潜在的“隐性”上位[17，30]。通过量化这些取代在不同背景上赋予的CTS抗性水平，以及它们对酶功能的多效性作用，我们评估了整体蛋白质序列背景在多大程度上限制了CTS抗性形式的ATP1A1在四足动物中的进化。
结果
ATP1A序列跨物种和副系的进化模式
为了更全面地了解四足动物之间ATP1A氨基酸的变化，我们为脊椎动物之间共享的三个ATP1A副类群创建了近全长ATP1A蛋白的多个序列比对。除了公开数据外，我们还为27种非鸟类爬行动物（PRJNA754197）（S1和S2表）生成了新的RNA-seq数据。然后，我们使用这些转录本从头开始组装所有ATP1A副造影物的全长转录本，并生成18种anuran物种的新RNA-seq数据[26]（PRJNA627222），以实现这些组的更好代表性。该数据集总共包括ATP1A1的429种，ATP1A2的197种和ATP1A3的204种（总共831个序列，包括新生成的数据;S1 数据集和 S1 图）。
我们的调查揭示了与NKA的CTS抗性有关的位点的许多替代（图2和S2数据集;有关与昆虫的比较，请参阅参考文献[24]的补充文件1）。正如昆虫全长序列的研究所预期的那样[5，6，24]，物种和副系之间的大多数氨基酸变异集中在H1-H2细胞外环中（残基111-122;图1A）。尽管在先前与CTS耐药性有关的43个位点中仅包含28%[31]，但H1-H2细胞外环包含3个ATP1A副原体中鉴定的所有替代物的81.4%（S2图）。
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图 2. 四足动物之间共享的ATP1A副群的α（H1-H2）细胞外环中的分子进化模式。
（A）四足类ATP1A1，（B）ATP1A2和（C）ATP1A3的最大似然系统发育。NKA蛋白H1-H2环内和附近与CTS耐药性相关的八个位点的特征状态显示在节点尖端。黄色内部节点表示重建的祖先序列，以推断跨分支的衍生氨基酸状态，以简化可视化;重建的节点：哺乳动物，爬行动物和两栖动物的最近共同祖先（MRCA）。右上，每个半圆表示在主系统发育中映射的位点，三个黄色节点中每个节点都有推断的祖先氨基酸状态（后验概率>0.8）。在ATP1A1中，119位点被推断为两栖动物和哺乳动物的Q119，爬行动物的N119（S6表）;在ATP1A2-3站点中，119被推断为两栖动物和爬行动物的A119，哺乳动物的S119（S6表）。站点编号对应于猪（Sus scrofa）参考序列。与其他副词相比，ATP1A1中替代物的数量和变化较高。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.g002
我们的调查揭示了几种分支和副词特定的模式。值得注意的是，ATP1A1在CTS耐药性相关的位点的物种之间表现出更多的变异（图2）。这些位点的ATP1A2的大部分变异仅限于鳞状爬行动物，而ATP1A3在位点122处完全缺乏替代，尽管众所周知，该位点的替代可能赋予CTS耐药性[26，32]。纵观物种和副群，第111和122位点的收敛程度是显着的（图2和3）：例如，替代Q111E，Q111T，Q111H，Q111L和Q111V都同时发生在昆虫和脊椎动物的多个物种中。N122H和N122D也经常在这两个主要分支中并联出现。在这些部位，CTS敏感性（即Q111和N122）与CTS耐药状态的频繁融合已被解释为这些取代的适应性意义的证据[5，6，8，11]，但也可能反映突变偏倚[33]和物理化学约束的性质[22，34]。
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图 3. 昆虫ATPα1和四足动物共享ATP1A副群的CTS抗性取代的平行和发散模式。
昆虫之间ATPα1收敛的例子（A）。（B）ATP1A1，（C）ATP1A2和（D）ATP1A3 paralogs在四足动物中的收敛。数字表示所描述的每个主要分支中独立替换的数量。对于ATP1A3，在位点120而不是122处发现了赋予抗性的氨基酸取代。氨基酸替代的完整列表可以在四足动物的S2数据集中找到，而Taverner等人[24]则可以找到昆虫。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.g003
相比之下，一些趋同仅限于特定的分支：例如，Q111R在四足动物中平行发生，但在昆虫中尚未观察到。同样，组合Q111R + N122D在四足动物的ATP1A1中独立进化了三次，但在昆虫中没有观察到。相反，昆虫已经独立进化了四次Q111V + N122H，但这种组合从未在四足动物中观察到。对这些谱系特异性模式的一种解释是，一些CTS抗性替代的适应性效应取决于遗传背景（即上位约束），结果是CTS抗性通过不同谱系中的不同突变途径进化而来。
除了在位点111和122上已知的CTS抗性替代之外，一些分类群已经进化出其他途径来实现CTS耐药性。例如，已知Ceratophyrs属的角蛙捕食含有CTS的蟾蜍[35]，并且它们的ATP1A1在121站点具有已知的CTS抗性替代（D121N，S2数据集）。这种替代在脊椎动物中很少见，但先前在适应CTS的乳草虫中已有报道[5，6]。同样，在ATP1A1中观察到已知的CTS抗性替代C104Y在Thamnophis属的吊袜带蛇（S2数据集）和CTS适应乳草象鼻虫中[6]。Histricognathi啮齿动物，包括栗鼠（Chinchilla lanigera）和黄喉沙鸡（Pterocles gutturalis）在H1-H2细胞外环中表现出明显的单氨基酸插入，这一特征先前与pyrgomorphid蚱蜢的CTS抗性有关[31，36]。此外，为了代替位点122的变异，四足动物的ATP1A3在位点120处具有频繁的收敛替换（G120R，另见[8]）。有趣的是，该位点还显示了鸟类ATP1A1副群中实质性的收敛取代（其中N120K独立发生八次），但在其他四足动物的ATP1A1中大多是不变的。
位点 111 和 122 处的 CTS 替代的上下文相关抗性
上文概述的ATP1A副群之间的分支和副群特异性替换模式表明，CTS耐药性的演变可能高度依赖于序列背景。然而，绝大多数这些取代对它们发生的不同遗传背景的功能影响在很大程度上仍然是未知的[26，28，32]。鉴于位点111和122处收敛取代的多样性和广泛的系统发育分布，以及其中一些取代对CTS耐药性的记录影响，我们通过实验测试了这些位点取代的功能效应在多大程度上是背景依赖性的。
我们将功能实验集中在ATP1A1上，因为它是表达最普遍的副群，并且表现出最多的序列多样性和最广泛的收敛取代的系统发育分布。具体而言，我们考虑了来自九种代表性四足动物物种的ATP1A1同源物，这些物种在111和122处具有不同的野生型氨基酸组合（图4A）。我们的分类群采样包括两只蜥蜴，两条蛇，两只鸟，两种哺乳动物，以及以前发表的一种两栖动物的数据（S3和S4无花果和S3表）。四足动物111和122位点的祖先氨基酸状态分别为Q和N，NKA对CTS的耐药程度可以量化为CTS浓度，其中酶活性降低到50%（又名IC50).我们发现，位置111和122处的派生状态数之和是CTS电阻水平的强预测因子（图4B，IC50， 斯皮尔曼的 rS= 0.85， p = 0.001）。尽管如此，我们还发现，在111和122处具有相同配对状态的酶中，CTS耐药性的变化大于10倍（例如，比较毛丝鼠（CHI）与红颈龙骨蛇（KEE）或比较大鼠（RAT）与草蛙的抗性副群（GRAR)). These differences suggest that substitutions at other sites also contribute to CTS resistance.
