超级增强子相关lncRNA的全基因组染色质接触鉴定LINC01013是主动脉瓣纤维化的调节因子-厦门畜牧期刊杂志论文发表

 

阿诺德·奇格农，德博拉•阿尔高，玛丽-克洛伊·布朗热，加达·姆坎内斯，瓦伦丁·邦-巴雷特，李忠林，塞巴斯蒂安·泰里奥，约翰·博塞，帕特里克·马蒂厄

出版日期： 2022年01月18日

 

抽象

钙化性主动脉瓣疾病 （CAVD） 的特征在于纤维钙化过程。驱动主动脉瓣（AV）中纤维化反应的调节机制知之甚少。来自超级增强子（lncRNA-SE）的长非编码RNA控制基因表达和细胞命运。本文，包括染色质免疫沉淀和测序，转座酶可及染色质测序，增强子 - 启动子的全基因组3D染色质接触的多维分析将LINC01013鉴定为CAVD期间过表达的lncRNA-SE。LINC01013位于环形锚点内，该环锚与位于上游约180 kb的CCN2（CTGF）的启动子接触。研究表明，LINC01013作为阴性转录伸长因子E（NELF-E）的诱饵因子，从而控制CCN2的表达。LINC01013-CCN2是转化生长因子β1（TGFB1）网络的一部分，对纤维发生施加控制。这些发现说明了一种新机制，即失调的lncRNA-SE通过循环过程控制CCN2的表达和AV的纤维化。

 

作者简介

钙化性主动脉瓣疾病是最常见的心脏瓣膜疾病，其特征在于纤维化和钙化过程导致的主动脉瓣增厚。由于主动脉瓣置换术是目前唯一的治疗选择，因此确定控制疾病进展的关键分子过程可能导致开发新的无创疗法。越来越多的证据表明，长非编码RNA（lncRNA）微调了健康和疾病状态下的基因表达。通过使用包括全基因组3D增强子 - 启动子循环数据的多维分析，我们确定了LINC01013，一种lncRNA，作为纤维发生的调节因子。具体来说，我们发现LINC01013位于主动脉瓣间质细胞中的一簇远处增强子（超级增强子），并且与CCN2的启动子具有显着的长程循环，CCN2是一种协调纤维生成的基因。我们发现LINC01013作为阴性转录伸长因子的诱饵因子，从而控制CCN2的转录。反过来，在钙化主动脉瓣疾病期间LINC01013的较高表达促进了CCN2和纤维化程序的表达。这些发现提供了证据，证明LINC01013是CAVD中纤维发生的关键调节因子。

 

数字

Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3Table 1Fig 4Fig 5Fig 6Fig 1Fig 2Fig 3

   

引文：Chignon A，Argaud D，Boulanger M-C，Mkannez G，Bon-Baret V，Li Z等人（2022）超级增强子相关lncRNA的全基因组染色质接触确定LINC01013作为主动脉瓣中纤维化的调节因子。PLoS Genet 18（1）：e1010010。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010

 

编辑 器：Jeannie T. Lee，马萨诸塞州总医院，霍华德休斯医学研究所，美国

 

收到：三月 12， 2021;接受：十二月 22， 2021;发表：一月 18， 2022

 

版权所有：© 2022 Chignon et al.这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。

 

数据可用性：数据可在GEO中获得（加入号GSE154510，GSE154511和GSE154512）。

 

资金：这项工作得到了加拿大卫生研究院对P.M.（FRN148778，FRN159697）和魁北克心肺研究所基金的资助。Y.B.是加拿大心肺疾病基因组学研究主席。S.T.拥有魁北克桑特研究基金会（FRQS）的初级奖学金。P.M.是魁北克省-桑特研究基金会（FRQS）钙化主动脉瓣疾病病理生物学研究主席。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

 

相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

 

介绍

钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是最常见的心脏瓣膜疾病[1]。CAVD 的进展最终导致主动脉瓣 （AV） 狭窄，对于有症状的患者，可通过主动脉瓣置换术 （AVR） 进行治疗。手术或经皮方法的AVR与成本升高和显着的发病率/死亡率相关[2]。因此，确定控制CAVD发展的关键基础过程可能导致药物治疗，以防止CAPD的进展。对手术外植的AV的分析表明，小叶增厚是CAVD的标志性特征，与细胞外基质成分（如胶原原纤维）过量有关[2]。在过去几年中进行的研究强调了参与CAVD发展的几个分子过程，并强调了瓣膜间质细胞（VIC）具有高可塑性[3]。因此，根据不同的线索，VIC可以从静止细胞过渡到活化的细胞，并具有增加的纤维发生潜力[3]。研究一致表明，转化生长因子（TGF）β途径参与纤维化和CAVD的发展[4]。临床前和临床数据强调了靶向TGFβ通路减少心脏纤维化的好处[5]以及TGFβ-CCN2 / CTGF轴的关键作用[6]。然而，在房室中协调和指导纤维化计划的TGFβ途径的关键调节因子仍然在很大程度上是未知的。

 

转录因子和增强子控制基因表达模式[7]。超级增强子（SE）是近距离的远作用顺式调节元件（增强子）组，它们在染色质环中富集，具有基因的启动子[8]。染色质的折叠模式使远处的元素（例如SE）与基因启动子接触并对转录过程施加控制。研究强调，SE是细胞特异性的，并且控制细胞的命运和身份[8]。增强子和SE可能表达非编码RNA，包括长非编码RNA（lncRNA）[9，10]。来自SE（lncRNA-SE）的lncRNA的表达为基因表达提供了另一层控制[10]。关于心脏纤维化的研究表明，lncRNA或lncRNA-SE可以靶向减少心脏纤维化[11，12]。在这项工作中，我们假设VIC表达的失调的lncRNA-SE可能有助于纤维化，这是CAVD发展的早期和关键过程。通过使用功能测定和VAC和AV的基因组多维分析（S1图），我们鉴定了LINC01013，一种CAVD失调的lncRNA-SE在调节DNA环路中控制TGFβ途径中富集的基因的转录过程并促进纤维化。

 

