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一种源自细菌脱泛素酶的多功能新工具,用于检测和纯化泛素化底物及其相互作用的蛋白质
发布时间:2022-07-01 16:39:39  来源:  【 】   浏览:

一种源自细菌脱泛素酶的多功能新工具,用于检测和纯化泛素化底物及其相互作用的蛋白质 张梦文,杰森•阿德里安•梅尔塔什,让·坎约,马克·霍赫斯特拉瑟 出版日期: 2022年06月30日 抽象

 

蛋白质泛素化是影响各种细胞过程的重要翻译后修饰。由于生物样品中泛素化物种的丰度较低,因此在纯化和检测泛素化蛋白质的方法上花费了大量精力。我们开发并表征了一种基于OtUBD的泛素检测和纯化的新型工具,OtUBD是一种来自东方苜蓿脱泛素酶(DUB)的高亲和力泛素结合结构域(UBD)。我们证明OtUBD可用于从酵母和人体组织培养样品中纯化单泛素化和多泛素化底物,并将其性能与现有方法进行比较。重要的是,我们发现了选择性纯化共价泛素化蛋白或共分离泛素化蛋白及其相互作用蛋白的条件。作为这些新开发方法的原理证明,我们分析了发芽酵母酿酒酵母的泛素组和泛素相关蛋白质组。将OtUBD亲和力纯化与定量蛋白质组学相结合,我们确定了E3连接酶Bre1和Pib1的潜在底物。OtUBD为泛素研究提供了一种多功能,高效且经济的工具,与某些其他方法相比具有特定优势,例如有效检测单泛素化或泛素与非规范位点的联系。

介绍

泛素是一种保守的翻译后修饰剂,需要级联酶促反应才能附着在蛋白质上[1]。每种修饰均由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3催化[2]。E1酶激活泛素的羧基末端羧酸盐,然后将活化的泛素分子转移到E2中。E3连接酶负责识别底物并催化泛素从E2转移到底物蛋白上的亲核残基,通常是赖氨酸残基的ε氨基,但也可能具有N端氨基,丝氨酸/苏氨酸羟基侧链或半胱氨酸的硫醇基团[3]。泛素本身可以通过其N端蛋氨酸(M1)或其7个赖氨酸残基中的一个或多个(K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63)实现泛素化[4]。这些不同的泛素链拓扑结构和大小可以调节泛素化底物的生物学功能,通常被描述为“泛素密码”[5]。例如,据报道,单泛素化在许多情况下可促进蛋白质复合物的形成[67]。涉及K48连接的多泛素化是蛋白酶体降解的有据可查的底物标记物[8],而具有K63连接的多泛素化通常是膜运输或DNA修复途径的信号[910]。泛素化可以通过泛素特异性蛋白酶或脱泛素酶(DUBs)的水解逆转[11]。

泛素化缺陷与许多人类疾病有关,包括癌症、病毒感染和神经退行性疾病[12-14]。蛋白质泛素化的广泛生物医学影响刺激了开发研究泛素化蛋白质组的敏感方法的努力[1516]。由于给定蛋白质底物群体的泛素化部分在稳态下通常非常小[17],因此通常需要富集感兴趣的生物样品中的泛素化蛋白。目前富集泛素化蛋白的方法大致可分为3类:(1)表位标记泛素的异位(过)表达和使用标签的亲和力纯化;(2)抗泛素抗体免疫沉淀;(3)使用串联泛素结合实体(TUBEs)[18-2021-24]。

第一种方法是使用发芽酵母酿酒酵母引入的[25]。在酵母中,4种不同的基因编码泛素,要么与核糖体肽融合,要么作为泛素重复序列[26]。有可能产生酵母菌株,其中泛素的唯一来源是表达表位标记的泛素的质粒[2728];结果,该特定酵母菌株中的所有泛素化蛋白质都带有表位标签,然后可用于富集或检测泛素化物种。许多早期的研究已经使用这种方法来分析泛素化的蛋白质组[4]。该方法的一个主要问题是标记的泛素的(过度)表达可能导致异常的泛素化或干扰内源性泛素化事件。

研究内源性泛素化蛋白,抗泛素抗体 - 包括针对所有泛素化类型(如FK1和FK2单克隆抗体;[29])或对某些泛素链连锁的特异性抗体(如抗K48泛素连锁抗体)已被使用[3031]。另一方面,TUBE是由多个泛素结合结构域(UBD)构建的重组泛素亲和试剂。UBDs已在一系列泛素相互作用蛋白中得到表征,并且它们通常以低亲和力(Kd值在微摩尔范围内)与泛素结合[32]。通过将UBD的多个拷贝融合在一起将其转化为TUBE,试剂对多泛素链修饰蛋白的亲和力大大提高[21]。因此,TUBEs可用于保护多泛素化蛋白免受DUB裂解并在生物样品中富集它们,并且一些TUBe旨在识别特定类型的多泛素链[33]。一般而言,TUBE对单泛素化蛋白的亲和力较低[21]。

除上述方法外,泛素残留基序抗体(diGly抗体)也广泛用于自下而上的蛋白质组学实验,以鉴定底物蛋白上的泛素化位点[3435]。在自下而上的蛋白质组学中,蛋白质被蛋白酶(通常是胰蛋白酶)消化成短肽,通过液相色谱分离,并通过串联质谱(LC-MS/MS)鉴定[36]。泛素化蛋白的胰蛋白消化在泛素化赖氨酸侧链上留下标志性的GlyGly(GG)残留物[18]。抗二聚乙二醇ε Lys抗体识别这种残余基序,并丰富这些肽以鉴定无处不在的位点。diGly抗体的开发极大地促进了泛素化蛋白及其泛素化位点的系统发现和分析,并使得能够建立记录人类和其他物种泛素化的数据库[3738]。

这些方法中的每一种都有其优点和局限性,这些优点和局限性已在别处进行了回顾[1639]。例如,TUBE是研究多泛素化的绝佳工具,但在一些哺乳动物细胞类型中,超过50%的泛素化蛋白质只有单泛素化[17],并且很容易被TUBe遗漏。抗双Gly抗体虽然在识别泛素-赖氨酸连锁方面非常有效,但无法识别蛋白质或其他大分子中其他亲核侧链上的泛素化位点[40]。由于泛素化的重要性和复杂性,开发灵敏且经济的试剂来研究整个泛素组至关重要。

最近,我们小组在DUB效应蛋白OtDUB中发现了一种新型UBD,来自细胞内细菌Orientia tsutsugamushi,这是该病擦伤寒斑疹伤寒的致病因子[41]。来自OtDUB的UBD,被称为OtDUB瑞银(为简单起见,我们将对本文的其余部分使用OtUBD),跨越1,369-残基OtDUB多肽的残基170至264(图1A),并以非常高的亲和力结合单体泛素(Kd,大约5 nM),比迄今为止描述的任何其他天然UBD都要紧500倍以上。OtDUB和泛素的共晶结构显示,OtUBD在异亮氨酸-44疏水贴片处与泛素结合,这是泛素结合蛋白通常认可的泛素特征[42]。我们推断,小而折叠的OtUBD可以作为泛素化蛋白质的简单富集试剂。这种试剂的优点包括成本低,单泛素化和多泛素化蛋白质之间没有偏倚,以及检测非常规泛素-底物键的能力。

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图 1. 来自OtDUB的高亲和力UBD有效地保护和丰富酵母泛素化物种。

(A)示意图示意图显示泛素结合结构域(OtUBD)在O.津津龟DUB (OtDUB).OtUBD的残基范围为170至264。(B)OtUBD的不同构造和来自人类Ubiquilin 1的UBA域的控制管。他6标记的OtUBD和TUBE用于图1C所示的泛素化保护实验,MBP标记的OtUBD和3xOtUBD用于图1D中泛素下拉实验。OtUBD可防止本体泛素化基底(顶板)和单泛素化组蛋白H2B(底板)的脱泛化。(D)使用不同的诱饵蛋白从酵母细胞裂解物中拉出MBP的IB分析。将MBP或MBP标记的诱饵蛋白与直链淀粉树脂结合,并将结合的蛋白质在SDS样品缓冲液中孵育。裂解物中的OtUBD和3xOtUBD结合(B)泛素化底物。诱饵蛋白的浓度表示每单位体积的直链淀粉树脂的诱饵蛋白量。B,结合分数;IB,免疫印迹;MBP,麦芽糖结合蛋白;OtDUB, O.津津龟配音;TUBE,串联泛素结合实体;U,未结合分数;UBD,泛素结合结构域。

 

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结果

OtUBD可以保护和富集来自全细胞裂解物的泛素化物种

我们首先表达并纯化了具有N端的重组OtUBD6标记(图 1B)。先前报道的一种基于人泛素1(4xTR-TUBE)的UBA结构域的TUBE用于比较[2343]。TUBEs的一种用途是保护体外泛素化蛋白不被内源性DUBs切割或在细胞裂解后被蛋白酶体降解,这有助于它们的分析[21]。我们测试了OtUBD是否可以做同样的事情。当酵母细胞在N-乙基马来酰亚胺(NEM;抑制大多数细胞DUBs的共价半胱氨酸调节剂),3μM OtUBD或3μM TUBE的存在下裂解时,2种泛素结合剂同样保留了质量更高的泛素化物质,其中NEM具有最强的作用,如预期的那样(图1C)。

我们通过检查ubp8Δ突变体中标记的组蛋白H2B(Htb2)来研究这种保护是否扩展到单泛素化蛋白[44]。已知组蛋白H2B是单泛素化的,并且通过删除Ubp8(逆转修饰的DUB)来增强该物种的水平[45]。引人注目的是,添加到细胞裂解物中的OtUBD保留了单泛素化的H2B,其程度与NEM相当(图1C,底部)。相比之下,H2B-泛素在没有任何DUB抑制剂的提取物中或与TUBE蛋白一起孵育时完全丢失。

接下来,我们确定OtUBD或OtUBD的串联重复序列是否可用于泛素化蛋白质的亲和富集。我们将麦芽糖结合蛋白(MBP)融合到OtUBD或3个串联OtUBD重复序列的氨基末端(图1B)。将纯化的MBP或MBP融合蛋白首先与直链淀粉树脂结合,然后与酵母全细胞裂解物一起孵育。由于树脂结合诱饵蛋白的量较低,MBP-3xOtUBD比MBP-OtUBD富含更多的泛素化蛋白,这可能是由于其更高的结合泛素的能力(3个泛素结合位点与OtUBD中的1个相比)(图1D,左;比较结合(B)与未结合(U)泳道)。然而,当我们增加诱饵蛋白的量时,MBP-OtUBD和MBP-3xOtUBD都有效地从裂解物中耗尽了泛素化蛋白(图1D,右)。阴性对照MBP在任一浓度下均未检测到任何泛素化物种结合。值得注意的是,只有当MBP-OtUBD预先结合到直链淀粉树脂上时,才能实现有效的富集(S1A图)。当游离的MBP-OtUBD首先与细胞裂解物一起孵育,然后与直链淀粉树脂结合时,富集效率受到影响(S1B图)。MBP-OtUBD还有效地富集了来自哺乳动物细胞裂解物的泛素化蛋白,证明了其在物种中的一般效用(S1C图)。