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图 4. 野生型和工程ATP1A1的功能特性。
（A） 与被调查物种有关的分支图。GRA： 草蛙 （Leptodactylus）;RAT： Rat （Rattus）;CHI： 栗鼠 （栗鼠）;OST： 鸵鸟 （斯特鲁西奥）;SNG： 沙鸡 （翼龙）;MON： 巨蜥（Varanus）;TEG：特古蜥蜴（Tupinambis）;FER： 假 fer-de-lance （Xenodon）;KEE：红颈龙骨蛇（Rhabdophis）。每个头像下方的两个字母代码分别表示位点111和122处的天然氨基酸状态。来自Mohammadi等人的草蛙数据[26]。（B） CTS 电阻水平 （IC）50）在野生型酶中。x 轴区分 ATP1A1，在位点 111 和 122 处具有 0、1 或 2 个派生状态。下标 S 和 R 分别指 CTS 敏感和 CTS 抗性副词。（C） 对CTS电阻（IC）的影响50） 将替换数更改为 111 或 122。替换导致可预测的电阻变化，除了沙鸡（SNG）中的反转R111Q。（D） CTS耐药性（IC）的上位证据50）和（E）缺乏对酶活性的这种影响。每个彩色箭头比较在至少两个背景上测试的相同替换（或反向替换）。较粗的线对应于具有显着序列上下文相关效应的替换（Bonferroni校正方差分析p值<0.05，S5表）。虚线箭头对应于反向替换。（F）单一取代对Na，K-ATP酶（NKA）活性的影响。将每个改良的ATP1A1与该物种的野生型酶进行比较。插图显示所有 15 个替换项的 t 检验 p 值的分布，虚线表示零期望值。在所有情况下，误差线对应于三个重复的标准误差。对于面板 B、C、D 和 E，对数据点应用抖动以简化可视化。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.g004
为了测试111位点和122位点常见CTS抗性取代的上位效应，我们使用定点诱变在9个物种的野生型ATP1A1背景中引入15个取代（9个在111位置，6个在位置122）（S3图）。选择的具体取代物要么是系统发育上广泛分布的趋同取代和/或区分密切相关的物种分支的发散取代。我们用适当的物种特异性ATP1B1蛋白表达这24种ATP1A1构建体中的每一种（S3表和S4和S5 Figs）。对于每种重组NKA蛋白复合物，我们表征了其CTS耐药性水平（IC50）和估计的酶活性作为在没有CTS的情况下ATP水解速率（S4表）。
在IC的12个案例中50可以测量，替换平均具有15倍的影响（图4C和S4表），并且同样可能增加或减少IC50.为了评估特定取代的背景依赖性，我们研究了五种情况，其中给定的取代（例如，E111H）或反向取代（例如，H111E）可以在两个或多个背景上进行评估。在没有分子内上位的情况下，取代对不同背景的影响应保持不变，反向取代的影响幅度也应相同但具有相反的符号。该分析揭示了IC对背景的实质性依赖性50 in three of the five informative cases (Fig 4D and S5 Table). In one case, the N122D substitution resulted in a 200-fold larger increase in IC50 when added to the chinchilla (CHI) background compared to the grass frog (GRAS） 背景 （p = 1.2e-3 by 方差分析）。在其他情况下，当将其添加到不同的背景（假铁线（FER）和红颈龙骨（KEE）蛇时，E111H取代和反向取代（H111E）在相同的方向上产生效果（降低CTS抗性），p = 1e-7 by ANOVA）。在第三种情况下，H122D取代导致IC大幅下降。50当添加到假德兰斯（FER）背景时，但反向置换（D122H）在添加到大鼠背景时没有效果（RAT;p = 2.5e-4通过方差分析）。总体而言，这些结果表明，给定的替代物对IC的影响50可以强烈依赖于它发生的背景。其余两个替代物（H111T和Q111R）对IC的影响幅度没有显着变化。50当被引入不同物种的背景时。这些结果表明，虽然一些取代可能具有很强的背景依赖性效应，但相对于CTS耐药性，强烈的分子内上位并不是普遍的。
NKA活性的多向性效应在很大程度上取决于一小部分地点的状态
接下来，我们测试了位点111和122的取代是否对ATP酶活性具有多效性作用。由于离子跨膜的转运是NKA的主要功能，其破坏可能产生严重的病理作用[37]，因此损害该功能的突变可能处于强纯化选择之下。正如先前的工作[24-26]所表明的那样，111和122位点的CTS抗性取代会降低酶活性。我们通过比较15种突变NKA蛋白的酶活性与其相应的野生型蛋白，在更广泛的系统发育尺度上评估了这些效应的普遍性。
有趣的是，野生型酶本身表现出从3-18 nmol / mg * min的活性显着变化（p = 6e-7通过方差分析，图4E和S4表）。尽管如此，我们发现CTS耐药性水平与野生型酶之间的活性水平之间没有显着关系（Spearman's rS= -0.32， P = 0.4）。平均而言，在发散的直系蛋白质背景上位点111和122的取代使酶活性改变了60%（绝对变化的平均值;图4D和S4）。在两种情况下，位置122（N122H和H122D）的氨基酸取代几乎使蜥蜴NCA失活，并且在一种情况下，位置111（Q111T）的取代导致重组蛋白在转染细胞中的低表达（S4和S5 Figs）。跨替换的成对 t 检验 p 值的均匀性的检验表明，低 p 值显著富集（图 4D 插图;p = 2.5e-4，均匀性的卡方检验）。因此，在全球范围内，这组取代对NKA活性有显着影响，但令人惊讶的是，它们不太可能比增加活性更可能减少（10降低：5增加，p>0.3，二项式检验，图4D和S4表）。