结果

瓣膜间质细胞中的超级增强剂

SE对活性H3K27ac调节标记具有很强的富集性，并在信号通路中起主要作用。因此，我们想知道SEs是否可以参与AV的生物学。为此，在VIC中，我们首先生成用于H3K27ac的染色质免疫沉淀，然后进行测序以鉴定活性调节元件。我们确定了与假定的监管要素相对应的82，662个强峰值。接下来，我们使用这些数据通过使用超增强子（ROSE）算法的排名来识别SE，如前所述[13，14]。ROSE是最常用的识别SE的方法;简而言之，该算法对强和接近的 H3K27ac 峰值进行排名，然后从斜率为 1 的拐点上方的散点图上绘制的峰值中识别 SE。因此，在VIC中，我们确定了1085个SE（S1表）。我们希望通过使用集成到HOMER工具中的另一种算法来复制这些数据，我们观察到HOMER（S2表）识别的83.3%的SE也是由ROSE算法发现的。通过使用GREAT（参见方法部分），我们发现1085个SE在细胞外基质组织的基因本体（GO）中高度富集（GO：0030198）（P = 2.01 x 10−21) (图1A）。活性调节元件（如增强子和SEs）的特点是染色质的可及性。在VIC中，我们对转座酶可访问的染色质和大规模平行测序（ATAC-seq）进行了测定，以捕获开放的染色质区域。我们发现，接近SE的ATAC-seq信号存在显着且正相关（观察到/预期比率= 5.2，P<1 x 10−16二项式检验）（图1B）：这些发现证明了被确定为主动调节元件的SE的重要性。通过使用与SE数据集相交的lncRNA（GENCODE [15] 版本32）的广泛注释，我们确定了324个SE，其中至少转录了一个lncRNA，称为lncRNA-SE（S3表），占VIC中所有SE的30%（图1C）。基于ROSE算法[8]，lncRNA-SE的排名高于常规SE（R-SE），从中没有转录lncRNA（P<0.0001，Wilcoxon排名和测试）（图1D）。因此，我们想知道与R-SE相比，lncRNA-SE是否与开放染色质的增加有关。在ATAC-seq中，与R-SE（P<0.0001，Wilcoxon秩和检验）相比，lncRNA-SE中核心区域（±5kB）的标签密度显着增加（图1E和1F）。SE富集于参与基因调控的3D染色质循环[14]。在VIC中，使用H3K27ac HiChIP评估了全基因组增强子 - 启动子3D图谱，该H3K27ac HiChIP产生了454，964，884个独特的配对端标签。图2A显示了分辨率高达1kb的6号染色体的相互作用矩阵的示例。S2图显示了其他染色体的相互作用矩阵。总的来说，在 VIC 中，我们以错误发现率 （FDR） <0.01 绘制了 36，229 个高置信度环路。通过3D染色质环路绘制的蛋白质编码基因启动子（从转录起始位点±1 kb）的平均数量分别为R-SE和lncRNA-SE的1.2和1.9。综上所述，这些数据突显出VIC相关的lncRNA-SE是具有增加的开放染色质的高度SE，并且与远处的蛋白质编码基因在空间上协调。

 

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图 1.瓣膜间质细胞（VIC）中的超级增强子（SE）。

 

A） VICs中SE的基因本体富集（调整后的P值）。B） ATAC-seq 信号相对于与 SE 的距离.C） 饼图显示，30% 的 VAC SE 与 lncRNA （lncRNA-SE） SE 相交，其中没有转录 lncRNA 被定义为常规 SE （R-SE）。D）超增强子（ROSE）算法的排名表明，lncRNA-SE在VIC中的排名高于R-SE。E）与R-SE相比，lncRNA-SE核心的开放染色质（ATAC-seq）的信号强度更高。F）小提琴图揭示了lncRNA-SE的更高ATAC-seq信号。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.g001

 

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图 2.CAVD相关的lncRNA-SE和3D映射。

 

A） 6号染色体相互作用矩阵，分辨率为VAC中H3K27ac HiChIP的指示分辨率。B）10个对照和19个钙化主动脉瓣中lncRNA表达的热图。C）染色质与差异表达的lncRNA接触绘制的基因的维恩图，以及用于细胞外基质组织的GO中包含的基因，显示只有CCN2是两组共有的。D）6q23.2处染色质相互作用的虚拟4C表示，揭示了lncRNA-SE，LINC01013和CCN2启动子区域之间的细胞系特异性接触。 H3K27ac ChIP-seq 和 HiChIP （1D）、H3K4me1 ChIP-seq、SE-lncRNA、ATAC-seq 信号和 H3k27ac HiChIP （3D） 的音轨。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.g002

 

差异表达的 lncRNA-SE 和 3D 基因组图谱

接下来，我们想知道在CAVD的发展过程中，lncRNA-SE是否被差异表达。通过在10个对照非矿化AV和19个手术外植的矿化AV（CAVD）中使用RNA测序（RNA-seq），我们分析了lncRNA的表达。RNA测序用GENCODE版本32进行注释。图2B显示了对照非矿化和矿化AV（CAVD）之间差异表达的lncRNA的热图。当比较CAVD与对照AV时，分别对178和111个lncRNA进行了上调和下调（FDR<0.05）（S4表）。在差异调节的lncRNA中，有18个lncRNA-SE（10个上调，8个下调在CAVD中）（S5表）。为了鉴定由lncRNA-SE调控的推定基因，我们通过使用在VIC中使用H3K27ac HiChIP获得的染色质环路信息，将这些调节元件映射到它们的蛋白质编码基因（从转录起始位点±1 kb）。在18个差异表达的lncRNA-SE中，我们发现总共4个与蛋白质编码基因的远处启动子有显着的染色质接触（S6表）。差异表达的lncRNA-SE和蛋白质编码基因之间的平均距离约为89 kb。我们想知道由H3K27ac HiChIP绘制的基因以及与lncRNA-SE具有环路的基因是否可以成为细胞外基质组织的GO的一部分，这是VIC中SE的最高富集本体。图2C显示了通过染色质与差异表达的lncRNA-SE接触以及GO中包含的用于细胞外基质组织的基因的维恩图。CCN2 （6q23.2） 的一个基因启动子具有具有差异表达的 lncRNA-SE 的环与 GO 重叠，用于细胞外基质组织。接下来，我们使用虚拟4C（v4C）检查了6q23.2处的基因组3D相互作用，该虚拟4C（v4C）提供了一个锚点作为基因组区域内所有相互作用（与锚点）的视点，并在2D中可视化。 与位于上游~180 kb的CCN2的启动子区域相互作用。高置信度显著环路在LINC01013的启动子和CCN2的启动子之间鉴定出强染色质接触，以及这些位点上的许多重要的非编码染色质接触。与对照非矿化AV相比，LINC01013在矿化中过度表达，LINC01013的SE区域延伸超过约30 kb。CCN2编码结缔组织生长因子（CTGF），这是一种参与细胞粘附，增殖和细胞外基质合成的基质细胞蛋白[17，18]。在6q23.2位点使用H3K27ac HiChIP询问增强子 - 启动子染色质接触表明，与VIC类似，LINC01013与人冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）中的CCN2相互作用，而在纯T细胞和GM12878（B细胞系）等血细胞中的该位点没有染色质循环（图2D）。这些数据强调，LINC01013位点处染色质的空间组织可能是间充质来源细胞特有的。S3 图总结了对LINC01013的优先级进行顺序分析的摘要。

