PGRP-SA 的细菌识别和 Toll/DIF 的下游信号传导可维持果蝇中的共生肠道细菌-厦门畜牧期刊杂志论文发表
希沃胡姆·巴胡古纳，玛格达·阿蒂拉诺，马库斯•格利特伯格，李多洪，斯里什蒂·阿罗拉，王丽辉，周军，西亚马克·雷德海，迈克尔•布特罗斯，彼得罗斯·利戈西加基斯
出版日期： 2022年01月10日
抽象
肠道为共生细菌的存活设定免疫和代谢参数。我们报告说，在果蝇中，Toll/NF-κB信号传导上游细菌识别的缺乏导致肠道细菌的密度和多样性降低。翻译调节因子4E-BP是Toll/NF-κB的转录靶标，介导了这种宿主-细菌组相互作用。在健康的苍蝇中，拓领激活了4E-BP，使脂肪分解代谢成为可能，从而维持了细菌组。肠道细菌的存在使拓领保持了信号传导活动，从而确保了自身保存的反馈循环。当Toll活性不存在时，TOR介导的4E-BP抑制使脂肪资源难以获得，这与肠道细菌密度的丧失有关。这可以通过遗传或药理学抑制TOR来克服，这恢复了细菌密度。我们的研究结果深入了解了动物如何整合免疫传感和新陈代谢，以维持健康肠道中的本土细菌。
作者简介
肠道细菌（统称为细菌组）对动物的生理学有益，但它们如何被宿主保留是一个悬而未决的问题。在这里，我们报告说，苍蝇的免疫系统识别这些细菌并激活代谢途径，导致脂质的调节分解。后者似乎对保留肠道细菌很重要，因为当脂质储存积累时，可以从苍蝇肠道中培养出来的肠道细菌的数量显着减少。在免疫识别或反应降低的苍蝇突变体中，TOR途径是代谢和生长的主要途径，可抑制脂质分解并导致肠道中脂肪堆积增加。阻断这种途径（药理学或遗传学上）将脂质水平以及可培养的肠道细菌的密度恢复到正常水平。我们的研究结果表明，免疫和新陈代谢之间的这种相互作用与脂质分解代谢中心的调节对于肠道细菌组的保留很重要。
数字
Fig 10Fig 11图1图2图 3Fig 4Fig 5Fig 6Fig 7Fig 8Fig 9Fig 10Fig 11图1图2图 3
引文：Bahuguna S，Atilano M，Glittenberg M，Lee D，Arora S，Wang L等人（2022）PGRP-SA的细菌识别和Toll / DIF的下游信号传导维持果蝇中的共生肠道细菌。PLoS Genet 18（1）：e1009992。https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992
编辑 器：Gregory P. Copenhaver，北卡罗来纳大学教堂山分校，美国
收到：三月 31， 2021;接受：十二月 14， 2021;发表：一月 10， 2022
版权所有：© 2022 Bahuguna et al.这是一篇根据知识共享署名许可协议条款分发的开放获取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用，分发和复制，前提是注明原始作者和来源。-厦门畜牧期刊杂志论文发表
数据可用性：所有相关数据均在稿件及其支持信息文件中。
资金：这项工作得到了欧洲研究委员会综合资助310912 PL的支持。资助者在研究设计，数据收集和分析，发表决定或手稿准备方面没有发挥任何作用。
相互竞争的利益：作者宣布不存在相互竞争的利益。
介绍
动物肠道容纳了各种各样的细菌，它们有助于调节消化，营养和代谢物的供应以及免疫发育[在1中回顾]。为了从这些微生物中获益，宿主提供了一个共生环境，用于在肠道中维持它们[2]。果蝇肠道及其细菌组被用作研究这种宿主 - 微生物相互作用的更简单模型[2]。虽然与人类相比，苍蝇的多样性要小得多，但苍蝇细菌组同样具有动态性，并且随着年龄的增长和环境条件而变化，这与苍蝇培养过程中的再感染有关[回顾3，见4-9]。
果蝇肠上皮具有免疫活性，在肠道感染时通过NF-κB途径IMD启动先天免疫应答，介导抗菌肽（AMPPs）的产生以及以双氧化酶为中心的途径，双氧化酶是产生活性氧（ROS）所需的酶[10–12]。然而，它也保留了共生菌，因为AMPs的转录被尾[13]和Nubbin[14]抑制，而细菌来源的尿嘧啶对于区分病原体和共生菌很重要[15]。