接下来，我们询问111和122位CTS耐药性取代的多效性效应在多大程度上取决于遗传背景。这个问题的动机是最近对昆虫的研究，这些研究表明，在111和122号位点一些抗性赋予替代的有害多效性效应是背景依赖性的[24，25]。同样，最近关于食蟾蜍草蛙ATP1A1的研究显示，Q111R和N122D对NKA活性的影响也是背景依赖性的[26]。相比之下，在我们在两个或多个背景上比较相同替换（或反向替换）的五种信息性案例中，没有证据表明背景依赖性（图4E和S5表）。例如，N122D对草蛙（GRAS）和栗鼠（CHI），尽管物种的蛋白质之间存在显着差异（8.4%的蛋白质序列差异）。同样，Q111R在鸵鸟（OST）中的作用或沙鸡中反向取代R111Q（SNG）的影响与Q111R在草蛙中的作用没有显着差异（GRAS;分别为7.5%和8%的蛋白质序列分歧）。重要的是，在我们的工程结构中，我们还发现取代增加抵抗力的程度与它们对NKA活性的影响之间没有显着的相关性（Spearman's rS= 0.42， P = 0.2）。这表明CTS耐药性水平与活性水平之间没有明显的直接联系，并且活性差异更有可能取决于产生耐药性替代的遗传背景。
为了进一步检查背景依赖性的证据，我们测试了在111和122处对相同氨基酸状态（无论起始状态如何）的变化是否会产生不同的NKA活性变化（例如，大鼠背景上的R111E与假铁去矛背景上的H111E）。如果上位是普遍的，涉及大量位点，我们预计，随着野生型ATP1A1蛋白序列分化的增加，对给定氨基酸状态的取代作用的绝对差异应该会增加。11种可能的比较揭示了对蛋白质活性影响的绝对差异的实质性差异，范围从8%到190%（S7表）。尽管如此，我们发现相同状态的取代效果的差异与直系蛋白质之间的氨基酸差异程度之间没有关系（图5A）。这种模式表明，虽然多效性效应可能普遍存在，并且可能与背景相关[24，26]，但这些效应与整体序列发散无关。
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图 5. 少数位点占相同取代对发散ATP1A1背景的多效性效应差异的很大一部分。
（A）突变在两个不同背景上对给定状态的影响大小差异作为所有位点发散的函数。每个点代表给定氨基酸状态（例如，122D）在两种不同遗传背景上的影响（相对于野生型酶的活性变化百分比变化）之间的比较。例如，122D在栗鼠和假费德兰斯之间的效应测量为|Δ%[栗鼠与栗鼠+N122D]减去Δ%[假除矛与假除矛+H122D]|。比较被测量为两种效应之间的差异。x轴表示正在比较的两种野生型ATP1A1蛋白（即背景）之间的氨基酸差异数。假设蛋白质功能的分子内上位普遍存在，则预测存在正相关关系。总共有11个比较是可能的，并且在考虑所有站点的差异时没有观察到显着的相关性。（B）突变在两个不同背景上对给定状态的影响大小的差异，作为16个位点子集的发散函数，对两个背景之间的活性差异影响最大。相关性的 p 值是通过构造之间的置换效应和生成相关性的零分布来确定的。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.g005
我们假设背景依赖效应可能取决于少数部位的状态。如果是这样，使用完全背离可能会掩盖这些位点的功能效应和背离之间的关系。为了验证这一假设，我们使用方差分析来询问我们功能结构中的哪些变体位点最能解释不同背景上的影响差异（材料和方法以及S6图）。在24组变异位点（分组为皮尔逊r>0.8）中，我们发现两组包括113个变异位点中的16个。这两组16个位点共同占构造比较方差的78%（p<0.004通过排列）。此外，与使用所有变体位点观察到的模式（图5A）相比，我们发现取代效果的差异与这16个位点的分歧程度之间存在很强的正相关关系（图5B;皮尔逊 r = 0.78， p = 0.003 通过排列;S8 和 S9 表）。该分析强烈支持了背景相关效应取决于有限数量的位点的概念。虽然我们的分辨率是有限的（由于实验中遗传背景的数量有限），但我们可以说16个或更少的位点解释了替代对不同背景的影响差异的很大一部分。
对ATP1A序列的全局分析揭示了CTS耐药性进化的进一步限制
由于我们的功能实验必然在范围上受到限制，因此我们进行了广泛的系统发育分析，以评估我们的发现与ATP1A家族超越ATP1A1和CTS耐药性相关的位点以外的ATP1A家族收敛速率的全球估计值的一致性。使用831 ATP1A蛋白序列的多序列比对，包括四足动物（即两栖动物，非鸟类爬行动物，鸟类和哺乳动物）之间共享的三个ATP1A副群，我们推断出基因家族的最大可能性系统发育（S1图）。然后，我们使用祖先序列重建来推断树中所有分支上替代事件的历史，并计算整个蛋白质中每个位点的收敛氨基酸取代次数（参见材料和方法）。收敛取代被定义为同一位点的两个分支上的取代，导致相同的氨基酸状态。有趣的是，我们没有检测到收敛替换的相对数量与整个树中ATP1A的整体发散之间的相关性（S7图）。当仅考虑关键的CTS抗性位点111和122的替代时，这一结果也成立（S8图）。
为了进一步了解决定ATP1A收敛进化的因素，我们通过提取每个收敛替换并可视化其沿序列发散轴的分布，更仔细地研究了位点111和122处的单个收敛取代的模式（图6A）。由于普遍的上位，收敛速率应趋于降低，这是序列发散的函数，因此沿序列发散轴的成对收敛事件的分布应向左偏斜，峰值应朝向较低的序列发散。与此预期相反，分布是双峰的，一个峰值在0.33，另一个峰值在0.69个替换/位点（图6B底板）。收敛取代几乎在整个蛋白质发散估计范围内都发生了。例如，如果 X 是任何起始状态，则替换 X111R 在 13 个四足谱系中独立发生，X111L 在 20 个谱系中独立发生。这两种取代物都具有广泛的系统发育分布，这表明它们的作用并不强烈依赖于整个蛋白质中大量位点的序列状态。然而，有趣的是，X111H和X111E取代的分布相对左偏斜，符合我们在H111E / E111H实验中观察到的CTS抗性的上位（图4E）。
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图 6.