总之,OtUBD既可以保护泛素化蛋白质免受体外去泛素化的影响,又可以富集这些蛋白质。与之前报道的UBDs[2146]不同,OtUBD可以有效地富集泛素化的蛋白质,即使用作单个实体而不是串联重复序列。

一种共价连接的OtUBD树脂,用于泛素化蛋白质纯化

接下来,我们生成了具有共价连接的OtUBD的树脂,以最大限度地减少MBP-OtUBD和麦芽糖洗脱中看到的诱饵蛋白的污染(S1A-S1C图)。由于OtUBD缺乏半胱氨酸残基,我们在OtUBD序列的氨基末端引入了半胱氨酸残基作为功能手柄,可以与市售的SulfoLink树脂反应以形成稳定的硫醚键(图2A)。作为阴性对照,将游离半胱氨酸添加到SulfoLink树脂中以封住活性碘乙酰基团。当与在具有300mM NaCl和0.5%Triton-X100洗涤剂的缓冲液中制备的酵母全细胞裂解物一起孵育时,OtUBD树脂结合广泛的泛素化蛋白,并且结合的蛋白质可以用低pH缓冲液洗脱(图2BS1D;参见材料和方法)。在对照树脂的洗脱液中未检测到泛素化物质(图2BS1D)。

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图 2. 共价连接的OtUBD树脂从酵母裂解物中纯化泛素和泛素化蛋白质。

(A)OtUBD结构用于共价偶联到树脂及其偶联反应的机理。OtUBD氨基末端的工程半胱氨酸使其能够与SulfoLink树脂共价偶联。(B)使用共价连接的OtUBD树脂或对照树脂从酵母细胞裂解物中抽取的泛素印迹。共价连接的OtUBD树脂有效地从酵母全细胞裂解物中拉出泛素化物质。FT,流通式;E1/E2/E3,使用一系列逐步、低 pH 洗脱的馏分。(C、 D)使用M48 DUB进行提取物预处理可从泛素化物质中切割泛素,并大大减少OtUBD树脂拉低的总蛋白质。(C)使用或不进行M48 DUB处理的酵母裂解物OtUBD的抗泛素印迹。(D)在用SYPRO Ruby染色可视化的OtUBD下拉的洗脱部分中存在的总蛋白。(C和D来自2个独立的生物重复。输入, 输入;FT,流通;E,洗脱的馏分。(英、英)OtUBD中的V203D突变极大地损害了其泛素的结合,阻止了酵母裂解物中泛素化物质的富集。(E)使用OtUBD树脂,Cys树脂(阴性对照)和OtUBD(V203D)树脂对酵母裂解物的拉下拉的抗泛素印迹。(F)在用SYPRO Ruby染色可视化的OtUBD下拉的洗脱部分中存在的总蛋白。输入, 输入;FT,流通;E1/2/3,使用一系列低pH洗脱洗脱的级分。MBP,麦芽糖结合蛋白;OtDUB, O.津津龟配音。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.g002

通过将图2B中的抗泛素印迹与S1D图中相同洗脱级分的一般蛋白质染色剂进行比较,很明显,从OtUBD树脂中洗脱的许多蛋白质本身并没有泛素化。在天然或接近天然条件下进行的下拉实验有望共纯化与泛素化多肽非共价相互作用的蛋白质,例如,含有泛素化亚基的复合物。为了测试从OtUBD树脂中洗脱的整个蛋白质群体是否仍然依赖于底物泛素化,酵母裂解物与病毒M48 DUB一起预先孵化,该病毒切割了广泛的泛素化蛋白,并将泛素链还原为游离泛素(图2C)[47]。与从未经处理的裂解物中拉出相比,该处理大大减少了从OtUBD树脂中洗脱的总蛋白质(图2D),表明从OtUBD树脂中洗脱的大多数蛋白质要么自身泛素化,要么与泛素或泛素化蛋白质非价相互作用。

为了进一步验证OtUBD树脂对泛素化蛋白质的特异性,我们制造了一种具有泛素结合缺陷突变(V203D)的OtUBD树脂[41],并测试了其纯化泛素和泛素化蛋白的能力。这种突变大大降低了树脂富集泛素化物质的能力(图2E),并且还强烈降低了树脂中的总蛋白质洗脱液(图2F)。这表明OtUBD树脂富集泛素化物质的能力基于其与泛素的结合亲和力。

综上所述,这些结果表明OtUBD树脂特异性地富集了泛素和泛素化多肽以及与含泛素蛋白质相互作用的蛋白质。

使用OtUBD与变性提取物进行纯化可富集泛素 - 蛋白质偶联物

为了区分泛素共价修饰的蛋白质和通过与泛素或泛素化蛋白质的非共价相互作用共纯化的蛋白质,我们优化了下拉条件以包括变性步骤(图3A)。将酵母裂解物与8M尿素(大多数蛋白质展开的情况)一起孵育,以解离蛋白质复合物[48]。然后用天然裂解缓冲液稀释变性的裂解物(最终尿素浓度为4M)以促进泛素的重折叠并施加到OtUBD树脂上。以前在使用FK2单克隆抗体的泛素免疫沉淀中使用过类似的方法[20]。在这种情况下,OtUBD树脂浓缩了泛素化蛋白质,其效率与天然条件下的效率相似(图3C)。同时,与天然条件相比,变性处理大大减少了洗脱的蛋白质总量,纯化蛋白质种类的谱也发生了变化(图3D)。这表明泛素化蛋白质通过尿素处理特异性富集。

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图 3. OtUBD在变性条件下下拉特别富集了用泛素共价修饰的蛋白质。

(A) 在样品变性(红色箭头)或原生(蓝色箭头)条件下,OtUBD下拉的工作流程。在第一种情况下,用8M尿素处理细胞裂解物以使蛋白质变性和解离。然后将变性的裂解物用天然缓冲液1:1稀释,以使泛素重新折叠并与OtUBD树脂结合。在这种情况下,只有泛素化的蛋白质有望被富集。在第二种情况下,细胞裂解物含有天然的泛素化蛋白质以及与它们相互作用的蛋白质。在这种情况下,OtUBD下拉有望产生泛素化底物和泛素结合蛋白。(二)串联公司使用概要2+树脂下拉以验证不同条件下的 OtUBD 下拉结果。裂解物与变性剂(红色箭头)孵育或未处理(蓝色箭头)后,从OtUBD中洗脱出来的洗脱物用变性剂(8 M尿素或6 M胍•HCl)处理,然后用Co进行IMAC2+变性条件下的树脂。由 His 共价修饰的蛋白质6-泛素与 Co 结合2+树脂,而仅与泛素非共价相互作用的蛋白质最终在流通中。(C)在如图3A.FT所示进行的天然和尿素变性处理后,OtUBD下拉的抗泛素印迹;E,洗脱的馏分。图像被拼接以删除不相关的车道。(D)在图3C中通过SYPRO Ruby染色可视化的OtUBD下拉的洗脱液中存在的总蛋白。(E)总蛋白存在于Co的不同部分2+IMAC(见图3B;这里显示的结果使用尿素作为变性剂)通过SYPRO Ruby染色可视化。输入, 输入;FT,流通;E、用500 mM咪唑洗脱的馏分。(F) 来自 Co 的馏分的抗泛素印迹2+IMAC(见图3B;此处显示的印迹使用尿素作为变性剂)从天然和变性OtUBD树脂下拉的洗脱物中。输入, 输入;FT,流通;E、用500 mM咪唑洗脱的馏分。*在从本地提取物流出的突出的大约20 kDa物种的身份尚不清楚。(G)在天然或变性处理后,如图3A所述从HeLa细胞裂解物中拉出OtUBD的抗泛素印迹。图像被拼接以删除不相关的车道。输入, 输入;FT,流通;E、用低pH洗脱缓冲液洗脱的级分。(H)图3G中洗脱液中存在的总蛋白,由SYPRO Ruby染色可视化。(I)在裂解物的天然和尿素变性处理后OtUBD下拉中人蛋白酶体亚基Rpt6的免疫波特分析。未改性的Rpt6在天然条件下与OtUBD树脂共纯化,但不在提取物变性后。N,原生条件;D、变性情况。OtDUB, O.津津龟配音。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.g003

为了验证变性步骤后的OtUBD下拉对于用泛素共价修饰的蛋白质是特异性的,我们使用了一种酵母菌株,其内源性泛素编码序列全部被删除,取而代之的是单个质粒传播的Hi6-标记的泛素序列[28]。在裂解物变性或非变性处理后进行的OtUBD树脂下拉(图3A)的洗脱级分然后通过与尿素或胍盐酸盐孵育再次变性(图3B)。变性蛋白应用于Co2+(Talon) 树脂,用于固定化金属亲和色谱 (IMAC) 通过 His6-标记泛素。如果从OtUBD树脂中洗脱出来的洗脱液只含有(他的6-)泛素化蛋白质,大部分或全部总蛋白质应与树脂结合。我们观察到,当OtUBD在变性裂解物处理后进行下拉时,大多数洗脱的蛋白质确实与Co结合。2+树脂(图3E)。相比之下,来自“天然”OtUBD下拉的很大一部分蛋白质仍然在Co的流通中。2+树脂(图3E)。然而,在2种处理之间,恢复的泛素化物种的总体水平相当(图3F)。与大量泛素偶联物的这些发现一致,当我们测试与许多多泛素化底物非共价结合的蛋白酶体[49]是否在OtUBD洗脱物中时,我们很容易在天然下拉中检测到未修饰的蛋白酶体亚基,而不是在变性裂解物的拉下拉中(S2A图)。

基于OtUBD的亲和力纯化,在天然或变性条件下,对人类细胞裂解物也有效。这两种条件都导致泛素偶联物的相似富集(图3G),但变性预处理大大减少了共纯化非泛素化蛋白的量(图3H)。与此一致,非泛素化的人类蛋白酶体亚基仅在天然裂解物的洗脱物中存在大量水平(图3IS2B)。有趣的是,在OtUBD从天然和变性裂解物的拉取中发现了少量的假定泛素化蛋白酶体亚基,并且在后一种情况下,这些物种在未修饰的亚基上强烈富集(S2B图)。