雷帕霉素（TOR）途径的进化保守靶标是控制细胞代谢和生长的主要途径[在16中回顾]。TOR通过TORC1蛋白复合物的活性平衡细胞中的脂质和葡萄糖合成代谢和分解代谢[16]。TORC1主要通过eIF4E结合蛋白（4E-BP / Thor）和p70S6激酶1（S6K1）的磷酸化促进蛋白质合成[16]。4E-BP是一种翻译抑制剂，它结合并抑制eIF4E的活性，eIF4E是真核生物翻译起始因子，负责在mRNA的5'-cap处募集40s核糖体亚基。4E-BP的磷酸化降低了其对eIF4E的亲和力[17]。这释放了eIF4E，使其能够促进与电容相关的翻译[17]。在S6K1的情况下，活化的S6K1通过激活mRNA翻译起始的诱导剂同时降解抑制剂来促进蛋白质合成[17]。
果蝇TOR因其在生长和发育中的作用而被广泛研究，使用苍蝇突变体或用雷帕霉素治疗苍蝇[18–21]。雷帕霉素在应激条件下的治疗导致4E-BP活性的上调，导致全蝇脂质储备增加，可用于这些应激条件的长期生存[22]。相反，4E-BP突变体无法保存脂质储备，因此在饥饿或氧化应激后损害了生存[22]。更广泛地说，共识是，在果蝇和小鼠中，4E-BP在饥饿和氧化应激等应激条件下调节脂肪水平[23]。在幼虫阶段和营养价值低的食物中，共生植物乳杆菌的存在对于通过TOR维持发育非常重要，而TOR反过来又对于维持这种互惠关系至关重要[24]。肠道的代谢状态也受到饮食条件的影响，进而影响细菌组。微生物群的饮食依赖性适应性需要对转化调节剂4E-BP进行NF-κB依赖性控制，而TOR和NF-κB"满足"[25]。
果蝇有三种NF-κB蛋白，即Relish，背侧和背侧相关免疫因子（DIF）[26]。DIF位于拓领信号通路的下游[在27中回顾]。Toll和Toll样受体（TLR）信号传导是最重要的进化保守机制之一，通过该机制，先天免疫系统感知病原微生物的入侵。然而，与其哺乳动物对应物不同，果蝇Toll被内源性细胞因子样配体激活，即神经生长因子同系物Spz [28]。Spz通过Spz加工酶（SPE）[29]加工成其活性形式。两个丝氨酸蛋白酶级联反应在SPE上汇聚：一个由细菌或真菌丝氨酸蛋白酶通过宿主丝氨酸蛋白酶Persephone触发[30–33]，另一个由识别细菌或真菌细胞壁的宿主受体激活[32，33]。在这些宿主受体中，最突出的是肽聚糖识别蛋白-SA或PGRP-SA [34]。PGRP-SA与细菌细胞壁上的肽聚糖结合，没有结构偏好，但取决于可及性[35]并产生下游信号。
当识别信号到达细胞表面时，它通过Toll受体和膜结合受体 - 适配器复合物（包括dMyd88，Tube（作为IRAK4功能等效物）和Pelle激酶（作为IRAK1功能同系物）在细胞内传递[36]。信号的转导最终导致IκB同系物的磷酸化，仙人掌可能是由Pelle[37]，留下NF-κB同系物DIF移动到细胞核并调节数百个靶基因，包括抗菌肽（AMPs）[27]。
在这项研究中，我们提出了PGRP-SA对于保持共生肠道细菌密度的重要性的证据。我们的研究结果表明，缺乏PGRP-SA或DIF的幼虫和成虫的共生肠道细菌密度显着降低。雷帕霉素或TOR RNAi在肠细胞中抑制TOR活性，恢复PGRP-SA或DIF突变内脏中的细菌密度（但不是多样性）。然而，果蝇突变体的PGRP-SA和肠细胞中4EBP的缺乏者在雷帕霉素处理或TOR RNAi时无法恢复细菌密度，证明了4EBP的重要作用。PGRP-SA突变体增加了肠细胞中的肠道脂肪储存，这些脂肪储存通过雷帕霉素或TOR-RNAi处理恢复到正常水平。这种修复在PGRP-SA;4EBP双突变体中失败，表明4EBP在调节肠道中的脂肪储存方面至关重要。脂肪分解代谢对于肠道细菌的恢复很重要，因为如果甘油三酯脂肪酶Brummer在肠细胞中被敲低，缺乏PGRP-SA并用雷帕霉素治疗的苍蝇无法恢复细菌密度。这种机制可以深入了解宿主如何整合免疫和代谢以维持肠上皮处的共生细菌。-厦门畜牧期刊杂志论文发表
结果
PGRP-SA和DIF的丧失改变了果蝇肠道中可培养的细菌密度
细菌识别蛋白PGRP-SA因其在感染时与革兰氏阳性细菌（例如金黄色葡萄球菌，粪链球菌，苏云金芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌和黄体微球菌）的相互作用而被广泛研究，但其与共生细菌的潜在关联尚未得到探索。因此，我们想研究PGRP-SA的丢失是否对肠道细菌有任何影响。为此，我们使用了携带PGRP-SA的苍蝇。塞姆突变 [34]。我们分析了不同年龄（幼虫期，以及5天和30天龄的成年苍蝇）雌性yw seml和yw苍蝇的可培养肠道微生物负荷（图1A）。我们观察到可培养的肠道微生物负荷显着降低（log103龄yw seml突变幼虫的菌落形成单位或CFU）与其yw遗传背景幼虫的比较。在5天大的yw seml成人的肠道中也观察到类似的减少。相比之下，与遗传背景相比，30天龄的yw seml苍蝇在可培养的细菌负荷方面没有显着差异（图1A）。