收敛和氨基酸共变异的系统发育模式（A）所有副词中111和122位点氨基酸取代的分布。对于位点111和122处的每个衍生氨基酸状态，直方图显示沿序列发散轴的成对收敛事件的分布（每个位点的预期取代次数）。替换的颜色编码如图2所示。底部的直方图显示了两个站点的成对收敛事件的组合分布。（B） 从功能数据中确定的16个地点与第111号和第122号地点的替代物相关性最强的地点的交集。“功能数据”组中的站点对应于方差分析模型（S8 和 S9 表）标识的两组中的 16 个站点。贝叶斯性状分析组中的位点对应于log（P）关联最高的前5%位点，分别与111或122个。每个组之间的重叠偶然大于预期：函数∩贝叶斯Traits111 = 3，P = 0.049;功能∩贝叶斯性状122 = 4， P = 0.007;贝叶斯性状111 ∩贝叶斯性状122 = 4， P = 0.011.（C） ATP1A1（PDB 3B8E）的晶体结构，显示根据图B中的交叉点和站点111和122中的交叉点进行颜色编码的站点为黑色球体。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.g006
使用相同的831序列，3-paralog比对，我们还询问了所有paralogs中的哪些位点具有与111和122（材料和方法）最强的取代模式。我们发现有4个位点（102，112，527和676）脱颖而出，在与111和122的替换最密切相关的位点中名列前5%（图6B），并且这种重叠量偶然大于预期。此外，与位点111最强相关的前5%的位点的原子距离也往往比预期的更接近111（中位数距离为111：25.1 Å，p <5e-4，自举;图6C）。这与与位点111和122的近似上位相互作用的趋势一致，但需要注意的是，在更高度不稳定的位点上检测相关性的能力更大。结合我们的系统发育和功能分析的结果，我们确定了一组与111和122的变化密切相关的替代物，并且在我们的功能实验中占背景依赖效应差异的很大一部分（重叠比偶然预期的要大;图 6B）。例如，尽管被独立确定，但位点102也是我们功能实验中背景依赖效应预测性最强的位点之一，属于一组6个位点，解释了60%的方差（图5B和6B）。总之，我们的研究结果表明，涉及少量位点的近邻相互作用，特别是具有111个位点的位点，可能是背景依赖效应的重要决定因素。
讨论
先前的研究表明，NKA介导的CTS抗性在动物中的适应性进化受到多效性和上位性（即背景依赖性）的限制[6，24-26，31]。此外，基于对蛋白质组的广泛系统发育分析，我们先验的期望是，随着物种和ATP1A副原体之间分歧程度的增加，上位应该代表更强的约束[21]。鉴于这些考虑，我们对四足动物ATP1A基因家族的广泛调查揭示了两种引人注目且看似矛盾的模式。首先，四足动物中CTS抗性的一些替代在系统发育上广泛分布，甚至与昆虫共享（例如，N122H在蛇中广泛存在，并在帝王蝶和其他昆虫中发现;参见图3的更多例子）。像这样的模式表明，上位约束在CTS耐药性的进化中的作用有限，因为相同的突变可以在高度不同的遗传背景上受到青睐。另一方面，位点111和122的抗性授予状态也存在很大的多样性，并且这些取代的某些组合似乎在系统发育上受到限制。例如，Q111R + N122D的CTS抗性组合在四足动物中已经进化了多次，但在昆虫中不存在，而CTS抗性组合Q111V + N122H在昆虫中进化了多次，但在四足动物中不存在（图3）。此外，一些替代物似乎在四足动物中也是副词特异性的（图3）。如何调和这些不同的模式？
由于CTS是多种化合物，其中一些谱系特异性模式可能是由特定分类群遇到的CTS的药理学差异以及它们如何处理这些化合物引起的[38]。例如，所有具有抗性取代Q111V + N122H的昆虫分类群都适应了称为“卡甸内酯”的CTS亚群，而至少一些具有Q111R + N122D的四足捕食者可以适应捕食螯合称为“bufadienolides”的独特CTS亚群的物种（例如捕食蟾蜍的草蛙[26]）。CTS的药理多样性在多大程度上解释了CTS适应型分类群中NKA的适应和收敛模式是一个重要的开放性问题。在这项研究中，我们专注于上位作为动物ATP1A介导的CTS抗性进化的偶然来源的作用，即替代的适应性效应取决于它们发生的顺序。遗传背景和偶然性在多大程度上限制了动物CTS耐药性的进化？
在我们对各种ATP1A1蛋白的功能分析中，我们发现位点111和122处的衍生取代对CTS耐药性具有很大程度上可预测的影响，突出的例外往往是大小而不是方向（图4）。例如，Q111R对许多物种的背景具有CTS抗性，但对沙鸡的抗性没有贡献（图4C和4E）。我们还注意到，在111和122处具有相同配对状态的物种在CTS抗性方面可以变化超过一个数量级（图4B）。总之，这些模式指向CTS耐药性的背景决定因素，这些背景决定因素可能是累加性的，而不是上位的。尽管如此，仍有一些在系统发育上广泛分布的取代，例如N122D，它们确实表现出对CTS抗性的背景依赖性影响（图4C和4E）。
关于多效性对NKA活性的影响，我们对不同ATP1A1背景上位点111和122位点取代的功能分析表明，这些取代与这些背景之间的相互作用在很大程度上是累加的。具体而言，我们发现，如果添加到蛋白质背景中，特定CTS抗性取代对NKA活性的影响的严重程度没有差异，这些蛋白质背景在远离自然发生取代的蛋白质背景的49至86个氨基酸取代的范围内（图5）。鉴于先前的结果证明类似取代对NKA活性的背景依赖性影响[24-26]，我们的研究结果表明，上位的程度对ATP1A1发散的程度没有单调依赖性。我们的研究结果进一步支持越来越多的证据表明，虽然上位可能是蛋白质进化的普遍特征，但对蛋白质结构和功能特性的许多突变影响似乎是累加的（例如，[39-41]）。
我们提出，我们的观察结果可以与先前的结果相协调，如果蛋白质功能的上位仅限于蛋白质中的少数位点，则证明上位约束。如果是这样，我们可能会期望上位的幅度可能与蛋白质范围的ATP1A1分化程度几乎没有依赖性，而是通过几个关键位点的发散来更好地预测。为了支持这一观点，Mohammadi等人[26]表明，由于取代Q111R和N122D引起的ATP1A1酶活性的降低可以通过区分CTS抗CTS和敏感ATP1A1副群的19个氨基酸差异中的10个（或更少）来挽救草蛙。此外，在黑腹果蝇[24，25]一书中的研究表明，与111和122位点CTS耐药性替代相关的严重神经功能障碍在很大程度上可以通过一个额外的替代（A119S）来挽救。我们的研究进一步支持了这一观点，表明人们可以识别一小组位点（16个或更少），这些位点占了跨越四足动物系统发育的蛋白质之间蛋白质对酶活性的背景依赖性影响变化的很大一部分。
重要的是要注意，我们关于上位约束的结论可能取决于我们实验地点的选择。特别是，我们选择关注位点111和122，正是因为它们在不同谱系中表现出反复出现且通常趋同的替代模式。可能的情况是，选择具有更强的谱系特异性取代模式的位点表现出对遗传背景的更大依赖性，并且对背景蛋白序列散化程度具有更一致的单调依赖性上位效应。未来的实验研究可以更系统地比较表现出收敛与谱系特异性模式的位点的上位点的上位模式。
此外，还值得注意的是，酶活性等表型并不等同于生物体的适应性，并且两者之间可能存在非线性映射。上面的讨论假设酶活性的变化很可能对生物体的适应性有害，但事实并非如此。我们发现，野生型NKAs的活性在所调查的物种中变化了6倍（图4E），这表明大多数物种要么对NKA活性的变化具有鲁棒性，要么在其他基因（包括其他ATP1A副群）中发生了变化，以补偿与ATP1A1相关的NKA活性的变化。因此，蛋白质活性本身不是NKACTS抗性进化的重要多效性约束，或者约束不仅取决于蛋白质背景，还取决于生物体更广泛的遗传背景（例如，其他相互作用的蛋白质;见[24]）。
我们的工作强调了比较功能工作在理解上位约束对新型蛋白质功能进化的本质方面的效用。在这个CTS耐药性NKAs进化的案例研究中，我们发现上位限制更可能依赖于蛋白质中少数关键位点的发散，可能靠近位点111，而不是蛋白质发散的总体水平。这些限制的局限性可能是在高度分化的物种的NKAs中观察到的CTS抗性替代的显着趋同的原因。