 

LINC01013位点的表征

我们以更高的分辨率确认了通过使用染色质构象捕获（3C）和覆盖LINC01013区域的引物对在HiChIP中获得的数据（S7表）。在VIC中，3C测定显示CCN2的启动子区域（用作锚）与LINC01013的启动子区域相互作用（图3A）。LINC01013的替代剪接产生具有2或3个外显子的转录本。在VIC中，仅表达3个外显子转录本，而RT-qPCR未检测到2个外显子转录本（图3B）。我们生成数据来确认RNA-seq分析。我们通过使用定量RT-qPCR测量了18个对照非矿化AV和26个矿化AV中编码LINC01013的转录本水平。 我们发现，与对照AV相比，LINC01013的矿化量增加了2.95倍（P<0.0001;年龄和性别调整后的P = 0.0003）（图3C）。LINC01013的非编码电位通过使用CPAT[19]（编码概率= 0.04）得到证实，这是一种逻辑回归算法来探测编码电位（S8表）。在VIC中，具有针对H3K4me1（增强子组蛋白标记）的抗体的ChIP-seq在LINC01013区域显示出强烈的峰值，该区域与H3K27ac和开放染色质重叠（图2D）。接下来，我们询问了CAVD中LINC01013的失调是否可能与疾病相关的表观遗传过程有关。我们通过定量ChIP测量了H3K27ac在对照和矿化AV中LINC01013启动子的富集。与对照AV相比，我们发现LINC01013启动子处的H3K27ac标记在矿化AV中增加了5.41倍（图3D）。综上所述，这些正交数据表明LINC01013位于活性调节元件的扩展组蛋白标记中，并且与CCN2在空间上协调。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

 

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图 3.LINC01013位点表征.

 

A）染色质构象捕获（3C）测定显示LINC01013与CCN2启动子区域之间的接触（n = 4）。B）定量PCR（qPCR）引物设计，由箭头表示，专门扩增LINC01013（3或2个外显子）的长或短转录本。C） qPCR 测定证实，与非矿化 （n = 17） 主动脉瓣相比，矿化 （n = 27） 中LINC01013的 RNA 表达增加。D） ChIP-qPCR 指示LINC01013启动子处钙化瓣膜中的 H3K27ac 信号较高（CTL： n = 4，CAVD： n = 7）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.g003

 

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表 1.用于对照组和 CAVD 的临床数据。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.t001

 

LINC01013和CCN2下的转录应答

我们评估了LINC01013在细胞质基质和VIC核室中的表达。细胞分级分离后，我们观察到LINC01013在核和细胞质基质组分中均表达（图4A）。为了探索其功能作用，我们设计了一种靶向LINC01013的反义寡核苷酸（ASO）。在VIC中，ASO的转染提供了LINC01013的强烈还原（图4B）。在 VAC 中，ASO 与LINC01013的转染也导致 72 小时后测量的CCN2编码转录本显著减少（图 4C）。在同一行中，LINC01013的敲低之后在蛋白质水平上CCN2（CTGF）显着降低（图4D）。RNA聚合酶II（RNAPII）的启动子-近端暂停是转录过程的广泛调节机制[20]。NELF（负伸长因子）是一种与RNAPII[21]相互作用的蛋白质复合物，通常抑制其进展，通常从转录起始位点（TSS）下游20至60 bp[20]。NELF复合物的募集与在暂停启动子处富集的RNAPII（RNAPII-Ser5p）c端结构域丝氨酸5上的磷酸化有关[20，22]。先前的研究已经确定，一些非编码RNA可以通过隔离NELF-E亚基来调节NELF复合物的募集[23，24]。考虑到LINC01013具有核定位，并且其位点与CCN2的启动子在空间上协调，我们假设LINC01013可以作为NELF-E亚基的诱饵因子，从而调节其在CCN2的招募。我们进行了RNA免疫沉淀（RIP）测定，以评估LINC01013和NELF-E之间可能的相互作用。在VIC中，NELF-E亚基的下拉，然后进行定量RT-qPCR，表明与IgG对照组相比，LINC01013的富集率是6倍（图4E）。此外，定量ChIP表明，VIC中LINC01013的敲低导致NELF-E亚基在CCN2的TSS处显着富集（图4F）。然而，在LINC01013的启动子中，我们观察到与IgG控制相比，NELF-E的富集较差，并且在敲低后对招募没有影响（S4A图）。根据这些发现，我们发现LINC01013的敲低伴随着CCN2的TSS处更高水平的RNAPII-Ser5p（图4G）。然而，总RNAPII在CCN2的TSS中显示出类似的占用率，无论是否有敲低（图4H）。因此，这些数据表明，LINC01013通过调节RNAPPII暂停来控制CCN2处转录响应的大小，作为NELF-E亚基的诱饵因子。

 