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图 1.细菌PGRP-SA或NF-κB同系物DIF的宿主受体的丧失会降低肠道中可培养的细菌密度。
（A）缺乏PGRP-SA的幼虫和5天龄的成虫的可培养细菌密度显着降低，而较老的PGRP-SA则不是这种情况塞姆突变苍蝇（30天大）苍蝇。（B）这不是遗传背景的影响，因为5天大的PGRP-SA塞姆DGRP系25174背景中的突变蝇也显示出可培养细菌负荷降低。（C）对PGRP-SA的要求是在肠细胞（EC）中，因为PGRP-SA的RNAi通过EC特异性NP1-GAL4驱动导致可培养细菌负荷显着降低。（D）果蝇NF-κB同源DIF，PGRP-SA和Toll受体的下游，对于维持细菌密度也很重要。（E）肠道CFU的减少不依赖于遗传背景，因为作为年龄匹配的yw; dif对应物，25174;苍蝇也显著降低了细菌密度。（F）苍蝇的寿命缩短。每个点代表一个肠道（幼虫和每个成虫类别的n = 15），在三个独立实验中进行的实验（每个实验n = 5）。使用学生的 t 检验对突变体和对照组的 log10 CFU 值进行统计比较（ns = 不显著，*p < 0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.g001
为了排除可培养的肠道细菌的负荷减少是由于遗传背景，我们通过了PGRP-SA塞姆通过12代重复的回交突变进入25174菌株的背景。这是来自果蝇遗传学参考小组（DGRP）建立的自然种群的几种完全测序的近交苍蝇系之一[38]。经比较，我们发现5天大女性DGRP 25174塞姆与DGRP 25174遗传背景相比，苍蝇的可培养细菌负荷也显着降低（图1B）。这一减少是根据观察到的yw PGRP-SA的差异得出的塞姆突变蝇，证实可培养细菌的丧失是由于缺乏功能性PGRP-SA，而不是由于遗传背景。
共生菌在肠道粘膜层中分隔，该层由细胞外细菌识别蛋白，AMP和由肠道上皮控制的ROS分泌物组成[2]。因此，我们试图评估肠细胞分泌的PGRP-SA是否会影响粘膜层中的共生细菌负荷。我们通过使用GAL4 / UAS系统（在这种情况下为NP1-GAL4）在成人肠细胞中对PGRP-SA进行细胞特异性敲低（RNAi）来测试这一点。类似于整个突变PGRP-SA塞姆苍蝇，肠细胞特异性PGRP-SA瑞艾还导致可培养的肠道细菌负荷显着减少（图1C）。
肠道细菌的存在刺激了小鼠果蝇[39]和LGR5 +细胞（肠细胞的祖细胞）的肠道干细胞增殖和分裂[40]。细菌负荷的损失导致PGRP-SA肠道中的肠干细胞（ISCs）减少到成肠细胞（EB）塞姆苍蝇（S1 图）。通过在所有祖细胞中表达的Toll受体（UAS-Toll10B）的组成活性形式的转基因和PGRP-SA中挽救的ISC增殖显着刺激ISC增殖显着高于野生型塞姆 (S2 图）。这表明，当PGRP-SA不起作用时，拓领刺激的下游信号能够拯救ISC。-厦门畜牧期刊杂志论文发表
为了确定通常接收PGRP-SA / Toll信号的转录因子，即NF-κB同系物DIF是否也参与保存年轻苍蝇的肠道细菌负荷，我们分析了5天和30天大的肠道1突变 体。我们观察到DIF的损失导致5天龄雌性苍蝇的可培养肠道细菌负荷显着降低（图1D）。当通过12代回溯时，也观察到了相同的情况，1突变被纳入DGRP 25174遗传背景（图1E）。最后，当肠道细菌密度通过肠细胞中的RNAi沉默时，肠道细菌密度的显着降低也是这样（S3A图）。值得注意的是，这些结果与已经报道的另一种果蝇NF-κB蛋白的丢失形成鲜明对比，即Relish，其损失不会影响标准饮食中的肠道细菌CFU[25]。我们通过监测果蝇微生物组中两个最具代表性的属的16rRNA基因表达来测试这一点，即Relish突变蝇中的醋酸杆菌和乳酸杆菌。我们发现这些细菌的肠道CFU在rel中显着增加E20型苍蝇与杂合子相比E20型/+或野生类型控件（S3B 图）。然而，就像PGRP的情况一样塞姆， 30 天大的 dif1苍蝇的肠道中具有可培养的细菌负荷，与它们的遗传背景相当（图1D）。