材料和方法
道德声明
所有涉及活体动物的程序均遵循安第斯大学Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio（CICUAL）批准的协议，批准号为POE 18-003（4/25/2017），或由普林斯顿大学2057号机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议编号为2057（3/21/2016）。哥伦比亚国家环境许可证协会（ANLA）根据安第斯大学第1177号法律授权进行样品的研究和实地收集。
示例集合和数据源
为了对脊椎动物ATP1A副logs（ATP1A1，ATP1A2和ATP1A3）进行全面调查，我们整理了本研究的831个蛋白质序列（相应的比对可以在S1数据集中找到）。哺乳动物拥有第四个副群（ATP1A4），主要在睾丸中表达[42]，我们在这里没有考虑，尽管为了完整性，蛋白质序列在S1数据集中提供，并且在S2数据集中提供了变异位点的比对）。831个序列包括这里为27种非鸟类爬行动物生成的RNA-seq数据（S1表;PRJNA754197）提供一些以前代表性不足的谱系的更多信息。其中包括田间捕获和博物馆存档的标本以及从商业宠物摊贩处购买的动物。在所有情况下，新鲜组织（大脑，胃和肌肉）被取并保存在RNAlater（Invitrogen）中，并储存在-80°C直至使用。
ATP1A副词的重建
使用TruSeq RNA文库制备试剂盒v2（Illumina）制备RNA-seq文库，并在Illumina HiSeq2500（美国新泽西州普林斯顿市基因组学核心设施）上测序，或使用NEBNext Ultra RNA文库制备灯（NEB）并在Illumina HiSeq4000（Genewiz，South Plainfield，NJ，USA）上进行测序（S2 Table）。为本研究生成的所有原始RNA-seq数据都已存放在国家生物技术信息中心（NCBI）序列读取档案（SRA）的Bioproject PRJNA754197下。与从公共数据库下载的SRA数据集一起，读取被修剪为Phred质量≥20，长度≥20，然后使用Trinity v2.2.0从头开始组装[43]。ATP1A paralogs 1，2和3的序列通过BLAST搜索（blast-v2.26）被拉出，单独策划，然后使用ClustalW对齐。ATP1/2/3 的完整对齐方式可以在 S1 数据集中找到。
统计系统发育分析
我们使用标准的绵羊（绵羊）编号系统来匹配以前的文献;这个数字对应于Uniprot：P04074序列减去5'末端的5个残基。来自ATP1A1（N = 429），ATP1A2（N = 197）和ATP1A3（N = 205）的蛋白质序列，包括主要的四足类（两栖动物，非鸟类爬行动物，鸟类和哺乳动物）以及肺鱼和腔棘鱼作为外群，使用具有默认参数的ClustalW对齐。系统发育重建的最优参数取自ModelTest-NG v.0.1.5 [44]中基于Akaike信息准则（AIC）的最拟合氨基酸替代模型，并推断为JTT+G4+F。在具有经验氨基酸频率的JTT + GAMMA模型下，使用RAxML HPC v.8 [45]推断出最初的系统发育。使用PhyML v.3.1 [46]进一步完善了分支长度和节点支持（aLRS），具有经验氨基酸频率和速率异质性参数的最大似然估计值，I和Γ。每个参数的系统发育可视化和字符状态映射是使用R包ggtree完成的[47]。
祖先序列重建和收敛计算
在PAML中，在JTT+G4+F替换模型下，使用codeml [48]进行祖先序列重建。将ATP1A系统发育中所有节点的祖先序列与现存序列相结合，产生1，660个ATP1A蛋白（831个现存物种和829个推断祖先序列）的1040个氨基酸多序列比对;S1 图）。对于树中的每个分支，我们通过使用每个位点的祖先和衍生氨基酸状态来确定取代的发生，仅使用后验概率（PP）>0.8的状态。比较所有分支对，除姊妹分支和祖先-后代对外[21，22]。当比较同一位点两个不同分支上的取代时，对相同氨基酸状态的取代被计为收敛，而远离共同氨基酸的取代被计为发散。我们排除了一个假定的30个氨基酸长交替剪接的区域（位置810-840）。对于每个成对比较，我们计算每个分支观察到的收敛事件的比例为（收敛次数+1）/（发散数+1）。描述趋势的线计算为运行平均值，窗口大小为 0.05 个替换/站点。基于每个窗口的100个随机成对分支比较样本估计了95%的置信区间。为了确定位点111或122处的收敛性是否随着序列发散而减少，我们将收敛事件编码为所有“1”，将发散事件编码为所有成对序列比较，并使用逻辑回归来测试分子收敛（0或1）与遗传距离之间的相关性（S4图）。
识别相关的替代项。
我们使用贝叶斯性状[49]来检测ATP1A系统发育中与位点111和122具有相关进化的位点。使用每个副源分支（即ATP1A1的最新共同祖先（MRCA），ATP1A2的MRCA和ATP1A3的MRCA）的重建祖先序列，我们将多物种比对的现有序列中的每个氨基酸状态编码为祖先“0”并导出“1”状态，并用这些加上具有估计分支长度的系统发育作为贝叶斯性状的输入。贝叶斯性状拟合连续时间马尔可夫模型，以估计离散的二元性状之间的转换速率，并估计描述它们在系统发育上的联合进化的最佳拟合模型。具体来说，我们测试了位点111和122的进化速度是否依赖于所有其他变异位点（见下文）。我们排除了单例站点和差距超过80%的站点，因为这些站点的信息很少，因此对417个变体站点进行了分析。
我们测试了两组模型，以下称为基本模型和受限模型，每组模型都有一个空独立模型和一个替代依赖模型。null 独立模型假定两个站点独立演化，而替代依赖模型假定这些站点是相关的，使得一个站点的更改依赖于另一个站点的状态。由于空模型是替代模型的一般形式，因此可以在甚比检验 （LRT） 下比较这两个模型，其自由度 （df） 等于模型之间参数数的差异。模型的基本集和受限制的模型集在是否存在某些转换速率的受限制参数方面有所不同，因此在df的数量上也不同。在基本模型中，空模型具有四个速率参数，描述了每个站点上每个可能的独立状态变化;替代模型具有八个速率参数，描述了每个站点上的所有可能变化，具体取决于另一个站点的状态（df = 4的LRT）。对于受限模型，我们将过渡到祖先状态的速率设置为零 [24]，因为树的中位数分支长度为每个站点 0.002351 个替换，使得站点不太可能更改两次或返回到祖先状态。在这些限制之后，空独立模型有四个过渡参数。为了测试依赖性，我们对模型施加了两个额外的限制：一个强制第一个站点的转换速率固定，而不管站点2的状态如何（q13 = q24），另一个强制站点2的转换速率是固定的，而不管站点1的状态如何（q12 = q34）[24]。这有效地测试了转换速率是否受任一站点状态的影响，并使模型只剩下两个转换参数（df = 2 的 LRT）。为了运行分析，使用贝叶斯性状缩放系统发育分支长度，使其平均长度为0.1，并且为了增加找到真正最大可能性的机会，我们将MLTries设置为250。
蛋白质结构分析
为了测试显示与站点111或122共同进化的统计特征的站点的空间聚类，我们使用了自定义Python脚本（可根据请求提供）和Bio.PDB的模块。我们使用Na，K-ATP酶（PDB：3b8e）的晶体结构来估计位点111或122的α碳与排列中所有其他可变位点的α碳之间的距离（以埃为单位）。我们计算了每个焦点位点具有最强相关进化特征的前5%的变量位点的中位距离，即111或122（来自贝叶斯性状输出）。我们使用5%可变位点的1000个随机样本来估计p值，并计算中位数小于或等于观测值的乘以比例。
表达载体的构建