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图 4.LINC01013调节CCN2的转录。

 

A）细胞分级分离和qPCR显示LINC01013在核和细胞质区室中的表达（n = 3）。B-D） LINC01013 （n = 9） （B） 和CCN2 （n = 8） （C） 在用LINC01013 ASO 处理后，RNA 水平和 CCN2 蛋白 （n = 6） （D） 降低。E）RNA免疫沉淀测定（RIP）表明LINC01013和NELF-E蛋白之间的相互作用，蛋白质印迹显示NELF-E免疫沉淀（n = 4）。F）ChIP-qPCR显示，在用LINC01013 ASO处理后，CCN2启动子处的NELF-E蛋白升高（n = 7）。G-H） ChIP-qPCR 显示，在用 ASO 处理LINC01013后，CCN2启动子处的 RNAPII-Ser5P （n = 8） （G） 占用率增加，但总 RNAPII （n = 4） （H） 保持不变。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.g004

 

TGFβ 通路和 LINC01013

我们从钙化AV中的RNA-seq中提取了蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络，以评估CCN2及其途径的相互作用。为此，我们使用了一个经过实验验证的数据集，其中包括156，317个PPI。在CAVD中提取的网络包括446个节点（基因衍生蛋白）和591个边缘（连接），并富集TGFβ信号通路（P调整= 4.17 x 10−72) (图5A和5B）。高度连接的节点，如SMAD2，SMAD3，TGFB1和COL1A1连接到CCN2。我们在VIC中测量了COL1A1（AV中广泛表达的胶原蛋白）的表达，以响应LINC01013的敲低，知道它对CCN2表达的影响。在VIC中，LINC01013的敲低在72小时后将COL1A1的蛋白质水平降低了55%（图6A）。此外，在VIC培养物中靶向LINC01013的ASO转染将1-α原的细胞外分泌降低了31%（图6B）。COL1A1在培养物中VIC中的免疫染色在全细胞上显示出类似的结果（S4B图）。TGF β是CAVD中的富集途径，也是VIC激活的重要启动子[3]。我们测试了TGFB1是否可能通过激活LINC01013影响CCN2的表达。首先，在TGFB1处理的VIC培养物（10ng / ml）中，我们发现LINC01013的表达增加了1.9倍（图6C）。同样，在TGFB1处理的VIC培养物中，CCN2的表达增加了3.1倍（图6D）。有趣的是，针对LINC01013的ASO废除了TGFB1诱导的CCN2上升（图6D）。此外，在蛋白质印迹中，CCN2的水平在用TGFB1治疗后增加，而LINC01013的敲低在很大程度上消除了这种上升（图6E）。接下来，我们用TGFB1处理了VIC培养物，并测量了LINC01013敲低和不敲低LINC01013的胶原蛋白水平。在VIC培养物中敲低LINC01013阻止了TGFB1诱导的COL1A1转录本的升高和1-α型胶原的分泌（图6F和6G）。从全细胞中COL1A1的免疫染色中获得的数据与这些结果一致（S4图）。同样，ASO对CCN2的敲低，显着降低了靶标的转录水平，也废除了TGFB1诱导的COL1A1上升（图6H和6I）。综上所述，在VIC中获得的这些数据表明，TGFB1介导的胶原蛋白表达依赖于LINC01013-CCN2途径。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

 

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图 5.LINC01013与TGF-β途径有关。

 

A）来自钙化主动脉瓣的蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络和B）网络中包含的蛋白质的基因本体富集显示TGF-β信号通路富集（调整后的P值）。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.g005

 

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图 6.TGF-β介导LINC01013激活。

 

A-B）蛋白质印迹（n = 6）（A）和前胶原-Iα测量值（n = 7）（B）表明LINC01013 ASO治疗后胶原蛋白减少。C）TGF-β处理诱导LINC01013表达（n = 8）。D-E）TGF-β介导的CCN2 mRNA表达（n = 8）（D）和蛋白质水平（n = 6）（E）的增加依赖于LINC01013表达。F-G）TGF-β处理后COL1A1表达（n = 8）和胶原-Iα分泌（n = 7）的增加依赖于LINC01013表达。H） TGF-β促进CCN2表达 （n = 7）。I） CCN2 ASO （H） 否定 TGF-β诱导的COL1A1表达水平 （n = 7）。J）卡通说明了LINC01013控制CCN2表达的过程;虚线是一个假设的过程，因为LINC01013与CCN2位点的DNA的直接相互作用仍有待证明。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.g006

 

讨论

本文，对 VAC 的基因组分析鉴定出 SE 被富集用于细胞外基质组织。在这些调节元件簇中，lncRNA-SE富集在开放染色质和具有基因启动子的环中。我们发现了一种lncRNA-SE，LINC01013，它在CAVD期间被上调。功能评估表明，LINC01013位于与CCN2启动子接触的DNA环内。LINC01013充当NELF-E的诱饵因子，从而控制CCN2的转录。LINC01013的表达增加促进了NELF-E从染色质中的解离和CCN2的表达，CCN2编码刺激纤维生成的母细胞蛋白（图6J）。

 

VC中的LncRNA和超增强子

在CAVD中，以前的研究已经确定了失调的lncRNA，如TUG1 [25]和MALAT1 [26]，它们充当miR-204的海绵，miR-204是一种调节成骨转录因子RUNX2水平的microRNA。此外，在CAVD期间，lncRNA H19的表达在VIC中增加，并控制NOTCH1的表达，NOTCH1是细胞命运的关键调节因子[27]。在心脏中，CARMEN是一种lncRNA-SE，它调节前体细胞的心脏规格[28]。据我们所知，本研究是第一个鉴定和表征CAVD中失调的lncRNA-SE的工作。在VIC中，SE的映射揭示了细胞外基质组织，细胞底物粘附和肌动蛋白细胞骨架的富集。这些功能富集代表了房室的显着生物学特征，这些特征在CAVD的发展过程中失调。值得注意的是，VIC中30%的SE是lncRNA-SE，并且富集在开放染色质和环中。这些发现表明，lncRNA-SE可能通过控制调节DNA环中的基因表达来参与细胞命运。LINC01013被优先用于进一步的功能评估，因为这种lncRNA-SE与CCN2的启动子有染色质接触，CCN2是一种参与细胞外基质组织的基因。在外植的AV中，我们在CAVD中发现LINC01013的启动子富含H3K27ac，这是活性染色质的标志。因此，这些发现强调lncRNA-SE在CAVD期间失调，并且涉及与基质组织和VIC激活相关的几个过程。