总体而言,这些结果表明,在变性条件下基于OtUBD的蛋白质纯化可以特异性地富集被泛素共价修饰的蛋白质。

OtUBD与其他富泛素试剂的比较

在为基于OtUBD的泛素富集开发了天然和变性方案后,我们决定将我们的新方法与基于其他UBD或TUBE的现有泛素富集试剂并排比较。Dsk2是一种酵母蛋白,其羧基末端含有泛素相关结构域(UBA)[50]。其结合泛素化蛋白的能力已被利用在泛素富集试剂GST-Dsk2中,该试剂已成功用于研究DNA损伤诱导的RNA聚合酶-II的泛素化[5152]。为了直接比较Dsk2和OtUBD,我们设计了一个N端半胱氨酸残基作为手柄,将Dsk2与SulfoLink树脂偶联。此外,前面提到的TUBE TR-TUBE[23],以及它所基于的单体UBD(人Ubiquilin 1的UBA结构域的胰蛋白酶抗性变体;我们将称之为TR-UBA)也同样设计用于树脂偶联并与OtUBD进行比较。(巧合的是,对我们有利,这些蛋白质最初都不含半胱氨酸残基。

在共价将等摩尔量的不同泛素亲和试剂附着到SulfoLink树脂上后,我们测试了它们在天然和变性条件下从酵母全细胞裂解物中富集泛素化物质的能力。在天然条件下,当使用足够量的树脂时,Dsk2,TR-TUBE和OtUBD都有效地从全细胞裂解物中拉出大多数泛素化物种;即使使用大量树脂,TR-UBA的效率也要低得多(图4A)。OtUBD和TR-TUBE树脂在测试的最低树脂量下显示出相同的效率。尽管Dsk2仅含有一个UBA结构域,但当使用足够量的树脂时,它能够有效地纯化聚泛素化蛋白质,这与其对聚泛素的高亲和力一致[50]。我们还测试了一批旧批OtUBD树脂,该树脂已在4°C下储存约一年,其性能与新鲜制备的OtUBD树脂相似,证明了该树脂具有出色的保质期(图4A,最后2个泳道)。引人注目的是,当前面描述的裂解物变性预处理与不同的树脂一起使用时,只有OtUBD可以有效地富集泛素化物质(图4B)。与OtDUB相比,TR-TUBE在这种条件下仅部分富集了泛素化底物,而Dsk2和TR-UBA几乎没有拉低任何泛素化蛋白质。

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图 4. OtUBD与其他泛素富集试剂的比较。

(A)在天然条件下使用不同的UBD / TUBE基试剂从酵母全细胞裂解物中提取泛素的抗泛素免疫印迹。每次下拉时使用含有1mg总蛋白的酵母全细胞裂解物。通过将树脂与SDS样品缓冲液孵育来实现洗脱。(B)裂解物变性后使用不同的UBD / TUBE基试剂从酵母全细胞裂解物中提取泛素的抗泛素免疫印迹。每次下拉时使用含有1mg总蛋白的酵母全细胞裂解物。通过将树脂与SDS样品缓冲液孵育来实现洗脱。(C)OtUBD的反标志免疫印迹和TUBE从WT,bre1Δubp8Δ酵母的裂解物中提取,表达标志标记的组蛋白H2B。OtUBD树脂,但不是来自WT和ubp8Δ酵母的全细胞裂解物的管结合的单泛素化组蛋白H2B。输入, 输入;UBD,从OtUBD下拉中洗脱的部分;管,从管下拉中洗脱的部分。通过将树脂与SDS样品缓冲液孵育来实现洗脱。(D)使用来自表达标记组蛋白H2B的ubp8Δ酵母裂解物的不同UBD / TUBE基试剂的抗标志免疫下拉的免疫光圈。只有OtUBD树脂能够与单泛素化的组蛋白H2B可检测结合。(E)酵母Rpt5的蛋白质印迹来自rpt2-P103A rpt5-P76Arpt25PA)突变酵母裂解物在不同条件下使用不同的泛素亲和力树脂。N,在原生条件下执行的下拉;D1,如图3A所述对裂解物进行8M尿素处理后进行的下拉;D2,用裂解液直接在含有8M尿素的缓冲液中提取进行下拉。(F)天然HeLa细胞裂解物的RNAPII亚基Rpb1的蛋白质印迹分析和Dsk2下拉。用4-NQO处理细胞以诱导RNAPII泛素化。(G)OtUBD中RNAPII亚基Rpb1的蛋白质印迹分析以及变性HeLa细胞裂解物的Dsk2下拉。用4-NQO处理细胞以诱导RNAPII泛素化。OtDUB, O.津津龟配音;TUBE,串联泛素结合实体;UBD,泛素结合结构域;WT,野生型;4-NQO, 4-硝基喹啉-1-氧化物.

 

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.g004

然后,我们比较了不同树脂检测目标特定蛋白质的泛素化形式的能力。组蛋白H2B由泛素E3连接酶Bre1单泛素化,并由DUB Ubp8在酵母中脱泛素化[4553]。组蛋白H2B的单泛素化衍生物难以在整个细胞裂解物中直接检测,因为与未修饰的H2B相比,其丰度较低(图4C)。为了确定OtUBD树脂是否有助于检测单泛素化的H2B,我们使用OtUBD树脂从表达Flag标记组蛋白H2B的野生型(WT),bre1Δubp8Δ酵母菌株的细胞裂解物中纯化总泛素化蛋白,然后通过免疫印迹分析蛋白质。在WT和ubp8Δ酵母中检测到反标志免疫印迹中较慢的迁移带,其代表单泛素化的H2B,但在bre1Δ酵母中未检测到(图4C)。相比之下,TR-TUBE树脂未能在任何酵母样品中捕获单泛素化的H2B,包括由于UBP8缺失而具有升高的H2B单泛素化水平的酵母样品(图4C)。我们还测试了我们制造的任何其他树脂是否能够在ubp8Δ酵母裂解物中捕获单泛素化的组蛋白H2B,发现Dsk2和TR-UBA都不能(图4D)。因此,尽管Dsk2和TR-TUBE树脂都可以有效地从酵母裂解物中富集本体泛素化物质(图4A),但这些试剂检测某些单泛素化蛋白质的能力可能受到限制。这些结果再次强调了OtUBD相对于其他UBD或TUBE在研究单泛素化底物方面的潜在优势。

研究小组先前在酵母蛋白酶体亚基Rpt2和Rpt5(菌株“rpt2,5PA”)中发现了Pro-to-Ala突变,这些突变导致它们在正常生长条件下被错误折叠和泛素化[54]。在这项研究中,通过在蛋白酶体突变酵母菌株中过表达His标记的泛素并在变性条件下进行IMAC以捕获泛素化物种,证实了Rpt亚基的泛素化。我们使用rpt25PA酵母裂解物进行OtUBD和TUBE下拉,而不会产生泛素过表达。基于抗Rpt5免疫印迹,两种树脂都捕获了质量较高的Rpt5PA物种的涂片,这些物种可能是内源性多泛素化的Rpt5PA物种(图4E)。未修饰的Rpt5PA在天然条件下与OtUBD和TUBE共纯化,但在裂解物变性后的两次下拉中都在很大程度上被消除。在天然条件下,OtUBD和TUBE都纯化了相似量的泛素化Rpt5PA(图4E,泳道4和5),而在变性条件下,OtUBD捕获了更多的泛素化物种,特别是在较低分子量范围内(图4E,泳道6至9)。与TUBE下拉相比,OtUBD下拉捕获了另一个迁移速度较慢的Rpt5PA物种,根据表观分子质量,它可能是单泛素化的Rpt5PA。在该实验中,我们还发现,与首先用天然缓冲液提取裂解物然后用添加尿素变性(条件D1)提取裂解物相比,直接用尿素缓冲液(条件D2)提取的变性裂解物给予更多的泛素化Rpt5PA。预计前一种方法将溶解通常沉淀的泛素化物种。

作为单蛋白分析的最后一个例子,我们使用OtUBD来检测培养的人细胞中泛素化的RNA聚合酶II(RNAPII)。RNAPII在紫外线诱导的DNA损伤后变得泛化[55]。Rpb1是RNAPII的最大亚基,在这样的条件下被严重泛素化[56]。我们用化学4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)处理HeLa细胞,其模仿紫外线对DNA的生物学效应(57),并对天然(图4F)和变性(图4G)裂解物进行OtUBD和Dsk2下拉,每种树脂的饱和量(如图4A中确定)。在这两种情况下,OtUBD下拉在通过抗Rpb1免疫印迹分析时捕获了类似的较慢迁移条带。由于Rpb1是一种超过200 kDa的大蛋白,并且以不同的磷酸化状态存在,因此很难根据通过SDS-PAGE凝胶迁移来区分非泛素化和单泛素化物种[58]。在这种情况下,OtUBD在变性条件下下拉提供了信心,即使在基础条件下,Rpb1也无处不在,并且在用4-NQO处理时变得严重泛素化(图4G)。与OtUBD相比,Dsk2下拉在这两种情况下捕获的泛素化Rpb1要少得多。2种试剂可能根据观察到的条带的外观潜在地捕获不同的泛素化Rpb1群体(图4F)。

这些例子说明了OtUBD树脂如何促进酵母和人类细胞中单泛素化和多泛素化蛋白质的检测。重要的是,在几个不同的例子中,OtUBD证明了其优于所研究的其他基于UBD / TUBE的试剂的优势,特别是在其捕获单泛素化蛋白质和在蛋白质变性后结合泛素化物种的能力方面。

OtUBD-酵母和人泛素组和泛素相互作用组的下拉式蛋白质组学分析

通过比较天然和变性细胞裂解物的OtUBD提取,我们可以潜在地区分生物样品中不同的泛素相关蛋白质组。“泛素组”,即共价泛素化蛋白质的集合,可以定义为从与变性细胞提取物一起使用的OtUBD亲和力树脂中洗脱的蛋白质群体。“泛素相互作用组”可以大致定义为那些在从天然提取物中提取OtUBD后特别富集的蛋白质,而不是从变性裂解物中下拉的蛋白质(图3A)。值得注意的是,后一种定义将排除蛋白质亚群被泛素化的情况,而同一蛋白质的非泛素化群体与泛素或其他泛素化蛋白非共价相互作用的情况。例如,已知一些蛋白酶体亚基是泛素化的[59],但这些亚基未修饰的蛋白酶体颗粒仍然与泛素化蛋白非共价相互作用。诸如这些蛋白酶体亚基之类的蛋白质将从此处定义的泛素相互作用组中排除。然而,这些定义提供了泛素组和泛素相互作用组的一般情况。