最后，dif的寿命1与它们的遗传背景相比，苍蝇显着减少（图1F）。在PGRP-SA中也观察到寿命显着缩短塞姆苍蝇（S4A 图）。两个PGRP-SA中细菌密度的损失塞姆和dif1突变蝇表明，规范Toll信号通路的成员参与了年轻果蝇肠道微生物组的塑造。通过观察该途径的另一个成员，Toll配体Spz证实了这一点，spz的苍蝇突变体显着减少了肠道CFU（S4B图）。
鉴于上述对寿命的影响，我们很想知道为什么宿主与可培养共生细菌的关联减少只在年轻的苍蝇中表现出来。这种效应是否也可以在年长的苍蝇身上发现，但被我们培养的小瓶中持续排便和再次感染所掩盖？为了解决这个问题，我们从成年期的第1天到第30天每12小时更换一次小瓶，以减少再次感染。从第1天到第30天，yw和25174苍蝇的CFU被减少但稳定，表明即使在食物瓶的快速周转下，也具有稳定的关联状态（S5图）。相反，PGRP-SA中的可培养共生菌塞姆与对照组相比，苍蝇的有效细菌种群规模较低，并在第30天显示出迅速减少到显着较低的水平，表明在yw和25174遗传背景中都存在依赖于PGRP-SA的瓶颈（S5图）。
年轻的PGRP-SA突变蝇缺乏乳酸菌科
可培养细菌的丧失促使我们研究对肠道细菌整体的影响，包括细菌组的不可培养成分。为此，我们通过半定量PCR测量了5日龄果蝇肠道中16S细菌rRNA基因的总量，发现两只PGRP-SA均显著减少。塞姆和dif1与控件（S6 图） 进行比较。测试PGRP-SA多样性的变化塞姆肠道细菌组我们进行了16S rRNA基因高通量DNA测序。在雌性yw与ywPGRP-SA的肠道中检测到的细菌家族的相对丰度塞姆苍蝇（5天和30天大）如图2A所示。5日龄雌蝇的内脏以乳酸菌科（48%）和醋杆菌科（23%）为主，同时存在红藻科、丙酸杆菌科和其他细菌家族（29%）。乳酸杆菌科在幼蝇肠道中的优势与先前的研究相关[41]。与此相反，年轻的5天大女性ywPGRP-SA塞姆突变蝇的乳酸菌科相对丰度显著降低，仅占肠道微生物组总数的0.6%。乳酸菌科的这种减少也在其生物重复中观察到（S7图）。此外，ywPGRP-SA中醋杆菌科的相对丰度塞姆突变蝇增加到肠道微生物组总量的63%，其余36.4%包括其他细菌家族（图2A和S7）。
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图 2.PGRP-SA的缺失会改变幼蝇的肠道细菌组成。
（A）该图代表了16S下一代测序揭示的在5天龄和30天龄雌性yw，ywseml蝇的肠道中观察到的细菌家族的相对丰度。 x 轴表示不同年龄的 y 应变，y 轴表示相对映射的读数。（n = 40 内脏/菌株）。（B）这些图表代表了两个年龄段（5天和30天）雌性yw和yw seml的α多样性指数。（A）辛普森（1-D）指数，（B）香农H指数和（C）观察到的细菌家族总数（抽泣）。R表示生物重复。（n = 40 内脏/菌株）。（C）该图代表了两个年龄段（5天和30天）雌性yw和yw seml的PCA图（Beta多样性）。R代表生物重复（n = 40个胆量/菌株）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.g002
与5天龄的细菌组成相似，30天龄的雌性yw苍蝇显示出乳酸杆菌科（47%）和醋杆菌科（15%）的主导地位。与他们5天大的兄弟姐妹相比，30天大的ywPGRP-SA塞姆苍蝇显示乳酸杆菌科（43%）显着增加，这是细菌组中最丰富的家族，其次是醋杆菌科（22%）（图2A）。30天龄ywPGRP-SA的相对丰度塞姆苍蝇与30天大的苍蝇没有区别。
对α和β多样性进行统计测试，以评估飞线内和飞线之间细菌组的多样性（图2B）。记录了大约116个细菌家族（S对象）在年轻的yw苍蝇中，这几乎与年龄为30天的苍蝇相同（≈117个家庭）。同样，在年轻的ywPGRP-SA中报告的细菌家族数量塞姆苍蝇（≈149个家族）几乎与ywPGRP-SA相同塞姆苍蝇年龄为30天（≈150个家庭）（图2B）。阿尔法多样性测量显示，5天大的ywPGRP-SA塞姆（Simpson 1-D = 0.5768，Shannon H = 1.499）的多样性不如yw苍蝇（Simpson 1-D = 0.7004，Shannon H = 1.673）。然而，当苍蝇达到30天大时，ywPGRP-SA的细菌组塞姆苍蝇（辛普森1-D = 0.7465，香农H = 1.864）变得比yw苍蝇（辛普森1-D = 0.7086，香农H = 1.627）更加多样化（图2B）。ywPGRP-SA中显性醋酸杆菌水平随年龄的变化塞姆突变苍蝇可能是这种多样性模式的原因。Yw苍蝇在这两个年龄段的多样性模式中没有显示出这样的变化，如图2B所示。这可能是由于相似的相对丰度模式和几乎相同的S对象5至30天大的苍蝇。-厦门畜牧期刊杂志论文发表