 

 

 

Conclusions

我们提供的证据表明，lnRNA-SE在CAVD期间失调，并参与细胞命运和细胞外基质组织。具体来说，我们鉴定出LINC01013，一种与CCN2在空间上协调并调节CCN2表达和纤维化反应的lnRNA-SE。LINC01013的表达增加促进CCN2的表达和胶原蛋白的合成。靶向LINC01013可以预防AV的纤维化。

 

方法

道德声明

该协议得到了魁北克大学心脏和肺病学研究所伦理委员会的批准。已获得受试者的书面正式同意。

 

VIC 隔离

从心脏移植过程中从患者获得的非矿化主动脉瓣中分离出VIC。将切成碎片的主动脉小叶在37°C下在0.3%I型胶原酶（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，ON，Canada）中孵育45分钟，然后通过70μm目过滤，然后在1，500rpm下离心5分钟。将细胞重悬于完全培养基（DMEM，10%FBS与L-谷氨酰胺和丙酮酸钠）中，并在传代3至7之间使用。

 

ChIP-seq 文库制备和测序

将分离的VIC在室温下用1%甲醛固定10分钟，然后用甘氨酸淬灭至0.125 M.在1mL PBS 1X / 5%BSA（Sigma-Aldrich，ON，Canada）中收获细胞，然后在4°C下以800 x g离心5分钟，然后除去上清液。将细胞重悬于1mL裂解缓冲液L1A / B（10mM Hepes-KOH pH 7.5，85mM KCl，1mM EDTA，0.5%NP-40含有PMSF，丁酸钠和PIC（Sigma-Aldrich，ON，Canada））中，并在冰上孵育10分钟。将细胞提取物在8，000 x g下离心5分钟，然后用Bioruptor标准超声波器（Diagenode，新泽西州，美国）在450μLL L3缓冲液（5mM Tris-HCl pH 7.5，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5mM EGTA，0.1%脱氧胆酸盐，0.5%肌基，补充PMSF，丁酸钠和PIC）中在冰上超声处理3分钟循环3分钟，交替10秒ON和10秒OFF，振幅为30%。加入Triton-X100至终浓度为1%，并将核提取物在4°C下以18，000×g离心5分钟。 然后在4°C下进行免疫沉淀2小时，其中2μgH3K4me1（#5326，Cell Signaling Technology，New England Biolabs，ON，Canada）或2μgH3K27Ac（#ab4729，Abcam，ON，Canada）预先结合到蛋白质G Dynabeads（Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，ON，Canada）。用冰冷洗涤缓冲液I（20 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1%Triton X-100，0.1%SDS，2 mM EDTA），洗涤缓冲液II（10mM Tris-HCl，250 mM LiCl，1%NP-40，0.7%脱氧胆酸盐，1 mM EDTA）和TET（10 mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA， 0.1%吐温-20）。将DNA蛋白复合物在室温下用100μL1%SDS / TE洗脱40分钟。在加入NaCl至300 mM终浓度后，在65°C下进行反向交联过夜。用0.33mg / mL RNase A（Qiagen，ON，Canada）在37°C下消化1小时RNA，并在55°C下用0.5mg / mL蛋白酶K（Qiagen，ON，加拿大）消化蛋白质1小时。使用DNA清理和浓缩器试剂盒纯化DNA（Zymo Research，Cedarlane，Canada）。使用QIAseq超低输入文库试剂盒（加拿大安大略省Qiagen）构建文库，并进行PCR扩增10-12个周期。根据制造商的说明选择200-1，000 bp的片段。作为对照，对每个ChIP样品进行超声处理后1%的输入染色质文库进行测序。在Illumina HiSeq4000（UCSD IGM Genomics Facility，CA，USA）上使用75-bp读数进行测序。数据可在GEO（加入号GSE154511）中找到。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

 

ATAC-seq 文库制备和测序

原子核从近似2.5 x 105至 4 x 105的 VIC 被处理为如前所述 [33] 进行了一些修改。使用Nextera DNA文库制备试剂盒（美国加利福尼亚州Illumina）的Tn5转座酶和TD反应缓冲液在37°C下进行转置反应30分钟。 然后使用DNA清理和浓缩器试剂盒（Zymo Research，Cedarlane，Canada）纯化转置的DNA，并在20μL洗脱缓冲液（来自DNA净化和浓缩器试剂盒的缓冲EB）中洗脱DNA。首先使用定制合成的指数引物将文库扩增5个周期，然后进行第二次扩增。使用定量实时荧光定量PCR确定适当的额外PCR循环数，方法是绘制Rn值（来自SYBR Green I的荧光信号）与循环数，并确定对应于最大荧光强度三分之一的循环数。将文库进行PCR扩增4-7个循环，然后使用DNA净化和浓缩器试剂盒（Zymo Research，Cedarlane，Canada）进行纯化。使用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒（加拿大安大略省安捷伦）在生物分析仪（加拿大安大略省安捷伦）上评估文库质量。在Illumina HiSeq4000（UCSD IGM Genomics Facility，CA，USA）上使用75-bp读数进行测序。数据可在GEO（加入号GSE154510）中找到。

 

ChIP-seq 和 ATAC-seq 分析

FASTQ文件使用Bowtie2和默认设置映射到UCSC基因组构建hg19。BigWIG 和峰值调用分别使用 bamcoverage 工具和 MACS2 默认参数生成。

 