我们对具有和不具有先前变性的全酵母裂解物进行了OtUBD下拉(S3A–S3C图),并使用霰弹枪蛋白质组学分析了洗脱液。所使用的树脂量是预先确定的,以避免结合能力的饱和。对于每种情况,我们包括2个生物重复,对于每个生物重复,2个LC-MS / MS运行的技术重复。通过不使用OtUBD的SulfoLink树脂进行控制下拉,以消除与树脂非特异性结合的蛋白质。正如在早期实验中看到的那样,对照下拉没有产生可检测的泛素化物种,只有微量的蛋白质(S3A-S3C图)。部分由于先前运行中高丰度肽的残留,在对照下拉重复(S3D图)的子集中鉴定出一些蛋白质,但是与OtUBD下拉样品(S3E图)相比,这些对照样品中的蛋白质总量(TIC(总离子电流))要低得多).因此,对于每个生物重复,只有OtUBD下拉样品中存在明显较高水平(>20倍)的蛋白质才被视为真正的命中(S3F FigS2 Data)。

2个下拉条件产生了相似的蛋白质总数(图5A),蛋白质身份的主要重叠。超过400种蛋白质仅在天然条件下被发现,这表明它们本身不是泛素化的,而是与泛素或泛素化的蛋白质共纯化。有趣的是,仅在变性条件下才鉴定出600多种蛋白质。由于裂解物变性后的OtUBD下拉产生的总蛋白比在天然条件下少得多(S3C图),因此在LC-MS / MS分析中鉴定低丰度蛋白的可能性可能会增加。

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图 5. OtUBD下拉蛋白质组学可以分析酵母和人类细胞的泛素组和泛素相互作用组。

(A)通过OtUBD下拉蛋白质组学鉴定的酵母蛋白的维恩图,在非变性或尿素变性处理下拉下进行下拉。在变性条件下,在OtUBD下拉列表中鉴定的蛋白质集合被定义为泛素组(蓝色轮廓)。仅在天然OtUBD下拉列表中鉴定的蛋白质集合被定义为泛素相互作用组(紫色轮廓)。(B)维恩图,比较了OtUBD下拉蛋白质组学定义的酵母泛素组与先前使用双Gly抗体IP方法的3项研究[60-62]。(C、 D)基于GO分析的OtUBD下拉定义酵母泛素组(C)和泛素相互作用组(D)中涉及的主要生物学途径。支持这些面板的数值可以在 S3 Data 中找到。(E)维恩图,比较了OtUBD下拉和FK2抗体IP定义的人类泛素组。(F)维恩图比较了由diGly抗体[63]和基于TUBE的富集[64]定义的已发表的人类泛素组和本研究中获得的OtUBD定义的泛素组。GO,基因本体论;OtDUB, O.津津龟配音;TUBE,串联泛素结合实体。

 

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我们使用基于双Gly残留抗体的方法将OtUBD定义的酵母泛素组与先前发表的研究数据进行了比较(图5B)[60-62]。我们的研究确定了1,811种泛素化酵母蛋白,这是这里比较的4项研究中第二高的数字。据报道,在我们的研究中鉴定出的蛋白质中,约有三分之二被这些基于双Gly抗体的研究中的至少一项泛素化。在这项研究中,大约600种泛素化蛋白质被唯一鉴定出来。其中一些可能涉及非规范的泛素化,其中泛素修饰剂共价附着在赖氨酸以外的底物上的亲核残基上[3]。

GO分析表明,由OtDUB结合定义的酵母泛素组跨越来自各种细胞过程的蛋白质,包括多种生物合成途径,蛋白质定位,囊泡介导的运输和蛋白质质量控制途径(图5C)。相比之下,如上所述,泛素相互作用组似乎在核酸相关过程中产生更大的代表性,例如DNA复制,RNA转录,核糖体生物发生和非编码RNA处理(图5D)。

我们还使用变性的HeLa细胞裂解物进行了OtUBD下拉,并使用FK2抗泛素单克隆抗体进行免疫沉淀,该抗体已成功用于类似的变性方案[20]。分析了3个生物重复,每个重复2个LC-MS / MS运行的技术重复。OtUBD树脂高效且一致地富集来自HeLa细胞裂解物的泛素化蛋白。相比之下,我们观察到不同批次的FK2抗体具有不同的富集效率;这在使用不同批次的抗体(S4A和S4B图)的2个生物重复的FK2免疫沉淀的流通部分中存在的泛素化物种的数量以及在每个生物复制中鉴定的蛋白质总数中是显而易见的。这可能是由于不同批次的抗体质量不一致或抗体固定效率不一致造成的。由FK2抗体树脂鉴定的大多数泛素化蛋白质也在OtUBD树脂鉴定的泛素化蛋白质组中被发现(图5E)。与FK2免疫沉淀相比,OtUBD下拉法鉴定出约1,000种额外的泛素化蛋白,其中大多数在先前使用diGly抗体的研究中至少有一个报告的泛素化位点[63]。

我们还将我们的结果与基于TUBE或基于diGly抗体的富集方法的已发表数据进行了比较。对于人类泛素组的发现,使用相同富集方法的不同研究在检测到的蛋白质总数中产生了很大范围[35]。由于人类泛素组比酵母泛素组复杂得多,因此可以影响蛋白质鉴定深度的蛋白质组学方法和实践将更强烈地影响人类细胞的整体结果(参见讨论中的示例)。因此,比较不同研究中鉴定的蛋白质数量不仅会反映不同泛素富集方法的相对效率,还会反映蛋白质组学方法和细胞培养条件的差异。

考虑到这一警告,我们将鉴定总数和泛素化蛋白质的鉴定和身份与分别使用diGly抗体富集[63]和TUBE方法[64]描述人类泛素组的已发表数据集进行了比较(图5F)。Elia及其同事基于diGly的结果,在我们检查的不同diGly文献中发现了数量最多的泛素化蛋白质,与我们的研究和基于TUBE的研究相比,包含的泛素化蛋白质的总数要高得多,后者产生了相似数量的总蛋白质。与基于TUBE的鉴定相比,我们的数据总体上显示出与基于diGly抗体的结果更大的重叠 - 在我们的分析中检测到的77%的蛋白质和TUBE研究中检测到的58%的蛋白质得到了基于diGly抗体的研究中报道的至少一种含diGly残留物的肽的支持。对基于TUBE的富集的一致性较低的一种解释是,它是在天然条件下完成的,因此可能包括许多与泛素或泛素化蛋白共纯化的非泛素化多肽。

这些实验表明,OtUBD亲和力树脂可用于分析酵母和人类细胞的泛素化蛋白质组。此外,在酵母蛋白质组学(S4C图)中鉴定出所有7个赖氨酸泛素 - 泛素键合,并且它们的比率与先前相对键合频率的定量研究大致一致[4],表明这些不同赖氨酸键的相对无偏富集。这种对链键的明显漠不关心的分子基础是不确定的。先前通过 OtUBD 与单体泛素结合的等温量热分析显示,K 为 1:1 的复合物d约5 nM;由K48或K63连接连接的泛素二聚体非常紧密地结合,阻止了通过这种方法准确测定其解离常数[41]。OtUBD可能以高亲和力与所有链类型中的远端泛素结合,导致不同多泛素链的无偏富集,以及非规范泛素化的检测。除了K33泛素-泛素键外,所有噬菌素都已在HeLa细胞蛋白质组学中被鉴定出来。我们注意到K33是一种低丰度连锁[4],并且使用可以增加识别深度的技术,例如LC-MS / MS之前的正交分馏步骤,可能会允许其检测。

OtUBD和无标记定量能够鉴定潜在的E3连接酶底物

最后,我们试图应用OtUBD下拉蛋白质组学来鉴定特定E3泛素连接酶的底物。由于E3-底物相互作用的瞬时性以及许多泛素化蛋白的低丰度和不稳定性,鉴定特定E3连接酶的底物可能具有挑战性[65]。筛选潜在底物的一种方法是比较具有和没有(或具有降低的水平/功能)的细胞的泛素组[66]。与缺乏E3的细胞相比,表达E3的细胞中具有较高泛素化水平的蛋白质将是候选底物。我们使用OtUBD下拉蛋白质组学比较野生型BY4741酵母的泛素组和从酵母基因敲除库获得的2种同源E3缺失菌株bre1Δpib1Δ[67]。Bre1是一种特征相对良好的E3连接酶,单泛泛化组蛋白H2B[53]。这种泛素化不会导致H2B蛋白水解,但参与重要的染色体过程,包括转录和DNA损伤修复[68]。Bre1的其他底物在很大程度上是未知的[69]。Pib1是一种研究较少的E3连接酶,其局限于内体和液泡,并参与内体分选[70]。

我们收获了WT,bre1Δpib1Δ酵母细胞,并在裂解物变性后进行了OtUBD下拉。从OtUBD树脂中洗脱的蛋白质进行无标记定量蛋白质组学(图6AS5A和S5B)。检查每组3个生物重复,并通过2个单独的LC-MS / MS运行分析每个重复。在分析样品中归一化后使用总TIC进行定量。正如预期的那样,组蛋白H2B(鉴定为Htb2)在WT细胞的泛素组中的呈现水平比bre1Δ细胞高得多(图6B)。有趣的是,我们在不同样品(图6C,S6A和S6B)中发现了组蛋白H2B(Htb2)上的2个不同的泛素化位点。K123泛素化位点是在组蛋白H2B上Bre1的主要泛素化位点[7172],在WT细胞中检测到,但在bre1Δ细胞中未检测到。相比之下,另一个泛素化位点K111出现在WT和bre1Δ细胞中。这表明除了Bre1之外,还有一种E3连接酶在K111上普遍存在组蛋白H2B。尽管这种泛素化位点已经在一项基于diGly抗体的蛋白质组学研究中报道过[61],但其功能仍有待研究。除了组蛋白H2B之外,我们还鉴定出与bre1Δ细胞相比,WT细胞泛素组中存在的16种其他蛋白质水平显着更高(图6D)。此外,在WT细胞的泛素组中专门检测到35种蛋白质(图6E)。综上所述,这些蛋白质被认为是潜在的Bre1底物。有趣的是,在早期的一项研究[73]中,这些蛋白质中的一些(图6D和6E,绿色)已被证明在bre1Δ细胞中具有代谢稳定性,这表明它们可能是Bre1的直接或间接蛋白水解泛素化底物。

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图 6. 通过 OtUBD 下拉和无标记定量鉴定潜在的 E3 底物。