采用Invitrogen GeneArt合成了8个选定四足动物物种的ATP1A1和ATP1B1野生型序列（图4A）。这些结构中使用的ATP1A1 / B1序列可以在以下加入编号下找到：Rattus norvegicus（ATP1A1 –X05882;ATP1B1 –NM013113.2）， 栗鼠 （ATP1A1 –XM005389040;ATP1B1 –XM005398203）， 横纹亚迷你 （ATP1A1 –MT928191;ATP1B1 –ON168934）， 横纹头畸形 （ATP1A1 –MT928200;ATP1B1 –ON168935）， Varanus exanthematicus （ATP1A1 –MT928184;ATP1B1 –ON168936）， Tupinambis teguixin （ATP1A1 –MT928189;ATP1B1 –ON168937）， Struthio camelus （ATP1A1 –XM009675281;ATP1B1 –XM009675170）， Pterocles gutturalis （ATP1A1 –XM010081314;ATP1B1 –XM010078905）。将β1亚基基因与XhoI和PaeI（FastDigest Thermo Scientific）一起插入pFastBac Dual表达载体（Life Technologies）的p10启动子中，然后进行对照测序。使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Takara Bio，USA Inc.）将α1亚基基因插入已经含有相应β1亚基蛋白的载体的PH启动子上并进行对照测序。所有得到的载体在PH启动子的控制下具有α1-亚基基因，在p10启动子下具有β1亚基基因。然后将所得的8个载体进行定点诱变（QuickChange II XL Kit;安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州拉霍亚）介绍感兴趣的密码子。总共生产了21个载体（S3表）。
重组病毒的产生和转染到Sf9细胞中
大肠杆菌携带杆状病毒基因组（bacmid）和转位辅助载体（Life Technologies）的DH10bac细胞根据制造商的方案与含有不同基因构建体的表达载体进行转化。通过PCR筛选选择重组杆菌，生长和分离。随后，Sf9细胞（4 x 105在2ml Insect-Xpress培养基（Lonza，Walkersville，MD，USA）中使用Cellfectin试剂（Life Technologies）用重组杆菌团转染细胞* ml）。经过三天的潜伏期后，分离重组杆状病毒（P1）并用于感染新鲜的Sf9细胞（1.2×106细胞*ml）在10ml Insect-Xpress培养基（Lonza，Walkersville，MD，USA）中，用15mg / ml庆大霉素（Roth，Karlsruhe，Germany）以0.1的感染多重性。感染后5天，收获扩增的病毒（P2库存）。
Sf9膜的制备
为了生产重组NKA，Sf9细胞以10倍的感染率感染P2病毒储液3.单元格 （1.6 x 106细胞* ml）在50ml Insect-Xpress培养基（Lonza，Walkersville，MD，USA）中生长，在27°C下在500ml烧瓶（35）中用15mg / ml庆大霉素（Roth，Karlsruhe，Germany）生长。3天后，通过以20，000×g离心10分钟收获Sf9细胞。将细胞储存在-80°C，然后在0°C下重悬于15ml匀浆缓冲液（0.25M蔗糖，2mM EDTA和25mM HEPES / Tris; pH 7.0）中。重悬的细胞在0°C下以60 W（德国柏林班德林电子公司）超声处理三个45秒间隔。 然后将细胞悬浮液以10，000×g离心30分钟（J2-21离心机，贝克曼库尔特，克雷费尔德，德国）。收集上清液并在4°C下以100，000×g进一步离心60m（超离心机L-80，贝克曼 - 库尔特）以沉淀细胞膜。将颗粒状膜洗涤一次，重悬于ROTIPURAN p.a.，ACS水（Roth）中并储存在-20°C。 使用牛血清白蛋白作为标准通过Bradford测定测定蛋白质浓度。为每个NKA构建体产生三个生物重复。
通过 SDS-PAGE/蛋白质印迹进行验证
对于每个生物重复，在4x SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液中溶解10μg蛋白质，并在含有10%丙烯酰胺的SDS凝胶上分离。随后，它们被印迹在硝酸纤维素膜上（HP42.1，Roth）。为了阻断印迹后的非特异性结合位点，将膜与5%干奶在TBS-吐温20中孵育1小时。阻断后，将膜在4°C下与原代单克隆抗体α5一起孵育过夜（发育研究杂交瘤库，爱荷华大学，爱荷华市，爱荷华州，美国）。由于仅从转染细胞中分离出膜蛋白，因此检测α亚基也表明存在β亚基。使用与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠二抗来检测一抗（Dianova，汉堡，德国）。通过在20ml冰冷甲醇中加入60mg 4-氯-1萘酚（Sigma-Aldrich，德国陶夫基兴）到含有60μl30%H的100ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行沉淀多肽 - 抗体复合物的染色2O2.见S8图。
瓦巴因抑制试验
为了确定每种NKA构建体对强心肌类固醇（CTS）的敏感性，我们使用水溶性强心苷，ouabain（Acrōs Organics）作为我们的代表性CTS.每种蛋白质的100ug在含有稳定缓冲液的96孔微孔板（Fisherbrand）上以九孔行移液到每个孔中（参见[50]中的缓冲液公式）。九孔行中的每口孔都暴露于呈指数级下降的瓦巴因浓度（10−3M， 10−4M， 10−5M， 10−6M， 10−7M， 10−8M，溶解在蒸馏H中2O），仅加蒸馏水（实验对照），以及缺乏KCl和10的抑制缓冲液的组合−2M ouabain用于测量背景蛋白活性[50]。将蛋白质在37°C和200rpms下在微孔板振荡器上孵育10分钟（Quantifoil Instruments，德国耶拿）。接下来，将ATP（Sigma Aldrich）添加到每个孔中，并将蛋白质在37°C和200rpm下再次孵育20分钟。通过定量定量酶水解ATP释放的无机磷酸盐（Pi）来确定瓦巴因暴露后NKA的活性。根据Taussky和Shorr中描述的程序测量反应Pi水平[51]（参见Petschenka等人[50]）。所有测定都是一式两份进行的，两个技术重复的平均值用于随后的统计分析。使用板吸光度读数器（BioRad Model 680分光光度计和软件包）在650nm处测量每个孔的吸光度。请参阅 S4 表。
ATP 水解测定
为了确定不同NKA构建体的功能效率，我们计算了每分钟每毫克蛋白质从ATP水解的Pi量。测量值（两个技术重复的平均值）是从如上所述的相同测定中获得的。简而言之，测量来自实验对照反应的吸光度，其中100μg蛋白质在没有任何抑制因子（即ouabain或缓冲液不包括KCl）的情况下孵育，并从平行运行的标准曲线（1.2 mM Pi，1 mM Pi，0.8 mM Pi，0.6 mM Pi，0.4 mM Pi， 0.2 mM Pi，0 mM Pi）。请参阅 S4 表。
功能数据的统计分析
在Petschenka等人之后，在存在和不存在CTS瓦巴因的情况下，ATP酶活性被测量[50]。使用与抑制因子反应的背景磷酸盐吸光度水平来校准磷酸盐吸光度。对于瓦abain灵敏度测量，这些校准的吸光度值根据对照孔的测量结果转换为非抑制NKA活性百分比（如上所述）。对于 3 个生物重复中的每一个，log10 IC50使用 R 中 minipack.lm 库的 nlsLM 函数，使用四参数逻辑曲线估计值，将顶部渐近线设置为 100，将底部渐近线设置为零。<为了测量基线重组蛋白活性，在没有瓦abain的情况下测定的计算的100μg蛋白质的Pi浓度被转换为nmol Pi / mg蛋白/ min。我们使用配对<b11>的 t 检验和 Bonferroni 校正来确定有和没有工程替换的构造之间的显著差异。我们使用双向方差分析来测试取代的背景依赖性（即，背景和氨基酸取代之间的相互作用）与瓦abain耐药性的关系（log10 IC50）和蛋白质活性。具体来说，我们检验了替换 X->Y 在不同背景上的影响是否相等（原假设：X->Y（背景 1）= X->Y（背景 2））。我们进一步假设替换 X->Y 的效应应与 Y->X 的效应相匹配。数据使用R中的ggplot2包绘制，Dryad上的原始测定数据在 https://doi.org/10.5061/dryad.sqv9s4n68[52]。