超级增强剂分析

超强增强子的鉴定如前所述[13，14]进行了一些修改。首先，MACS2用于识别基于H3K27ac峰的增强子，q值阈值为1 x 10−5.与ENCODE[34]黑名单基因组区域重叠的H3K27ac峰被删除。然后，通过执行ROSE [8]（超级增强子的排名排序）算法，使用定义为增强子的其余H3K27ac峰来识别超增强子（SE），该算法具有默认设置（拼接距离为12.5 kb，没有TSS排除）。GREAT [35] 用于确定基因本体（GO）对SE的富集;GREAT使用二项式检验从理论上预期的观测值分布的偏差中识别显着富集，以控制误报，并给出与富集相关的二项式p值。ROSE的SE排名与Wilcoxon排名和测试进行了比较。使用GenometricCorr[36]包评估了SE的开放染色质富集。lncRNA-SE和R-SE是通过使用Bedtools拦截函数和来自GENCODE [15] 版本32数据集的lncRNA的TSS从SE定义的。用HOMER[37]计算lncRNA-SE和R-SE周围的ATAC-seq信号，并使用黄土平滑方法与R绘制。将来自lncRNA-SE和R-SE的5kb中心ATAC-seq信号与Wilcoxon秩和检验进行比较。

 

H3K27ac 高智网

使用来自GEO的GM12878，Naïve T细胞和HCAMSC的H3K27ac HiChIP数据（加入号GSE101498）[38]。用于VIC的H3K27ac HiChIP按照Mumbach等人的描述进行[39]。约100万个VIC与1%甲醛交联15分钟，并用甘氨酸淬灭（终价0.125M）。将细胞与500μL冷HiC裂解缓冲液（10mM Tris-HCl pH 8.0，10mM NaCl，0.2%NP-40，补充PIC，Sigma-Aldrich，ON，Canada）重悬，并在4°C下旋转30分钟。将细胞核在4°C下以2，500×g离心5分钟，用冷HiC裂解缓冲液洗涤，用0.5%SDS重悬并在62°C下孵育10分钟。通过加入40 U的MboI限制性内切酶和50μL的CutSmart缓冲液10X在37°C下消化2小时染色质（新英格兰生物实验室，安大略省，加拿大）。酶在62°C下灭活20分钟。为了用生物素标记DNA悬垂，加入含有生物素-dATP，dCTP，dGTP，dTTP（Thermo Fisher，ON，Canada）和DNA聚合酶I Klenow片段（新英格兰BioLabs，ON，Canada）的混合物，然后在37°C下旋转孵育1小时。然后通过加入含有连接酶缓冲液（加拿大新英格兰BioLabs，ON），10%Triton X-100，BSA（Thermo Fisher，ON，加拿大），4，000U T4连接酶（新英格兰BioLabs，ON，加拿大）和660μL水的连接预混液，在室温下旋转4小时进行连接。然后通过以2，500×g离心5分钟分离细胞核，并重悬于核裂解缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5，10 mM EDTA，1%SDS，补充PIC，Sigma-Aldrich，ON，Canada），然后用生物破碎器标准超声仪在冰上超声处理（Diagenode，新泽西州，美国）。在4°C下以16，100×g和800μLChIP稀释缓冲液（0.01%SDS，1.1%Triton X-100，1.2mM EDTA，16.7mM Tris-HCl pH 7.5，167mM NaCl）澄清样品15分钟。洗涤34μL蛋白G Dynabeads（Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，ON，Canada）并重悬于50μLChIP稀释缓冲液中。然后将样品加入珠中，然后在4°C下旋转孵育1小时。将样品置于磁铁上，并将上清液除去到新管中。加入4μgH3K27ac抗体（#ab4729，Abcam，ON，加拿大），并将样品在4°C下旋转孵育过夜。将34μL蛋白G Dynabeads加入50μLChIP稀释缓冲液中，在4°C下孵育2小时。然后用低盐洗涤缓冲液（0.1%SDS，1%Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl），高盐洗涤缓冲液（0.1%SDS，1%Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl pH 7.5，500 mM NaCl）和LiCl洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，250 mM LiCl， 1%NP-40，1%脱氧胆酸钠，1mM EDTA），并重悬于100μLDNA洗脱缓冲液（50mM碳酸氢钠pH 8.0，1%SDS）中。将样品在室温下孵育10分钟，旋转，然后在37°C下振荡3分钟，然后置于磁铁上。然后将上清液转移到新管中，并将另一个100μLDNA洗脱缓冲液加入珠中进行另一个相同的孵育以获得200μL样品。通过加入蛋白酶K（Qiagen，ON，Canada）进行反向交联，并在55°C下首次孵育45分钟，摇动，然后在67°C下第二次孵育1.5小时。然后用清理和浓缩器试剂盒（Zymo Research，Cedarlane，Canada）纯化DNA，并用QuBit（Thermo Fisher，ON，Canada）进行定量。将5μL链霉亲和素C-1珠（Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，ON，Canada）用吐温洗涤缓冲液（5mM Tris-HCl pH 7.5，0.5mM EDTA，1 M NaCl，0.05%吐温-20）洗涤，并重悬于10μL2X生物素结合缓冲液（10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA，2 M NaCl）中。然后将样品在室温下旋转孵育15分钟，并置于磁铁上。通过加入500μL吐温洗涤缓冲液并在55°C下孵育2分钟振荡，丢弃上清液并将珠子洗涤两次。将珠子在100μL的1X TD缓冲液（2X TD缓冲液为20mM Tris-HCl pH 7.5，10mM氯化镁，20%二甲基甲酰胺）中洗涤，然后重悬于25μL的2X TD缓冲液中，适量的Tn5调节DNA量（约5ng）和水至50μL，然后在55°C下孵育10分钟，间隔振荡。然后将样品置于磁铁上并除去上清液。然后将100μL50mM EDTA加入样品中，在50°C下孵育30分钟，然后在50°C下洗涤两次3分钟，并在吐温洗涤缓冲液中另外两次洗涤55°C，持续2分钟。然后将珠子重悬于10 mM Tris中。将样品置于磁铁和珠子上，重悬于50μLPCR预混液（25μLPhusion HF 2X（新英格兰BioLabs，ON，加拿大），1μL每个Nextera Ad1_noMX和Nextera Ad2.1在12.5μM和23μL水中）。进行以下PCR程序：72°C 5分钟，98°C循环1分钟，然后在98°C下循环15秒，63°C循环30秒，72°C循环1分钟。考虑到DNA的数量，周期数设置为10。将库放置在磁铁上并洗脱到新管中，然后使用清洁和浓缩器套件进行纯化（Zymo Research，Cedarlane，Canada）。通过切割2%琼脂糖凝胶和用PureLink快速凝胶提取纯化的DNA（Thermo Fisher，ON，加拿大）进行文库大小选择（300-700 bp）。使用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒（加拿大安大略省安捷伦）在生物分析仪（加拿大安大略省安捷伦）上评估文库质量。使用NovaSeq 6000 S4（UCSD IGM Genomics Facility，CA，USA）进行了6.9亿次读取的配对端测序。数据可在GEO（加入号GSE154512）中找到。