(A)使用OtUBD下拉和定量蛋白质组学鉴定E3底物的方案。WT和E3缺失(bre1Δpib1Δ)酵母菌株在提取物变性后进行OtUBD下拉。然后通过无标记定量分析洗脱的蛋白质。(B)比较WT和bre1Δ样本的火山图。橙色点表示与bre1Δ样品相比,在WT样品中显着富集的蛋白质。水平虚线表示 p = 0.05。垂直虚线表示 +/− 1.5 倍的相对变化。支持此图的数值可在 S2 数据中找到。(C)在不同样品中组蛋白H2B(Htb2)上鉴定出两个不同的泛素化位点。(D)bre1Δ样品(B中的橙色点)相比,WT样品中显着富集的蛋白质列表。绿色表示先前报道在bre1Δ酵母中稳定的蛋白质。(E)仅在WT中检测到的泛素化蛋白,而不是bre1Δ样品。绿色表示先前报道的蛋白质在bre1Δ细胞中稳定。(F) 比较 WT 和 pib1Δ 样本的火山图。橙色点表示与pib1Δ样品相比,在WT样品中显着富集的蛋白质。水平虚线表示 p = 0.05。垂直虚线表示 +/− 1.5 倍的相对变化。支持此图的数值可在 S2 数据中找到。(G)pib1Δ样品相比,WT样品中显着富集的蛋白质列表(F中的橙色点)。绿色表示先前报道在pib1Δ酵母中稳定的蛋白质。(H)仅在WT中检测到的泛素化蛋白,而不是pib1Δ样品。绿色表示先前报道的蛋白质在pib1Δ酵母中稳定。OtDUB, O.津津龟配音;WT,野生型。

 

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与Bre1数据类似,我们鉴定了3种蛋白质,其泛素化形式在WT细胞中与pib1Δ细胞(图6F和6G)相比在显着更高的水平上被发现,并且在WT细胞中可检测到泛素化但未在pib1Δ细胞中检测到的38种蛋白质(图6H)。在这些蛋白质中,6种先前已被证明在pib1Δ细胞中稳定(图6G和6H,绿色)[73]。

这些潜在的E3底物是被测E3的直接或间接泛素化底物,将需要通过生化测定进行验证。尽管如此,我们的研究结果表明,OtUBD可用于定量分析泛素组,这将有助于鉴定E3连接酶和其他泛素相关酶(如E2s和DUBs)的新型底物。

在从OtUBD下拉列表中获得的各种蛋白质组学数据中,我们观察到Mascot搜索算法(S2 Data)分配的许多潜在的非赖氨酸泛素化位点,证实了OtUBD可能具有非赖氨酸泛素化位点来富集蛋白质的观点。(请注意,在此列表中,搜索算法的GG肽分配尚未经过验证,将包括一些不准确的分配。需要进一步验证以确认任何单个分配。我们通过手动验证频谱分配(S6C图)确认了其中一个站点。

讨论

蛋白质泛素化继续引起人们的极大兴趣,因为它对许多基本的细胞过程及其在人类疾病中的重要作用。许多参与泛素化的酶正在被追捧为治疗的靶标[7475]。例如,许多靶向E3连接酶的候选药物(如MDM2和XIAP)已进入治疗多种类型癌症的临床试验[76]。已经开发出多种试剂和方法来研究泛素化或泛素化相关过程,但这些方法都有局限性[1639]。例如,TUBE在检测多泛素链方面是有效的,但这会产生对多泛素化底物的偏倚;它们通常无法检测到蛋白质单泛素化信号(例如,图4C和4D),这些信号可以在至少一些哺乳动物细胞类型中主导泛素组[17]。因此,仍然需要新的和经济的试剂和方法来分析许多类型的泛素修饰,特别是当这些修饰以非常低的水平存在时。

O的多功能高亲和力UBD结构域。津津龟DUB 提供的泛素亲和试剂与现有工具相比具有多项优势。首先,使用从大肠杆菌中表达和纯化的小型重组OtUBD蛋白来生成亲和力树脂是简单且相对便宜的。其次,使用sOtUBD的泛素富集适用于单泛素化和多泛素化,这与TUBe和其他基于UBD的试剂(例如我们测试的试剂)的偏倚相反(图4D)。第三,OtUBD下拉可以在天然条件下进行,用于研究泛素化底物和与它们非共价相关的蛋白质;或者,通过在下拉之前使提取物处于变性状态,OtUBD下拉可以调整为由泛素共价修饰的蛋白质。我们证明,OtUBD下拉,结合蛋白质组学,可用于分析酵母和哺乳动物细胞的泛素化蛋白质组;毫无疑问,它也可以用来表征其他真核细胞的泛素组。第四,比较OtUBD下拉蛋白质组学可用于鉴定泛素化酶(E2s或E3s)的底物,如图所示,或DUBs。最后,与针对Lys侧链上的diGly残留物特异性的抗diGly免疫亲和力工具不同,基于OtUBD的纯化可能有助于识别非规范的泛素 - 蛋白质键,例如通过Cys,Ser或Thr侧链,N端氨基或不涉及泛素羧基末端的化学键,如由军团菌Side蛋白介导的泛素化[37778]。还应该能够富集泛素与蛋白质以外的大分子的联系,例如最近发现的沙门氏菌感染期间形成的泛素-脂多糖加合物[40]。

我们已经证明,OtUBD对泛素和泛素化蛋白具有特异性。但是,应注意一些注意事项。尽管提取液变性后的OtUBD下拉显着减少了与泛素化蛋白共纯化的相互作用蛋白的数量,但在某些情况下,少量非共价相互作用的蛋白仍可能被共纯化(例如,S2B图)。其他严格的洗涤步骤可能有助于缓解此问题。OtUBD还与密切相关的泛素样修饰剂Nedd8结合,尽管其亲和力远低于泛素[41]。与泛素一样,Nedd8用于蛋白质翻译后修饰[79],并且由于胰蛋白酶消化后它们会留下相同的-GG残留物,因此使用正常的diGly抗体方法很难区分2种修饰因子[16]。我们在蛋白质组学研究中寻找潜在的奈二甲酰化底物。在OtUBD定义的泛素组中检测到Rub1(酵母Nedd8),Cdc53,Rtt101和Cul3(3种据报道经历奈度化[80]的酵母库林蛋白[80]),其可能通过Nedd8结合在OtUBD树脂上富集。然而,与泛素化相比,奈二甲酰化发生在低得多的水平上[37],并且根据我们进行的特异性分析(图2D3E),雾化蛋白(如果有的话)应该只占富含OtUBD的蛋白质组的一小部分。

在我们的OtUBD下拉蛋白质组学实验中,鉴定出的泛素化酵母蛋白的总数与先前使用双Gly抗体富集方法的研究相当[60-62]。对于人类细胞的分析,OtUBD下拉式在我们手中的表现优于FK2抗体免疫沉淀,无论是在整体效率和可重复性方面。来自不同批次的抗体性能不一致一直是一个被广泛认可的问题[81]。相比之下,重组OtUBD在不同批次中似乎是一致的,并且在长期储存期间也是稳定的。由于与酵母泛素组相比,人类泛素组要复杂得多,蛋白质组学鉴定深度极大地影响了每项研究中发现的泛素化蛋白质的总数[35]。因此,很难解释将我们的人类泛素组数据与其他研究的已发表数据进行比较的结果。

优化我们的蛋白质组学管道可能会增加已鉴定的泛素化蛋白质和泛素化位点的数量,特别是对于低丰度蛋白质。在一篇对基于TUBE的富集方法ThUBD与人细胞裂解物[46]进行基准测试的论文中,作者最初在胰蛋白酶消化和LC-MS / MS之前通过SDS-PAGE分馏洗脱的蛋白质;他们在富含TUBE的样品中鉴定出1,663种泛素化蛋白质。在LC-MS / MS运行之前切换到基于正交LC的消化肽分馏,作者能够将其总体鉴定增加到7,000多种蛋白质,突出了蛋白质组学方法在泛素组表征中的强大影响。在我们分析的样品中,来自泛素的肽占鉴定肽总数的显着百分比。这可能抑制了低丰度肽的检测,特别是那些具有相似保留时间的肽。在LC-MS/MS之前从洗脱的样品中预清除游离泛素,例如通过凝胶分离或游离泛素特异性亲和力消耗[82],可能会减少这个问题。或者,在LC-MS / MS之前对蛋白质或肽样品进行分级分离也应该提高整体发现率。

基于OtUBD的泛素纯化可以与有效富集某些泛素化物种的方法结合使用。例如,OtUBD下拉可以在双Gly抗体免疫沉淀之前进行。当对来自整个细胞蛋白质组的巨大肽池进行时,di-Gly抗体IP通常需要分批或多轮进行,以确保有效的富集[63]。初步的OtUBD下拉步骤将显着富集样品中的泛素化底物,而不会产生对多泛素化物种的任何偏倚。这将大大增加消化样品中存在的二Gly连接肽的百分比。由于OtUBD对游离泛素具有极高的亲和力,因此它也可以与Ub-Clipping技术一起使用[83]。在Ub-Clipping中,泛素化蛋白质在泛素化位点被蛋白酶Lb-Pro切割,以产生双Gly连接的单泛素物种和游离泛素1-74.这些物种携带有关泛素链拓扑和泛素翻译后修饰的信息,可以通过MS分析破译。可以很容易地设想为其他应用程序部署OtUBD。

随着OtUBD-泛素结合和OtUBD晶体结构的表征[41],人们可以想象进一步的修改,以适应或增强OtUBD用于其他用途。例如,可以进行定向进化或基于结构的合理诱变,以改变OtUBD对泛素,特异性泛素链或泛素样蛋白的结合特异性。OtUBD可以通过在其上安装荧光基团或其他功能手柄来制造其他泛素检测工具。作为一种多功能且易于制备的重组蛋白试剂,OtUBD将成为泛素研究工具箱的经济补充。

材料和方法

质粒和DNA克隆

3xOtUBD的编码序列由Genscript USA合成。pRSET-4xTR-TUBE是Yasushi Saeki(Addgene质粒#110312)的礼物[43]。pRT498载体,一种从pET42b修饰而来的细菌表达质粒,包括N端His6-MBP具有可切割的TEV位点,用于表达我们实验室制造的MBP和MBP融合蛋白。pET21a和pET42b载体用于表达他的6-标记细菌中的蛋白质。本研究中使用的质粒和引物以及插入片段在S1 Data中有详细描述。所有PCR反应均使用Phusion高保真DNA聚合酶(新英格兰生物实验室)完成。

酵母菌株和生长

使用的酵母菌株列在S1数据中。酵母培养物在酵母提取物 - 蛋白胨 - 葡萄糖(YPD)培养基中生长过夜至饱和。第二天,将培养物在新鲜的YPD中稀释至OD6000.1至0.2,在30°C下振荡培养,直到达到指数中期(OD6000.8 至 1.2)。将细胞沉淀,用水洗涤,并在液氮中快速冷冻并储存在-80°C直至使用。

哺乳动物细胞培养

HeLa和HEK293T细胞(ATCC)在Dulbecco的改良鹰培养基(Gibco)中培养,并补充了10%的胎牛血清(Gibco)和1%的青霉素 - 链霉素(Gibco)。超过20次传代未使用细胞。为了收获细胞进行实验,除去培养基,并用冷的Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Gibco)洗涤细胞,然后通过刮在冷的DPBS中将其移出。将脱落的细胞在400×g下离心4分钟,并在液氮中快速冷冻。将细胞沉淀储存在-80°C直至使用。