进行β多样性分析以检查单个苍蝇线之间细菌组成的差异。主成分分析（PCA）是一种了解多维空间差异的工具，通常用于测量果蝇微生物群落的β多样性[7，42]。Beta多样性分析（PCA图）证实yw和ywPGRP-SA塞姆在5天和30天龄的苍蝇中聚集得很远，这表明它们彼此不同。有趣的是，30天大的ywPGRP-SA塞姆苍蝇似乎与PCA图所示的5天大的遗传背景（yw）相似（图2C）。这可能是因为这两种苍蝇与醋杆菌科（ywPGRP-SA）的显性家族几乎相同。塞姆30 天 = 22%，yw 5 天 = 23%）和乳酸杆菌科（ywPGRP-SA塞姆30 天 = 43%，yw 5 天 = 48%）。
PGRP-SA中TOR的遗传或药理学抑制塞姆苍蝇恢复可培养肠道细菌的密度
肠道细菌密度取决于宿主代谢[43]。肠道细菌依靠消化宿主饮食和肠道分泌物产生的营养物质而茁壮成长，并受到宿主特异性选择压力的影响，如肠道环境、食物偏好和饮食习惯[43]。因此，我们测试了主要代谢途径TOR在调节ywPGRP-SA细菌密度中的作用。塞姆苍蝇。
如图3A所示，通过RNAi在5日龄ywPGRP-SA的肠细胞中沉默TOR塞姆与未经处理的ywPGRP-SA相比，突变蝇导致可培养微生物负荷增加10倍塞姆.为了证实，我们进行了对称实验，其中TOR被雷帕霉素药理学阻断。观察到类似的结果，表明可培养的肠道细菌恢复（图3B）。此外，用雷帕霉素治疗恢复了肠上皮与能够再次分裂的ISCs一起更新的能力（S8图）。
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图 3.在没有PGRP-SA的情况下，果蝇TOR的抑制可恢复肠道细菌密度。
雄性ywPGRP-SA肠细胞中TOR（通过RNAi）的沉默塞姆苍蝇或（B）药理学抑制TOR活性（通过在食物中施用雷帕霉素）恢复肠道细菌负荷。对于面板A，每个点是面板B的一个肠（每个类别n = 15，总共三个独立实验），每列是三个独立实验的中位数（每个实验n = 20）。使用学生的 t 检验（ns = 不显著，**p<0.01，***p<0.001）进行统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.g003
然而，恢复年轻ywPGRP-SA中的细菌密度塞姆苍蝇没有恢复多样性（图4A）。雷帕霉素治疗或dTOR的16S肠道细菌库的测序瑞艾-处理过的 ywPGRP-SA塞姆苍蝇，表明乳酸菌科的缺失没有得到恢复。如图4A所示，雷帕霉素（+Rap）治疗年轻（5天大）雌性yw和ywPGRP-SA塞姆苍蝇导致其相对丰度的变化。在yw蝇中，雷帕霉素治疗导致乳酸杆菌科减少3倍（yw为48%，yw + Rap为17%），醋杆菌科增加3倍（yw为23%，yw + Rap为70%），丙酸杆菌科减少10倍（yw为6%，yw + Rap为0.6%）。约118和116个细菌家族（S对象）分别在雷帕霉素处理和未处理的yw蝇中报告（图4B，5天）。Alpha多样性分析表明，用雷帕霉素治疗yw苍蝇降低了肠道细菌的多样性（yw：Simpson1-D = 0.7004，Shannon H = 1.673;yw + Rap： Simpson 1-D = 0.4785， Shannon H = 1.107） （图4C，5天）.通过分析PCA图（图4C）证实了yw和yw + Rap之间细菌组成的差异。这些结果表明，雷帕霉素降低了幼蝇中细菌组成的多样性。
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图 4.抑制果蝇TOR不能恢复细菌多样性。