此外，我们评估了取代对给定氨基酸状态的影响与测试这些取代的蛋白质背景之间的序列分歧程度之间的关系。为此，我们首先计算引入衍生氨基酸状态的效果，作为蛋白质活性相对于野生型蛋白质的百分比变化。例如，突变N122D在栗鼠（CHI）中的作用是
然后，我们计算了在两个不同背景上对相同氨基酸的取代效应之间的绝对差异。例如，当引入栗鼠（CHI，哺乳动物）和假铁去鞘（FER，蛇）蛋白时，122D的作用（Δ）的差异是
这些计算可用于11个成对比较（4个用于站点111，7个用于站点122;S7 表）。然后，我们评估了对给定状态的取代效应的估计差异与野生型背景之间蛋白质序列差异（氨基酸差异的数量）之间的关系。
为了确定在我们的数据中最能强烈预测背景依赖效应的变异位点，我们采用了逐个位点的方差分析。对于 11 个成对比较中的每一个（例如，Δ气 − 铁，X122D）如果野生型序列分别具有相同或不同的氨基酸状态，则每个变体位点被编码为“0”或“1”。这种二值化的每个位点发散（0或1）被用作方差分析中的因变量，位点111或122（突变的位点）作为协变量（S5A图）。对于八种野生型蛋白质中的113个变异位点中的每一个，我们然后估计该位点的边际方差得到了解释。
鉴于野生型背景（8）相对于位点数量（113）的数量有限，并且在多重比较中使用构造，一些变异位点会发生强相关性（S5B图）。因此，我们根据位点在实验成对序列比较中如何划分发散的方式对位点进行分组。使用 Pearson 的 r >0.8 对站点进行分组可分为 24 个组。然后，我们每组使用一个代表性位点，然后拟合嵌套方差分析模型，以确定通过添加额外的站点组来解释Δ中的变化量，并按最大（组1）到最小（组24）的变化量的顺序添加组来解释。使用似然比检验（LRT）和Akaike的信息标准（AIC），我们将最佳模型确定为仅包括前两组的模型，这两组共代表16个站点（第1组14个站点和第2组中的2个站点;S5C 图和 S9 表）。这 16 个位点占方差的 78%（方差分析 R2).由于组 1 和组 2 被确定为占方差最大比例的组，我们通过排列确定了此观察的意义。具体来说，我们在构造比较中对实验成对Δ进行了10，000次排列，并重复了应用于观察到的数据的过程，以获得R的零分布。2值。p 值估计为找到解释 R 的两组位点的概率2≥ 0.78.我们进一步评估了上述16个位点的Δ与序列散度的相关性（估计为皮尔逊r）。同样，为了检验我们的回归模型在Δ和散度之间的重要性，我们将p值估计为观察到Pearson's r为0.78（或R）的概率。20.61） 或更大，基于 10，000 个置换样本（置换效应，Δ，跨构造比较）。为了确定我们的结果对分组标准的鲁棒性，我们使用更高的Pearson's r>0.99的截止值进行了相同的分析（S8表）。
德莱阿德 DOI
https://doi.org/10.5061/dryad.sqv9s4n68
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ATP1A基因家族进化。
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S1 图 ATP1A基因家族进化。
（A）ATP1A蛋白家族的最大似然系统发育。彩色分支对应于每个参数，将分支支撑显示为近似似然比统计量（aLRS）。底部比例尺显示每个站点的预期替换次数。（B）ATP1A蛋白家族的祖先序列重建。按后验概率 （PP） 类显示站点计数的巴氏图。每个位点根据829个祖先序列的平均PP被分配到一个类。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s001
（断续器）
S2 图 在已知与整个ATP1A蛋白家族的CTS耐药性有关的42个位点上发生的取代的系统发育计数（使用S1A图中的系统发育）。
H1-H2细胞外环中的位点占42个位点中发生的取代总数的81%;位点111和122占在H1-H2环中观察到的取代的19%。站点分组如下：111–122（红色）、H1-H2 环路（蓝色）和其他站点（灰色）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s002
（断续器）
S3 图例 图示了重组Na，K-ATP酶蛋白在111和122位具有氨基酸取代的实验设计。
三个字母的代码指的是GRA：Grass Frog（Leptodactylus）;RAT： Rat （Rattus）;CHI： 栗鼠 （栗鼠）;OST： 鸵鸟 （斯特鲁西奥）;SNG： 沙鸡 （翼龙）;MON： 巨蜥（Varanus）;TEG：特古蜥蜴（Tupinambis）;FER： 假 fer-de-lance （Xenodon）;KEE：红颈龙骨蛇（Rhabdophis）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s003
（断续器）
S4 图 来自8种脊椎动物的24种工程Na，K-ATP酶（NKAs）的联合功能特性。
蛋白质根据它们被设计的物种进行颜色编码。每个物种的位置111和122处的Wild型氨基酸状态和系统发育关系在底部表示。对于每个物种，从左到右，首先显示野生型蛋白质的功能数据（用属名表示），然后是突变蛋白（用+[突变]表示）。图A显示了SEM ATP水解活性±平均值（用于测量蛋白质活性的代理）。黑色虚线显示“0”活性标记，可作为催化无活性蛋白质的参考。图B显示了SEM日志IC±平均值50（直接测量CTS电阻）。来自每个蛋白质的三个生物重复的原始数据显示在开环中，并相对于x轴抖动。包括来自Mohammadi等人的三种蛋白质（GRA）的六个生物重复的原始数据[26]。三种取代产生催化无活性蛋白，导致没有可测量的IC50，因此在面板 B 中用“X”标记。一条虚线黑线显示猪 NKA LogIC50并作为 CTS 敏感性的参考。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s004
（断续器）
S5 图例 本研究中生产的工程α亚基对Na，K-ATP酶进行蛋白质印迹分析。
用α5单克隆抗体染色110 kDa ATP1A1蛋白，然后用辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠抗体染色。样品代表通过细胞培养产生的21种不同重组Na，K-ATP酶（S3表）的三个生物重复。每个生物重复的蛋白质活性水平（nmol Pi / mg蛋白质）在其各自的条带下指示。两种重组蛋白（1B *和12C *）在单独的凝胶上第二次电泳，原因是原始蛋白质在膜上被切断或样品浓度过高。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s005
（断续器）
S6 图 区分野生型ATP1A1结构的变异位点之间的相关性程度。
（A） “曼哈顿图”，显示由每个变种位点的背离解释的测量效应中方差程度的显著性。请注意，具有高 log（P） 值的站点不是独立的。（B）113个变异位点中的皮尔逊相关系数（r），区分8个野生型结构（即背景）。我们使用了|r的截止值|> 0.8 来定义用于模型分析的高度相关位点组。（C） 变异比例（R2），这可以通过每组共线性位点使用一个代表性位点的越来越多的嵌套方差分析模型来解释。红色虚线显示基于似然比检验 （LRT） 和 Akaike 信息标准 （AIC） 的最佳模型（模型 B：组 1+2）。（D）皮尔逊r（两个背景上的Δeffect与每组氨基酸差异的数量相比）随着所包含的位点数量（条形 - 右Y轴）而单调地减少。相关性仍然显著（P<0.05），直到模型D（组1+2+3+4），共包括23个位点。（E） R 的空分布2最佳模型（模型 B：组 1+2）的值，基于位点间对相同衍生氨基酸状态的排列效应。红线表示观察到的 R2以获得最佳型号。P值计算为观测R的概率2零> = R2obs.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s006