重组蛋白的表达和纯化

重组他的6-标记的蛋白质从罗塞塔(DE3)称量E中纯化。大肠杆菌细胞(Novagen)用适当的质粒转化。细菌细胞在Luria-Bertani(LB)肉汤中生长过夜,补充100μg/ mL氨苄青霉素(用于基于pET21a的质粒)或50μg/ mL卡那霉素(用于基于pRT498和pET42b的质粒),并于第二天早上在补充相应抗生素的新鲜LB肉汤中稀释1/100。当细胞密度达到0.5至0.8 OD时600,通过加入异丙基β-D-1-硫代四乙酸基吡喃糖苷(IPTG)诱导蛋白质产生至终浓度为0.3mM,并在16至18°C下振荡培养细胞过夜。将细菌沉淀并重悬于细菌裂解缓冲液(50 mM Tris•HCl,pH 8.0,300 mM NaCl,10 mM咪唑,2mM新鲜加入的苯基甲基磺酰氟(PMSF))中,补充溶菌酶和DNaseI,在冰上孵育30分钟并使用法式压榨机裂解。为了净化他的6-标记的蛋白质和他的6-MBP标记的蛋白质,裂解物在10,000 rcf下在4°C下离心1小时,然后按照制造商的方案进行Ni-NTA(QIAGEN)亲和纯化。为了进一步净化他的6-标记的OtUBD,Dsk2,TR-UBA或4xTR-TUBE,从Ni-NTA基质中洗脱的蛋白质补充5mM tris(2-羧乙基)膦)(TCEP)(从1M TCEP储液中和到pH 7),浓缩,然后通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)在Superdex 75凝胶过滤柱(Cytiva)上使用FPLC缓冲液(50 mM Tris•HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP)。为了进一步净化他的6-MBP标记的蛋白质,从Ni-NTA树脂中洗脱的蛋白质洗脱液被浓缩并通过FPLC在Superdex 75柱上使用50mM Tris•HCl,pH 7.5,150 mM NaCl缓冲液补充1 mM二硫代糖醇(DTT)进行分馏。

为了使用基于pRT498的质粒纯化OtUBD变体,His6-从Ni-NTA树脂中洗脱的MBP标记的蛋白质按照制造商的方案使用离心过滤装置(Amicon,3000 MWCO)在50 mM Tris•HCl,pH 7.5,150 mM NaCl缓冲液中进行缓冲液交换,并补充10 mM TCEP。添加他标记的TEV蛋白酶以删除他的6-MBP标签,并将混合物在冰上孵育过夜。然后将裂解混合物流过干净的Ni-NTA树脂柱以捕获裂解的Hi6-MBP 标签。将流通物浓缩并使用FPLC缓冲液用Superdex 75色谱柱用FPLC纯化。

如前所述制备M48 DUB蛋白[47]。

将所有蛋白质在液氮中快速冷冻并储存在-80°C直至使用。蛋白质浓度通过SDS-PAGE和GelCode Blue(热)染色或使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准的BCA测定(Thermo)测定。

免疫印迹和抗体

通过SDS-PAGE凝胶分离的蛋白质被转移到Immobilon-P PVDF膜(Millipore)并用3%脱脂牛奶在Tris缓冲盐水中封堵(20mM Tris,150mM NaCl,用HCl调节pH至7.5),0.1%吐温-20(TBST)。首先将膜与在含有1%脱脂牛奶的TBST中稀释的所需一抗在室温下或在4°C下过夜1小时,广泛洗涤,然后与在TBST中稀释的HRP连接的二抗一起孵育,在室温下或在4°C下过夜1小时。

本研究中使用的一抗是兔多克隆抗泛素抗体(Dako,已停产,1:2,000稀释),单克隆小鼠抗泛素抗体P4D1(Enzo,1:1,000),单克隆小鼠抗标志M2(Sigma,1:5,000或1:10,000),单克隆小鼠抗人Rpt6(PSMC5)(Invitrogen,2SU-1B8,1:10,000),单克隆小鼠抗人Rpt4(Enzo,p42-23,1:1,000),小鼠单克隆抗酵母Rpt4(来自W. Tansey的礼物,1:2,500),兔多克隆抗Rpt5(Enzo Life Sciences), 兔多克隆抗Pre6(来自D. Wolf的礼物,1:5,000)和抗Rpb1(RNA Pol II)单克隆小鼠抗体(活性基序,4H8,1:2,000)。对于兔一抗,HRP连接的抗兔IgG二抗(GE Healthcare,NA934)以1:5,000或1:10,000的稀释度使用。对于小鼠一抗,HRP连接的抗小鼠二抗(GE Healthcare,NXA931V)以1:10,000的稀释度使用。

通过在带有GeneSnap软件(Syngene)的G:Box成像系统上增强化学发光来可视化印迹。图像是用ImageJ软件处理的。

保护全细胞酵母裂解物中的泛素化物质

表达标记组蛋白H2B [44]的酵母ubp8Δ细胞在YPD培养基中生长,并在指数期生长期间收获。将细胞沉淀用水洗涤,速冻,并在研钵中用液氮研磨裂解。在20mM NEM,3μM OtUBD,3μM 4xTR-TUBE(所有最终浓度)存在下,通过加入裂解缓冲液(50mM Tris•HCl,pH 7.5,150mL NaCl,1mM EDTA,10%甘油,cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche),1mM PMSF)提取蛋白质。将所得裂解物在4°C下以21,000×g离心12分钟,并在室温下孵育1至4小时。标志标记的H2B按照制造商的方案,通过抗标志的M2亲和凝胶(微孔)用ANTI-FLAG M2亲和凝胶(Millipore)进行纯化。通过抗泛素免疫印迹分析全细胞裂解物。采用抗旗免疫印迹法分析抗旗沉淀物。

使用 MBP 标记的诱饵蛋白进行下拉

使用直链淀粉树脂(新英格兰生物实验室)对MBP标记的融合蛋白进行抽取。将适量(见图1DS1A和S1B)MBP或MBP融合蛋白稀释在300μL直链淀粉柱缓冲液(20mM Tris•HCl,pH 7.5,200mM NaCl,1mM EDTA)中与50μL直链淀粉树脂一起在4°C下旋转孵育1小时。将树脂在5,000×g下离心30秒,并除去上清液。将1mL酵母裂解物(1至2mg / mL)在新鲜补充蛋白酶和DUB抑制剂(cOmplete mini EDTA-free(Roche),10mM NEM,1mM PMSF)的柱缓冲液中加入到磁珠中。(有关裂解液制备的详细方法,请参见下面的“泛素与蛋白质连接树脂的拉取”一节。将混合物在4°C下旋转孵育2小时。用1mL柱缓冲液洗涤树脂5次,然后用含有50mg / mL麦芽糖的柱缓冲液在4°C下旋转2小时洗脱。或者,通过在室温下与SDS样品缓冲液一起孵育15分钟,可以洗脱结合的蛋白质。

S1B图中描述的替代孵育方法中,首先将MBP-OtUBD与酵母裂解物一起在4°C下旋转孵育4小时。然后将混合物加入直链淀粉树脂中,并在4°C下旋转保温2小时,然后进行如上所述的相同洗涤和洗脱步骤。

共价联动纯化树脂的生成

OtUBD树脂。

共价连接的OtUBD树脂是通过结合Cys-OtUBD或Cys-His制成的6-OtUBD到SulfoLink耦合树脂(赛默飞世尔科技)根据制造商的协议。简而言之,将2 mL(床体积)的SulfoLink树脂置于重力柱中,并与4床体积的SulfoLink偶联缓冲液(50 mM Tris•HCl,5 mM EDTA,pH 8.5)平衡。将4mg Cys-OtUBD在补充有20mM TCEP的4mL偶联缓冲液中稀释,并在室温下旋转孵育30分钟。将稀释的Cys-OtUBD加载到SulfoLink树脂上,并将混合物在室温下旋转孵育30-60分钟。(赛斯-希斯6-OtUBD需要比Cys-OtUBD(30分钟)更长的孵育时间(60分钟)。将树脂再沉降30分钟,然后用6 mL偶联缓冲液沥干并洗涤一次。此外,将4mL新鲜制备的50mM L-半胱氨酸溶解在偶联缓冲液中(用NaOH调节pH至8.5)加入到树脂中,并将混合物在室温下孵育30分钟并旋转。将树脂再沉降30分钟,然后沥干并用12 mL 1 M NaCl洗涤,然后用4 mL OtUBD柱缓冲液(50 mM Tris•HCl,150 mM NaCl,1mM EDTA,0.5%Triton-X,10%甘油,pH 7.5)洗涤。对于长期储存(超过2天),将树脂储存在含有0.05%NaN的柱缓冲液中3并保持在4°C。 树脂可以在4°C下储存至少1年,而不会显着损失功效。

阴性对照Cys偶联树脂。

负对照树脂是按照制造商的协议用半胱氨酸封盖SulfoLink树脂的反应基团制成的。具体地,将2mL(床体积)树脂与4mL新鲜制备的50mM L-半胱氨酸一起在室温下溶解在偶联缓冲液(pH 8.5)中旋转30分钟。随后对Cys-OtUBD树脂进行如上所述的树脂进行处理和储存。

TR-管树脂。

TR-TUBE树脂是通过与Cys-His共轭制成的6-4xTR-TUBE到SulfoLink树脂,遵循与OtUBD树脂类似的程序,并进行了一些修改。特别是,4.52毫克的Cys-His6将-4xTR-TUBE稀释在2mL磺基Link偶联缓冲液中,补充2M胍•HCl和20mM TCEP。加入胍以尽量减少孵育期间4xTR-TUBE蛋白的沉淀。每1mLSulfoLink树脂加入2mL稀释的TUBE溶液,并将混合物在室温下旋转孵育1小时。其余的制备步骤与OtUBD树脂相同。

Dsk2 树脂。Dsk2树脂与OtUBD树脂类似,除了每1 mL磺福林克树脂加入6.71mg稀释至2mL的Cys-His6-Dsk2。

TR-UBA树脂。TR-UBA树脂与TR-TUBE树脂类似,除了每1 mL磺基链接树脂加入1.5mg稀释至2mL的Cys-His6-TR-UBA。

FK2树脂。

FK2抗泛素抗体在先前的修饰方案后与Protein-G树脂共价连接[20]。简而言之,将500μgFK2小鼠单克隆IgG1抗体(开曼化学)稀释在500μL DPBS中。将溶液加入到用DPBS预洗的250μL(床体积)蛋白G琼脂糖4快速流动树脂(GE Healthcare)中。将混合物在4°C下旋转孵育2小时。用100 mM三乙醇胺•HCl(pH 8.3)洗涤树脂两次,然后将抗体与500 μL 50 mM二甲基哌甲酯(DMP)在100 mM三乙醇胺•HCl缓冲液(pH 8.3)中孵育4小时,在4°C下旋转4小时,使抗体与树脂交联。通过在室温下用1.5mL 100 mM Tris•HCl缓冲液(pH 7.5)孵育2小时终止反应。通过用500μL100mM甘氨酸•HCl缓冲液(pH 2.5)洗涤从树脂中除去未偶联抗体。将树脂与DPBS平衡,并在使用前储存在4°C。