（A）该图代表了在5日龄雌性yw，ywseml（雌性）和ywseml的肠道中观察到的细菌家族的相对丰度;NP1GAL4>UAS-TOR瑞艾16S下一代测序显示的（+）或不联合（-）雷帕霉素治疗的苍蝇（雄性）。x 轴表示不同基因型和处理的 y 菌株，y 轴表示相对映射读数。（n = 40 内脏/应变/治疗）。（B）这些图表表示雌性yw、ywseml和ywseml的α多样性指数;NP1GAL4>UAS-TOR瑞艾两种治疗方法（联合或不联合雷帕霉素）。（A）辛普森（1-D）指数，（B）香农H指数和（C）观察到的细菌家族总数（抽泣）。（n = 40 内脏/应变/治疗）。（C）该图表示雌性yw、ywseml和ywseml的PCA图（Beta多样性）;NP1GAL4>UAS-TOR瑞艾两种治疗（联合或不联合雷帕霉素;n = 40内脏/菌株/治疗）。
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如图4A所示，雷帕霉素处理对ywPGRP-SA微生物家族的相对丰度没有重大影响塞姆突变苍蝇。治疗和未治疗的女性ywPGRP-SA塞姆与它们的遗传背景（分别为17%和48%）相比，苍蝇缺乏乳酸杆菌科（分别为0.5%和0.6%）。醋杆菌科主要主导了经过治疗和未治疗的ywPGRP-SA的肠道细菌种群。塞姆苍蝇（分别为59%和63%）。总体而言，有 141 和 149 个细菌家族（S对象）报告在雷帕霉素治疗与未治疗的ywPGRP-SA中塞姆分别飞翔（图4B）。这表明，尽管雷帕霉素抑制dTOR，但ywPGRP-SA中的细菌组密度恢复。塞姆苍蝇它不影响细菌组的多样性。
雷帕霉素治疗30日龄女性ywPGRP-SA塞姆苍蝇导致肠道微生物组成的变化，其主要特征是醋杆菌科增加4倍（ywPGRP-SA为21%） 塞姆在ywPGRP-SA中为 85%塞姆+Rap）和乳酸杆菌科减少15倍（在ywPGRP-SA中为43%）塞姆在ywPGRP-SA中为 3%塞姆+ 说唱） （S9A 无花果）.约87和150个细菌家族（S对象）报告用于雷帕霉素治疗和未治疗的30天龄ywPGRP-SA塞姆分别为苍蝇，提示雷帕霉素治疗后多样性丧失。α多样性分析证实了这一点，该分析显示雷帕霉素治疗30天龄ywPGRP-SA塞姆与未经处理的对照相比，苍蝇导致多样性降低。PCA图通过将雷帕霉素处理和未处理的ywPGRP-SA进一步证实了这一结果。塞姆苍蝇彼此相距甚远，这再次表明雷帕霉素影响了30日龄ywPGRP-SA的微生物组成和多样性。塞姆苍蝇 （S9B 图）。这一结果与5日龄的苍蝇相反，其中雷帕霉素处理对肠道细菌的组成或多样性没有显着影响（S9C图）。
当我们比较5天大的ywPGRP-SA的相对丰度时塞姆用雷帕霉素治疗的雌蝇与ywPGRP-SA塞姆伴有肠细胞特异性敲低 dTOR （ywPGRP-SA塞姆; NP1>mTOR瑞艾），我们观察到显著差异（图4A）。在ywPGRP-SA中观察到Nocardioidaceae家族（60%）的主导地位塞姆; NP1>mTOR瑞艾苍蝇，而醋杆菌科（84%）在雷帕霉素处理的ywPGRP-SA中占主导地位塞姆苍蝇。两条苍蝇系的肠道中都缺乏乳酸菌科（在ywPGRP-SA中为3%）塞姆+ 说唱与ywPGRP-SA中的0.4%塞姆; NP1>mTOR瑞艾) (图4B）。S 酒店对象对于30天龄雷帕霉素治疗的ywPGRP-SA塞姆苍蝇≈87和S对象对于 30 天大的ywPGRP-SA塞姆; NP1>mTOR瑞艾≈135个家庭（图4B）。阿尔法多样性测量显示，30天大ywPGRP-SA的肠道细菌塞姆; NP1>mTOR瑞艾苍蝇（辛普森1-D = 0.5917，香农H = 1.386）比ywPGRP-SA更多样化塞姆用雷帕霉素喂养的突变体（Simpson 1-D = 0.2836，Shannon H = 0.7219）（图4B）。Beta多样性分析（PCA图）显示，这两种菌株彼此相距甚远，这表明它们根据其细菌家族的相对丰度具有不同的组成（图4C）。30日龄ywPGRP-SA相对丰度和多样性的主要差异塞姆;NP1>mTOR瑞艾与30天大的ywPGRP-SA相比塞姆+Rap可能是由于前者中苍蝇的大部分寿命期间mTOR水平降低，而后者中雷帕霉素对TORC1复合物的瞬时抑制。
恢复ywPGRP-SA中的细菌密度塞姆需要翻译调节器 4E-BP
TOR抑制恢复了ywPGRP-SA中的细菌密度的事实塞姆突变体，指向PGRP-SA / Toll缺陷条件下肠道中潜在的代谢转移。废除TOR活性可能已经逆转了这一点，或者可能已经产生了另一种代谢状态，使细菌再次生长。无论如何，我们推断，当Toll和TOR信号都被抑制时，这种代谢环境允许正常的肠道细菌密度，需要在这两个途径的连接处有一个调节剂。最近已经表明，哺乳动物4E-BP的果蝇同系物正在调节肠道细菌[25]。4E-BP是TOR信号传导的重要下游成分，包括几个NF-κB结合位点[44]。