 

H3K27ac 高智网数据处理

配对端读取使用 HiC-Pro 与默认设置对齐。使用Juicer从HiC-Pro生成的allValidPairs文件中生成接触矩阵[40]。Juicebox [41] 用于矩阵可视化。最可信的相互作用（FDR <0.01）是用FitHiChIP确定的[42]。使用Juicer倾倒由6号染色体的香草覆盖平方根以5 kb分辨率归一化的基质。该矩阵用于生成带有 R 的虚拟 4C，考虑了与包含LINC01013的 TSS 的 bin 的所有交互。H3K27ac HiChIP 1D 轨道的 VIC 是使用 HiC-Pro 生成的 BAM 文件中的 bamcoverage 生成的。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

 

核糖核酸测序

对从心脏移植期间收获的心脏收集的10个对照非矿化AV进行RNA测序，以及从接受主动脉瓣置换术的患者中收集的19个手术外植的矿化AV（CAVD）。每个人的瓣膜小叶在-80°C下保存。 使用Mini Bead Mill均质机（VWR，QC，加拿大）用TRIzol中的珠子压碎每个阀门一个小叶，并根据制造商的说明用RNeasy Mini Kit（加拿大安大略省Qiagen）提取RNA。基因表达由Illumina HiSeq 2000平台评估。TopHat和袖扣用于对齐和组装读数。STAR 生成的读取计数矩阵使用 edgeR 包使用 calcNormFactor 函数和修剪均值 M 值 （TMM） 方法进行归一化。然后将瓣膜组之间的差异基因表达与Limma进行比较。对多次测试的校正是用Benjamini和Hochberg校正进行的。调整值为P<0.05的LncRNA被认为是差异调节的。

 

染色体构象捕获 （3C）

如前所述进行3C实验[43]。简而言之，将1000万个VIC与1%甲醛交联15分钟，用甘氨酸淬灭（0.125 M最终），并用冷裂解缓冲液（10mM Tris-HCl pH 7.5，10 mM NaCl，0.2%NP-40，补充PIC，Sigma-Aldrich，ON，加拿大）。通过在4°C下以400×g离心5分钟分离细胞核，然后在CutSmart缓冲液1.2X（加拿大安大略省新英格兰生物实验室）和0.3%SDS中重悬。在加入Triton X-100（最终2%）之前，在37°C下孵育1小时，同时以900rpm振荡，并在相同条件下再孵育一小时。DNA在37°C下用400 U PstI（新英格兰BioLabs，ON，Canada）消化过夜，然后通过在65°C下加入1.6%SDS来灭活酶25分钟。然后将反应物用1%Triton X-100连接缓冲液1.15X（新英格兰生物实验室，ON，加拿大）稀释20倍，并在16°C下用1，000U T4连接酶（新英格兰生物实验室，ON，加拿大）连接过夜。然后通过蛋白酶K（Qiagen，ON，Canada）在65°C下过夜进行反向交联。用RNase A（Qiagen，ON，Canada）消化RNA，然后通过苯酚/氯仿提取纯化连接的DNA片段，并通过定量实时PCR（qPCR）进行分析。

 

qPCR使用位于CCN2TSS上游的PstI切割位点作为锚点，对连接产物进行定量。对于所有片段，我们首先使用基因组GAPDH未消化对照进行归一化，然后我们使用锚点和最近的下游PstI位点（#1）之间的连接产物水平作为强归一化器来纠正基因组随机相互作用，如前所述[44]。进行了两次生物重复，并一式三份进行qPCR以提高灵敏度。引物序列在S6表中提供。

 

细胞转染和TGFβ治疗

用HiPerFect转染试剂转染VIC（加拿大安大略省Qiagen）。对LINC01013和CCN2进行72小时的敲低，转染寡核苷酸抗sens（ASO）对LINC01013（80 nM），CCN2（40 nM）或NC5作为阴性对照（IDT，IL，USA）。使用10 ng / mL重组人TGF beta 1在转染24小时后48小时进行TGFβ刺激（Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，ON，Canada）。

 

ChIP-qPCR

来自主动脉瓣的矿化和非矿化组织在1ml含有PIC的磷酸盐缓冲盐水（PBS）1X中均质化（Sigma-Aldrich，ON，加拿大）。将匀浆样品在4°C下以800×g离心5分钟，将沉淀重悬于含有PIC的PBS 1X中，并在4°C下以800×g离心5分钟。 然后使用颗粒进行ChIP实验。VIC中的ChIP是用大约200万个细胞进行的。将来自组织或VIC的沉淀与1%甲醛交联15分钟，用甘氨酸淬灭（0.125M终价），并在4°C下以800×g离心5分钟。 除去上清液，然后将沉淀重悬于500μL裂解缓冲液（50mM Hepes-KOH pH 7.5，140mM NaCl，1mM EDTA，1%Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，补充PIC，Sigma-Aldrich，ON，加拿大）。超声处理导致平均长度为400 bp.2μg的抗体片段化，其针对H3K27Ac（#ab4729，Abcam，ON，Canada），RNAPII（#ab26721，Abcam，ON，Canada），RNAPII-Ser5p（#ab5131，Abcam，ON，Canada），NELFE（#10705-1-AP，Proteintech，IL，USA）或同种型IgG（Cell Signaling Technology，New England Biolabs，ON，Canada）与蛋白质G dynabeads（Life technologies， 赛默飞世尔科技，安大略省，加拿大）6小时，然后将DNA样品添加到抗体/dynabead混合物中，并在旋转器上在4°C下孵育过夜。第二天，用低盐缓冲液（0.1%SDS，1%Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl pH 8.0和150mM NaCl）洗涤样品。使用高盐缓冲液（0.1%SDS，1%Triton X-100，2 mM EDTA，20 mM Tris-HCl pH 8和500 mM NaCl）进行第二次洗涤，然后使用LiCl缓冲液（10mM Tris-HCl pH 8，250 mM LiCl，1 mM EDTA，1%NP-40），最后用TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8，1 mM EDTA）。然后通过加入200μL洗脱缓冲液（1%SDS，100mM NaHCO）洗脱复合物3） 在 65°C 下持续 1 小时。洗脱后的样品在65°C下反向交联过夜。使用DNA清理和浓缩器试剂盒（Zymo Research，Cedarlane，Canada）纯化DNA片段，并使用LINC01013的TSS区域（F：gaggcagttctatctggttttt，R：tctatccagaccacttgtgtttag），CCN2（F：actggctgtctcctctctcagc，R：tgtaggactccattcagctcat）特异性引物通过qPCR测定分析样品。