泛素与蛋白质连接树脂的偶联纯化

原生条件

酵母裂解液的制备。

在大多数情况下,冷冻酵母颗粒通过在液氮中用研钵和研杵研磨来裂解。向1体积的所得酵母粉,1体积的冷天然裂解缓冲液(50 mM Tris•HCl,300 mM NaCl,1 mM EDTA,0.5%Triton-X100,新鲜加入20mM NEM,cOmplete mini EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)和1mM PMSF,pH 7.5)加入提取蛋白质。将混合物彻底涡旋并在冰上孵育10分钟,间歇涡旋。将粗提取物以21,000×g离心12分钟,并将上清液小心地转移到干净的管中。

或者,酵母可以通过玻璃珠跳动来裂解。将细胞沉淀重悬于含有10%甘油和0.6mL酸洗玻璃珠(Sigma)的1mL冷天然裂解缓冲液中,并在4°C(5.0 m / s,3×(30秒,冰上休息1分钟),冰上休息4分钟,冰上休息3×(30秒,冰上休息1分钟))下裂解。将所得混合物在冰上再放置5分钟,然后在4°C下以8,000×g离心5分钟。 将上清液转移到新管中,同时向珠子和颗粒状细胞碎片中加入0.5mL更多的裂解缓冲液。将颗粒重悬并如上所述处理。将上清液合并并在4°C下以21,000×g离心12分钟。 将清除的裂解物转移到干净的管中。

对于哺乳动物细胞,将冷冻的细胞沉淀重悬于冷的天然裂解缓冲液中,并在冰上孵育30至40分钟,偶尔涡旋。在21,000×g离心20分钟后,将澄清的裂解物转移到新鲜管中。

通过BCA测定测定裂解物中的蛋白质浓度,并使用天然裂解缓冲液将裂解物的最终蛋白质浓度调节至2至4mg / mL。

下拉列表。

将适量的树脂转移到一次性重力塔中,或者对于小规模的实验,转移到微量离心管中。通常,每1mg裂解蛋白使用25μL树脂(床体积)。对于本研究中的蛋白质组学实验,每个下拉样品使用0.25至2 mL树脂。(在这里,我们描述了用于基于重力柱的实验的程序。为了适应基于微量离心机的实验,用户可以在去除上清液之前以1,000×g沉淀树脂2分钟。将储存缓冲液沥干,并将树脂与5个树脂体积的OtUBD柱缓冲液平衡。如果进行下拉以进行LC-MS / MS分析,则用2床体积的洗脱缓冲液(100 mM甘氨酸•HCl,pH 2.5)洗涤树脂,然后通过20床体积的柱缓冲液通过树脂立即平衡。

将裂解物加入到平衡树脂中,将柱的两端加盖,并将混合物在4°C下旋转保温2.5小时。将树脂沉降10分钟,将未结合的溶液沥干并作为流出收集。通过15列床体积的柱缓冲液,15体积的洗涤缓冲液-1(50 mM Tris•HCl,150 mM NaCl,0.05%吐温20,pH 7.5)和15体积的洗涤缓冲液-2(50 mM Tris•HCl,1 M NaCl,pH 7.5)依次通过树脂洗涤树脂。

洗脱。

如果下游应用只是蛋白质印迹,则可以通过在室温下旋转将树脂与2至3个树脂体积的1x SDS样品缓冲液(50 mM Tris•HCl,pH 6.8,2%SDS,5%甘油,100mM DTT,0.005%溴酚蓝)孵育15分钟来洗脱结合蛋白。在我们手中,TUBE树脂只能使用这种方法有效地洗脱。

如果用LC-MS / MS分析纯化的蛋白质,则通过2个树脂体积的纯水通过树脂以推开残留缓冲液。然后,通过在2个树脂体积的洗脱缓冲液(100mM甘氨酸•HCl,pH 2.5)中旋转5分钟来洗脱结合的蛋白质。收集洗脱液并立即用0.2树脂体积的1M Tris•HCl pH 9缓冲液中和。重复洗脱过程以确保完全洗脱(2种洗脱剂E1和E2有时合并为洗脱液E)。在一些实验中,第一个洗脱步骤是用100mM甘氨酸•HCl完成的,pH 3.0,第三个洗脱步骤,也包括pH 2.5缓冲液,以确保完全洗脱。

通过抗泛素蛋白质印迹分析每个样品的输入,流过和洗脱中的泛素偶联物。除非另有说明,否则将每个样品的上样量归一化到SDS-PAGE凝胶上,以反映输入,流通和洗脱物的1:1:1缩放(例如,如果洗脱液的总体积是输入的1/10,则我们将1体积的输入和0.1体积的洗脱液加载在同一SDS-PAGE凝胶上)。根据制造商的协议,通过凝胶的SYPRO Ruby染色分析来自下拉的总蛋白质。在Bio-Rad ChemiDoc成像仪上对SYPRO Ruby染色的凝胶进行成像,并使用ImageJ软件进行定量。

变性条件

裂解物的制备。

酵母或人类细胞被裂解如上所述的用于天然条件方案。测量蛋白质浓度后,用天然裂解缓冲液将裂解物调节至高达12.58mg / mL蛋白质。裂解物在整个持续时间内保持在冰上,直到将适量的固体尿素直接添加到天然裂解物中以达到8M的最终浓度(每0.763mL裂解物添加1g尿素;计算基于[48]),裂解物被涡旋和搅拌,直到尿素完全溶解。将尿素裂解物在25°C下孵育30分钟,在冰上冷却并用天然裂解缓冲液(尿素的最终浓度,4M)1:1稀释。

或者,酵母裂解物直接在含尿素缓冲液中提取(图4E,D2条件)。这种方法可能有助于溶解沉淀的泛素化物种。将研磨的酵母粉直接重悬于尿素裂解缓冲液(50 mM Tris•HCl、300 mM NaCl、8 M尿素、1 mM EDTA、0.5% Triton-X100、20 mM NEM、cOmplete mini EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)、1 mM PSMF、pH 7.5)中,或酵母细胞可通过珠粒打浆直接溶于尿素裂解缓冲液中。

通过BCA测定测定清除的裂解物的浓度,并调整浓度以匹配其他样品。将清除的裂解物在25°C下孵育15分钟,在冰上冷却,并用天然裂解缓冲液1:1稀释。这种方法在理论上可以包括不溶性的泛素化蛋白,并且可能在特定应用中有用。

下拉和洗脱协议。

下拉过程与上述在本机下拉协议下描述的程序类似,只是第一个洗涤步骤是使用含有4 M尿素的色谱柱缓冲液完成的。洗脱步骤与本机下拉协议中描述的步骤相同。

M48 DUB处理酵母细胞裂解物

在液氮中研磨BY4741菌株产生的酵母粉在M48裂解缓冲液中重构(50 mM Tris•HCl,300 mM NaCl,1 mM EDTA,0.5%TritonX,10%甘油,pH 7.5,补充7.6μM肽酶A,5mM氨基己酸(ACA),5mM苯甲脒,260μM AEBSF,1mM PMSF和1mM DTT), 在冰上孵育10分钟,并在4°C下以21,000×g离心澄清。 避免半胱氨酸蛋白酶抑制剂以防止M48半胱氨酸蛋白酶的抑制[84]。通过BCA测定测定裂解物中的蛋白质浓度,并用M48裂解缓冲液将裂解物调节至2至4mg / mL蛋白质。将M48 DUB加入裂解物中,得到100nM的最终酶浓度。将混合物在37°C下旋转孵育1小时,然后进行下拉分析。在未添加M48的对照样品中,裂解缓冲液中也包括10mM NEM和20μM MG132(蛋白酶体抑制剂)。

变性条件下的 IMAC

通过添加固体变性剂,OtUBD下拉的洗脱物变性,尿素的终浓度为8M(用于图3E和3F所示的结果)或愈创甘油•盐酸,最终浓度为6M(变性剂的量根据[48]计算)。变性剂完全溶解后,将溶液在25°C下孵育30分钟,然后施用于预洗的HisPur钴树脂(赛默飞世尔科技)。将混合物在室温下旋转孵育1.5小时,用8M尿素洗涤缓冲液(50mM Tris•HCl,pH 7.5,8M尿素)洗涤,洗脱两次,每次在2个树脂体积的500mM咪唑中煮沸5分钟,在2x SDS样品缓冲液(100mM Tris•HCl,pH 6.8, 4%SDS,10%甘油,200 mM DTT,0.01%溴酚蓝)。通过SDS-PAGE对样品进行分辨,并通过抗泛素免疫印迹和SYPRO Ruby染色进行分析。具体而言,首先用3份纯H稀释含有胍的样品2O,然后小心地与4x SDS样品缓冲液混合,然后上样到SDS-PAGE凝胶上,以避免SDS沉淀。

蛋白质组学

样品制备。

冷冻样品在冻干机(Labconco)上脱水。对于除OtUBD/FK2比较实验外的所有样品,干含量在纯水中重构并进行甲醇-氯仿萃取,如前所述[85]。

溶液中蛋白质消化。

将蛋白质沉淀溶解并变性于8M尿素,0.4M碳酸氢铵,pH 8。通过加入1/10体积的45mM DTT(Pierce Thermo Scientific #20290)并在37°C下孵育30分钟来减少蛋白质,然后加入1/20体积的200mM甲基甲硫磺酸盐(MMTS,Pierce Thermo Scientific #23011)在室温下在黑暗中孵育30分钟。使用MMTS可避免碘乙酰胺(IAA)烷基化引起的GG修饰的潜在假阳性识别[86]。在37°C下用胰蛋白酶酶消化之前,通过加水将尿素浓度调节至2M(Promega Seq. Grade Mod.胰蛋白酶,# V5113)持续16小时。蛋白酶:蛋白质比估计为1:50。样品通过加入1/40体积的20%三氟乙酸进行酸化,然后按照制造商的指示使用BioPureSPN PROTO 300 C18柱(The Nest Group,#HMM S18V或#HUM S18V)脱盐,用0.1%TFA,80%乙腈洗脱肽。将洗脱的肽加速干燥并溶解在MS上样缓冲液(2%乙腈,0.2%三氟乙酸)中。纳米滴测量(赛默飞世尔科技 Nanodrop 2000 紫外可见分光光度计)测定了蛋白质浓度 (A260/A280)。然后将每个样品用MS上样缓冲液进一步稀释至0.08μg/ μl,并注入0.4ug(5μl)用于大多数LC-MS / MS分析,但阴性对照样品除外,其稀释至并注入与相应OtUBD下拉样品相同体积的样品。

LC-MS/MS on the Thermo Scientific Q Exactive Plus.