这些NF-κB位点对由Toll通路调节的感染有反应[45]。证实了这一点，我们发现激活Toll反应的全身性白色念珠菌感染也激活了肠细胞中的4EBP转录报告基因（S10图）。定量实时荧光定量 PCR 分析显示，女性ywPGRP-SA 的 4E-BP降低了 4 倍塞姆苍蝇和雌性yw减少2倍;1苍蝇与它们的遗传背景相比（图5A）。此外，当触发肠细胞中构成活性的Toll10B受体时，4E-BP的磷酸化形式显着增加（S11图）。这些结果表明，规范的Toll信号通路不仅在感染后而且在稳态肠道功能期间对4E-BP施加了控制。
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图 5.4EBP参与调节肠道细菌密度，作为Toll / NF-κB和mTOR信号传导的纽带。
PGRP-SA和DIF影响果蝇肠道中的4EBP mRNA水平。RT-qPCR分析4E-BP基因在5日龄雌性yw seml和yw dif肠道中的表达1苍蝇相对于它们的遗传背景（yw），设置为1（虚线;n = 10内脏/菌株）。抑制mTOR活性恢复了seml突变内脏中的4EBP水平。RT-qPCR分析5日龄雌性yw seml，用雷帕霉素和雌性yw seml处理的女性yw seml在肠道中的4E-BP表达;NP1>电动瑞艾苍蝇相对于yw雌性对照，设置为1（虚线;n = 10内脏/菌株）。（C）.4E-BP介导雷帕霉素诱导的yw seml蝇中可培养细菌负荷的恢复。该图表示5天龄雌性yw seml（n = 10）和ywseml / Y的可培养肠道细菌负荷;NP1>4-乙酸酐瑞艾（n = 10） 和ywseml/Y;NP1>4E-BPRNAi + 雷帕霉素 （n = 8） 苍蝇。在每种情况下（A-C），x轴表示不同的苍蝇应变，y轴表示通过ΔΔCT方法计算的相对折叠变化。n = 3 个生物重复，（ns = 不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p <0.001，****p<0.0001）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.g005
除了由宿主先天免疫控制外，4E-BP还已知受mTORC1调节[在45中回顾]。简而言之，4E-BP与翻译起始因子elF4E结合并阻止5'cap依赖性mRNA翻译。活化的mTORC1磷酸化4E-BP并促进翻译蛋白合成。测试果蝇TOR活性的遗传和药理学抑制对ywPGRP-SA中4E-BP水平的影响塞姆苍蝇，我们进行了定量PCR。结果显示，雷帕霉素治疗后4E-BP转录本水平增加3倍，沉默YwPGRP-SA肠细胞中TOR后增加5倍塞姆突变体与未经治疗的ywPGRP-SA肠道中的4E-BP水平的比较塞姆 (图5B）。尽管在这两种情况下都观察到4E-BP的统计学显着增加，但与雷帕霉素抑制TORC1活性相比，通过RNAi沉默TOR对4E-BP转录本水平的增加具有更大的影响（图5B）。
通过抑制TOR恢复4E-BP转录本水平与肠道CFU的恢复相关（图3A和3B），这一事实使我们有理由研究4E-BP对于介导我们之前在年轻ywPGRP-SA中看到的可培养细菌负荷的恢复是否至关重要。塞姆雷帕霉素治疗后苍蝇。为此，我们比较了ywPGRP-SA塞姆; NP1>4E-BP瑞艾用雷帕霉素治疗和未治疗，以及未治疗的ywPGRP-SA塞姆 (图5C）。未经处理的ywPGRP-SA的细菌负荷塞姆苍蝇在统计学上与未经治疗的ywPGRP-SA没有区别塞姆; NP1>4E-BP瑞艾用雷帕霉素处理后者没有恢复细菌密度（图5C）。这与之前在ywPGRP-SA中观察到的情况形成鲜明对比。塞姆 (图3B）。反过来，这表明雷帕霉素恢复了ywPGRP-SA中的细菌密度。塞姆飞过4E-BP，肠细胞需要4E-BP（图5C）。值得注意的是，仅失去4E-BP就会显着降低肠道中的正常CFU（S12图）。这些结果表明，4E-BP对于产生确保PGRP-SA / Toll / NF-κB下游正常细菌生长的代谢环境至关重要。
PGRP-SA/Toll/4E-BP 轴调节肠道甘油三酯储存