（断续器）
S7 图 ATP1A序列之间的收敛速率是序列发散增加的函数。
ATP1A蛋白家族的收敛速率（蛋白质范围）随时间的变化。估计ATP1A系统发育中所有分支对的收敛（C）相对于发散（D）取代的比例，除了姐妹分支或祖先后代对。色阶显示两个轴的点的密度。分支之间的距离对应于被比较的蛋白质对之间每个位点的预期氨基酸取代数（在JTT + G4 + F模型下）。红线显示窗口大小为 0.05 个替换/站点的运行平均值。虚线表示基于每个窗口 100 个引导重复的 95% 置信区间。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s007
（断续器）
S8 图 位点（A）111和（B）122的收敛概率和平行度作为分支之间距离的函数（即两个蛋白质之间的内部分支长度之和）。
直方图显示了事件的系统发育分布，其中两个分支上位点111或122的替换导致相同的氨基酸状态（顶部）或不同的状态（底部），并且在右侧垂直轴上指示替换计数。站点 111： 对数赔率 -0.5673， P = 0.038;站点 122：对数赔率 -1.8788，P>0.1。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s008
（断续器）
S1 表。 本研究生成的数据的物种收集信息。
有关本研究中使用的完整物种列表，请参阅S1数据集。动物购买已获得IACUC第2057-16号议定书的批准。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s009
（英文）
S2 表。 本研究产生的新的爬行动物RNA-seq数据（PRJNA754197）和从先前工作中挖掘的两栖动物RNA-seq数据（PRJNA627222）。
有关系统发育分析中包含的ATP1A序列的来源，请参阅S1数据集（图2）。除ATP1A数据外，还对四个物种进行了ATP1B1序列的开采，这些序列用于随后的蛋白质工程实验：Rhabdophis subminiatus（GenBank加入编号：ON168934），Xenodon rhabdocephalus（GenBank加入编号：ON168935），Varanus exanthematicus（GenBank加入编号：ON168936）和Tupinambis teguixin（GenBank加入编号：ON168937）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s010
（英文）
S3 表。 用于测试脊椎动物ATP1A1中111和122位置氨基酸取代的功能效应的基因构建体列表。
另请参见 S3 图。对于每种重组蛋白，相应物种的野生型ATP1B1与ATP1A1共表达。按照惯例，氨基酸位置基于绵羊编号系统。ATP1A1的111和122处的野生型氨基酸状态在“描述”下每个物种的括号中表示。基于Mohammadi等人的饮食数据[7]。来自草蛙（Leptodactylus macrosternum）结构的数据来自Mohammadi等人[26]。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s011
（英文）
S4 表。 总结了Na，K-ATP酶对每种ATP1A1重组蛋白构建体的瓦abain敏感性和催化特性。
这些值表示平均值和 SD 瓦巴因灵敏度（对数 IC50）的蛋白质活性的三个生物重复。每个重组蛋白构建体的ATP1B1与ATP1A1共表达。“X”表示 IC50无法衡量。GRA（Leptodactylus macrosternum）结构的数据来自Mohammadi等人[26]。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s012
（英文）
S5 表。 测试取代物对瓦abain抑制（IC50）和ATP酶活性的抗性的背景依赖性（上位）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s013
（英文）
S6 表。 ATP1A1，ATP1A2，ATP1A3蛋白的H1-H2环区的祖先序列重建。
请参阅正文中的图 2。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s014
（英文）
S7 表。 构造之间的成对功能比较的摘要。
请参阅正文中的图 5。图中显示了所分析的 11 个成对比较：4 个比较包括站点 111 的状态和站点 122 处的 7 个比较。每次比较都显示了相同氨基酸状态在两个背景上的影响百分比差异（Diff%），以及整个蛋白质中氨基酸差异的成对数量（AA_dist），成对蛋白质序列差异百分比（AA_dist%），以及用方差分析鉴定的16个位点的氨基酸差异的成对数量（AA_dist_16;参见S8和S9表）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s015
（英文）
S8 表。 方差分析嵌套模型和皮尔逊相关性的模型选择摘要。
根据两个分组标准显示的分析：向上，根据绝对Pearson相关性|r|对研究中心进行分组>0.8，共24组;向下，网站根据|r|分组>0.99，产生45组。方差分析模型通过一次添加一个组，以逐步增加复杂性，并按最大（组1）到最小（组24或组45）的边际方差的顺序添加组。站点数（站点数）是模型中包含的站点的累积数。使用似然比检验（p_LRT）的P值和AIC统计量进行模型选择。请注意，无论使用何种分组标准，最佳模型都包括相同的 16 个站点（分别为模型 B 和模型 D）。对于每个方差分析模型，我们使用Pearson相关性来估计模型中包含的位点（#位点）的成对背离与相同氨基酸状态在两个背景上的%Δ效应之间的关系强度。由于我们的实验比较不是独立的，我们在构造比较中对实验成对%Δ效应进行了10，000次排列，并将模型的P值估计为观察到的皮尔逊相关系数高于或等于观测值的概率。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s016
（英文）
S9 表。 两组（Pearson's r >0.8）中包含的16个位点解释了通过方差分析建模确定的功能效应的高比例变异。
F 值，R2和 P 值对应于每个位点的单个方差分析。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s017
（英文）
S1 数据集。 所有物种的ATP1A的蛋白质序列以fasta格式排列。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s018
（法斯塔）
S2 数据集。 所有分类群中与CTS抗性有关的位点的氨基酸状态表。
格式化为 MSExcel .xlsx文档。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s019
（XLSX）
S3 数据集。 所有物种的ATP1A CDS序列的核苷酸序列以fasta格式排列。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010323.s020
（法斯塔）
确认
我们感谢G. Sella和M. Przeworski的有益讨论，以及M. Przeworski对本文早期草案的批判性阅读。我们感谢C. Natarajan、P. Kowalski、M. Winter和V. Wagschal在实验室的协助，以及D.A. Gómez-Sánchez在实地的协助。我们感谢J. Oaks提供环颈蛇的组织。我们感谢安第斯大学研究和创建办公室副主任在许可证方面的帮助。
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