 

核和细胞质RNA纯化

根据制造商的说明，使用细胞质和核RNA纯化试剂盒（加拿大安大略省Norgen Biotek）对LINC01013的核和细胞质进行定量。U6和HPRT分别用作核室和细胞质室的对照。我们将每个区室的数据与细胞中的总RNA水平进行归一化。

 

实时荧光定量 PCR

使用RNeasy Mini试剂盒（加拿大安大略省Qiagen）纯化和非矿化主动脉瓣组织的RNA。用E.Z.N.A.微RNA试剂盒（Omega Bio-tek，VWR，QC，Canada）分离来自VIC的RNA。使用来自Quanta（VWR，QC，Canada）的Qscript cDNA超混合反向转录一μgRNA。qPCR是用Quanta的perfecta sybr超混音在Rotor-Gene 6000系统上进行的（Corbett Robotics Inc，CA，USA）。LINC01013的引物来自IDT（IDT，IL，USA）（F：ctaaacaagtggtctggataga，R：tttggatcaccaaggcaag）。CCN2和COL1A1的底漆是从Qiagen（加拿大安大略省）购买的。次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRT）（加拿大安大略省Qiagen）的表达被用作使结果归一化的参考。

 

10th百分位数），PPI对是根据TissueNet数据推断出来的。为了生成PPI网络，提取了CCN2的相互作用组，包括COL1A1，SMAD2，SMAD3和TFGB1。为此，包括CCN2，COL1A1，SMAD2，SMAD3和TFGB1在内的相互作用对被隔离以形成边缘列表。为了可视化网络，使用了NetworkAnalyst [46]。

 

胶原蛋白免疫染色

将人类VIC接种在聚-L-赖氨酸涂层玻璃盖玻片上。用PBS 1X洗涤细胞一次，并在室温下固定在3.7%甲醛中30分钟。用PBS 1X中的50mM NH4Cl处理细胞20分钟，并在含有0.2%Triton X-100的PBS 1X中透化10分钟。然后将细胞在含有5%牛奶的PBS 1X中孵育一小时，在室温下持续搅拌。用抗COL1A1（#E8F4L，细胞信号传导技术，新英格兰生物实验室，安大略省，加拿大）在PBS 1X中进行孵育，在4°C下过夜1%牛奶。 用PBS 1X洗涤细胞四次，然后用FITC偶联的抗兔二抗孵育一小时（Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific，ON，Canada）。单独使用二抗作为阴性对照。使用由Zen软件驱动的蔡司显微镜LSM800（Objective 20X油，1.4 NA，蔡司，ON，加拿大）安装载玻片并获取分析图像。使用ImageJ 1.47g（美国NIH）进行图像处理和定量。在去除阴性对照的背景后计算每个细胞的综合密度。

 

统计分析

连续数据表示为SEM±平均值，使用夏皮罗-威尔克测试正态性进行测试。对于两组，将正态分布的数据与学生 t 检验进行比较，对于两个以上具有方差分析的组。对于具有非正态分布的数据，将两组与Wilcoxon-Mann-Whitney检验或与Kruskal-Wallis检验进行比较，用于两组以上。使用多变量回归来调整年龄和性别。将分类数据与Fischer的精确测试进行比较。使用JMP 14.2.0或Prism 8.0.2进行统计分析。

 

支持信息

主动脉瓣组织和瓣膜间质细胞（VIC）的实验方法用于多维分析和功能分析。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

 

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S1 图主动脉瓣组织和瓣膜间质细胞（VIC）的实验方法用于多维分析和功能分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s001

 

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S2 图H3K27ac HiChIP 接触矩阵在 VIC 中。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s002

 

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S3 图为确定CAVD中失调的lncRNA-SE的优先级而进行的实验和分析方案。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s003

 

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S4 图

A） NELF-E 的 ChIP-qPCR 在 LINC01013 的启动器上。B） COL1A1 对 VAC 进行免疫染色。将NC5或ASO与LINC01013的条件与配对的t检验进行比较，并将TGFB条件与方差分析和Tukey检验进行比较，以进行事后分析。n = 50 对于每个条件。

 

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s004

 

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S1 表。使用ROSE算法在VAC中鉴定的超增强子。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s005

 

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S2 表。使用HOMER算法在VIC中鉴定的超级增强子。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s006

 

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S3 表。lncRNA-SE列表。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s007

 

（XLSX）

 

S4 表。lncRNA在对照非矿化和矿化主动脉瓣之间差异表达。-厦门畜牧期刊杂志论文发表

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s008

 

（XLSX）

 

S5 表。lncRNAs在源自SE-lncRNA的CAVD中差异调节。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s009

 

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S6 表。与来自SE-lncRNA的差异调节的lncRNA相互作用的蛋白质编码基因。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s010

 

（XLSX）

 

S7 表。3C实验的引物序列。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s011

 

（XLSX）

 

S8 表。LINC01013与CPAT的编码潜力。

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010010.s012

 

（XLSX）

 

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