在配备沃特世纳米高性价比UPLC系统的Thermo Scientific Q Exactive Plus上进行LC-MS / MS分析,该系统利用二元溶剂系统(A:100%水,0.1%甲酸;B:100%乙腈,0.1%甲酸)。使用ACQUITY UPLC M级对称C18陷阱柱(100Å,5μm,180μm×20mm,2G,V / M)在5μl/ min,99.5%缓冲液A下进行捕获3分钟;沃特斯,#186007496)。使用失常UPLC M级肽BEH C18色谱柱(130Å,1.7μm,75μm X 250mm;130Å,1.7μm,75μm X 250mm)在37°C下分离肽;沃特斯,#186007484)并以300 nl / min洗脱,具有以下梯度:初始条件下为3%缓冲液B;5% B 在 2 分钟;140分钟时为25%B;40% B 在 165 分钟;90% B 在 170 分钟;90% B 在 180 分钟;在 182 分钟时返回到初始状态。在300至1,700 m/ z范围内使用1个微扫描,70,000分辨率,AGC目标为3E6,最大注射时间为45 ms,以轮廓模式获取MS。在每次MS扫描的前20个前体上,使用1个微扫描,17,500分辨率,AGC靶标为1E5,最大注射时间为100 ms,隔离窗口为1.7 m / z,以质心模式获取数据相关的MS / MS。前体被HCD活化破碎,碰撞能量为28%。在强度阈值为1E4、电荷状态为2~6的物种上收集MS/MS,优选肽匹配。动态排除设置为 30 秒。

肽鉴定。

使用蛋白质组发现者软件v2.2(赛默飞世尔科学)分析数据。使用Mascot算法(版本2.6.1)(Matrix Science)对包含OtUBD蛋白质序列的自定义数据库以及分类法仅限于S的SwissProt数据库进行数据搜索。酿酒人(7,907个序列)或智人(20,387个序列)。搜索参数包括最多2个缺失裂解的胰蛋白酶消化,10 ppm前体质量耐受性和0.02 Da片段质量耐受性,以及蛋氨酸氧化的可变(动态)修饰;NEM,NEM +水,氨基甲酰胺甲基或半胱氨酸甲硫;和赖氨酸,蛋白质氨基末端,丝氨酸,苏氨酸或半胱氨酸上的GG加合物。运行了正常和诱饵数据库搜索,置信水平设置为95%(p <0.05)。Scaffold(版本 Scaffold_5.0,蛋白质组软件,美国俄勒冈州波特兰市)用于验证基于 MS/MS 的肽和蛋白质鉴定。如果肽鉴定可以通过Scaffold Local FDR算法以大于95.0%的概率建立,则被接受。如果蛋白质鉴定可以以大于99.0%的概率建立并且含有至少2种鉴定的肽,则蛋白质鉴定被接受。S2 Data中还报告了由Scaffold为每个实验计算的蛋白质和肽FDR。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE [87]合作伙伴存储库沉积到ProteomeXchange联盟,数据集标识符为PXD032294(酵母结果)和PXD032675(HeLa细胞结果)。

通过Scamaffold 5(蛋白质组软件)基于归一化总TIC(MS / MS总离子电流)进行定量分析。使用GraphPad Prism 9软件计算Pearson相关系数。火山图是使用GraphPad Prism 9软件生成的。如果蛋白质满足以下标准之一,则选择蛋白质作为潜在的E3底物:(1)其平均定量值(归一化总TIC)在WT样品中至少比E3缺失样品高1.5倍,p值<0.05。(2)它出现在WT样品的6个技术重复中的至少3个中,但未出现在E3缺失样品的6个技术重复中的任何一个中。

GO富集分析使用在线基因本体学引擎[88-90]进行,可在 http://geneontology.org 访问。

支持信息

MBP-OtUBD和固定化OtUBD树脂下拉的其他数字。

显示 1/9: pbio.3001501.s001.tif

https://ndownloader.figstatic.com/files/36113216/preview/36113216/preview.jpg
 

S1 图 MBP-OtUBD和固定化OtUBD树脂下拉的其他数字。

(一、二)使用不同量的MBP-OtUBD的泛素下拉。在A中,通过首先将MBP-OtUBD结合到直链淀粉树脂,然后将树脂与酵母细胞裂解物一起孵育来进行下拉。在B中,通过将裂解物与MBP-OtUBD孵育,然后将配合物与直链淀粉树脂结合来进行下拉。U,未结合分数;E,用麦芽糖洗脱的分数。在MBP-UBD的预期分子量下看到的条带可能是抗体交叉反应性的结果。(C)从HEK293T全细胞裂解物中拉出的MBP-OtUBD的抗泛素印迹。U,未结合分数;B,结合部分(用SDS样品缓冲液洗脱)。(D)图2B中来自OtUBD树脂的洗脱物的SYPRO Ruby蛋白染色。E1/E2/E3,从连续低pH洗脱液中洗脱的级分。MBP,麦芽糖结合蛋白;OtDUB, O.津津龟配音。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.s001

(断续器)

S2 图 不同条件下OtUBD下拉样品中存在蛋白酶体亚基。

(A)OtUBD下拉样品中酵母蛋白酶体亚基的蛋白质印迹。未修饰的酵母蛋白酶体亚基(Rpt4,Rpt5和Pre6)在天然条件下与OtUBD树脂结合,但在下拉之前不跟随裂解物变性。N,原生条件;D、变性情况。(B)OtUBD下拉样品中人蛋白酶体亚基的蛋白质印迹。未修饰的人蛋白酶体亚基Rpt6和Rpt4在天然条件下与OtUBD树脂强烈结合,但在提取物变性后仅弱。改性Rpt6和Rpt4(可能泛素化)在天然和变性条件下与OtUBD树脂结合。N,原生条件;D、变性情况。OtDUB, O.津津龟配音。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.s002

(断续器)

S3 图例 在酵母中OtUBD下拉蛋白质组学实验的附加数字。

(A)用于蛋白质组学分析的OtUBD下拉(在天然条件下)的代表性抗泛素蛋白质印迹。输入, 输入;FT,流通;E1/E2/E3,从一系列低pH洗脱液中洗脱的级分。(B)提取液变性(尿素)后OtUBD下拉样品的代表性抗泛素印迹,用于蛋白质组学分析。(C)由SDS-PAGE分辨的OtUBD洗脱物的代表性SYPRO Ruby蛋白染色。(D)在OtUBD下拉-MS和阴性对照的每个生物重复中检测到的蛋白质数量。误差线表示技术仿行之间的差异。(E)叠加代表性OtUBD下拉和阴性对照样品的TIC色谱仪。与OtUBD下拉样品相比,阴性对照总体上具有更少的肽谱。该图是使用Thermo Xcalibur Qual浏览器(v3.0.63)生成的.raw来自相应运行(QEp21-2054_Zhang_A1_Native_UBD_pos,QEp21-2050_zhang_a2_native_ubd_neg,QEp21-2036_zhang_a3_denatured_ubd_pos,QEp21-2032_zhang_a4_denatured_ubd_neg)的文件,这些文件已存放到蛋白质组Xchange联盟并向公众提供(有关详细信息,请参阅方法部分)。(F)在OtUBD下拉列表的每个生物重复中检测到的调整蛋白数量。仅包括OtUBD下拉样本中TIC值至少高于相应阴性对照样品20倍的蛋白质。OtDUB, O.津津龟配音。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.s003

(断续器)

S4 图 OtUBD在HeLa细胞和酵母中的下拉式蛋白质组学实验的附加数字。

(一、二)OtUBD下拉的抗泛素蛋白质印迹,以及用于蛋白质组学分析的FK2抗体IP。A和B中使用的OtUBD和FK2都来自不同的批次。输入, 输入;FT,流通;E,合并洗脱的馏分;E1/E2,从一系列低pH洗脱液中洗脱的级分。(C)本研究中BY4741酵母泛素组在天然和变性(尿素)条件下不同泛素连锁的定量(根据总光谱计数估计)。与Xu及其同事发表的定量数据进行了比较。支持此面板的数值可在 S3 Data 中找到。OtDUB, O.津津龟配音。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.s004

(断续器)

S5 图例 使用 OtUBD 下拉的定量蛋白质组学分析的质量控制数据。

(A)用于蛋白质组学分析的WT,bre1△和pib1△酵母裂解物的OtUBD下拉的代表性抗泛素印迹。输入, 输入;FT,流通;E、合并洗脱的馏分。(B)具有代表性的SYPRO Ruby凝胶,显示从WT,bre1△和pib1△酵母裂解物下拉的OtUBD洗脱液中的总蛋白。(C、 D)使用归一化总TIC计算分析组中每个样品之间的Pearson相关系数。由于与所有其他蛋白质相比,泛素的含量非常高,因此将其排除在本次分析的数据集之外。除了一个pib1Δ样品外,不同样品之间的相关性通常很高,如果大多数泛素组不受单个E3缺失的影响,则预期。单个pib1Δ样品中的低相关性可能是由于样品制备过程中的误差引起的,因此结果被排除在定量之外。OtDUB, O.津津龟配音;WT,野生型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.s005

(断续器)

S6 图 来自 OtUBD 下拉样本的选择性 MS/MS 光谱。

(A) Htb2 K111GG 肽的代表性 MS/MS 谱。(B)Htb2 K123GG肽的代表性MS / MS谱。除了a / b / y离子外,我们还从内部碎片化和脱水中鉴定出多个峰,这可能是由于序列中富含丝氨酸/苏氨酸的性质。(C)YMR160W T534GG肽的代表性MS /MS谱。OtDUB, O.津津龟配音。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.s006

(断续器)

S1 数据。 本研究中使用的质粒,酵母菌株和UBDs / TUBE序列的列表。

TUBE,串联泛素结合实体;UBD,泛素结合结构域。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.s007

(XLSX)

S2 数据。 本研究中的蛋白质组学数据;这包括图6B和6F的数值。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.s008

(XLSX)

S3 数据。 5C5DS4C中定量分析的数值。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001501.s009

(XLSX)

确认

我们感谢Chin Leng Cheng博士和Hong-Yeoul Ryu博士提供手稿中使用的酵母菌株。我们感谢耶鲁大学的Christian Schlieker实验室分享M48 DUB表达质粒,组织培养空间和设备;Candice Paulsen的实验室允许我们使用他们的ChemiDoc仪器;和大卫·斯皮格尔的实验室分享他们的冻干剂。

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