降低5日龄PGRP-SA中的细菌密度塞姆突变体伴随着肠道甘油三酯储存的增加（图6）。相比之下，5天大的PGRP-SA塞姆用TOR抑制剂雷帕霉素处理的突变蝇显示肠甘油三酯水平降低（图6）。这些在统计学上与它们的yw遗传背景水平无法区分，这表明PGRP-SA中Toll信号传导的丢失塞姆苍蝇导致TOR介导的脂质分解代谢抑制（图6）。对称地，通过肠细胞中的RNAi抑制TOR也能够抑制肠道中的脂肪堆积。这取决于4E-BP。事实上，PGRP-SA的治疗塞姆;NP1ts>4E-BP瑞艾使用雷帕霉素的苍蝇在恢复正常甘油三酯水平方面无效，表明肠细胞中需要4E-BP来调节肠道脂肪水平（图6）。由于食物摄入的差异可以调节甘油三酯储备，我们使用ca柱状feeding测定法测量了一周观察期间（1至7天大的交配雌性苍蝇）的食物摄入量[CAFE测定，46]。食物摄入量在统计学上与缺乏PGRP-SA的苍蝇之间没有区别塞姆（用雷帕霉素治疗或未治疗），ywPGRP-SA塞姆;NP1>mTOR瑞艾和PGRP-SA塞姆;NP1ts>4E-BP瑞艾（用雷帕霉素治疗）与yw对照（S13图）相比。
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图 6.PGRP-SA的损失会增加肠道脂肪水平。
PGRP-SA的损失增加了5天大苍蝇的肠道甘油三酯水平。用药理学抑制（雷帕霉素）或RNAi抑制EC中的TOR抑制这种现象。这取决于4EBP作为yw seml;NP1>4-乙酸酐瑞艾用雷帕霉素治疗的脂肪水平在统计学上与yw seml没有区别。N = 15/基因型/治疗共有三个独立实验（每个实验n = 5/基因型/治疗）。使用学生的t检验（***p<0.001）对突变体和对照组的值进行统计比较，除yw seml外，所有其他比较均无显著;NP1>4-乙酸酐瑞艾用雷帕霉素治疗与yw相比，yw的值为p<图中未显示0.001比较）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.g006
肠道中的脂质分解代谢与可培养细菌的密度有关
为了测试肠道脂质分解代谢的限制（以及肠道中脂肪的积累）是否是可培养细菌密度下降的原因，我们测量了脂质储存液滴相关TAG脂肪酶Brummer（bmm）损失的影响，这是人类脂肪细胞甘油三酯脂肪酶的同源物[47]。如前所述，PGRP-SA塞姆突变体的可培养细菌密度降低，而PGRP-SA塞姆用雷帕霉素或TOR RNAi（肠细胞）处理的果蝇显示出与yw背景相当的可培养细菌水平（图7）。然而，当雷帕霉素治疗伴随着肠细胞中的bmm敲低时，情况并非如此，这表明Bmm活性在恢复可培养的肠道细菌密度方面很重要（图7）。野生型苍蝇肠细胞中的沉默bmm显着降低了肠道CFU（图8A）。此外，肠细胞中的bmm沉默显着增加了肠道中的脂质积累，如油红所示和量化（图8B）。-厦门畜牧期刊杂志论文发表
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图 7.细菌密度的降低与肠道脂质分解代谢有关。
雷帕霉素治疗或TOR-RNAi在ywseml苍蝇的EC中恢复了肠道细菌CFU在yw遗传背景水平的遗传背景水平。然而，当脂肪酶bmm在EC中被击倒时，情况并非如此。N = 15/基因型/治疗共有三个独立实验（每个实验n = 5/基因型/治疗）。使用学生的t检验（***p<0.001，NS不显着）对突变体和对照组的值进行统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.g007
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图 8.Bmm脂肪酶的RNAi增加肠道脂质积累并降低细菌密度。
（A）肠细胞中bmm表达的沉默（通过Myo1A）ts-GAL4）导致肠道CFU的显着减少。（B）这与肠道中脂质的积累相结合，这些脂质被染色并用油红量化。使用学生的 t 检验（ns = 不显著，***p<0.001，****p<0.0001）进行统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.g008
肠道细菌检测、细菌密度和脂质分解代谢
为了确定细菌的存在及其通过PGRP-SA的感知是否是将肠道细菌组的维持与脂质分解代谢联系起来的重要因素，我们用油红色染色了轴向苍蝇。与传统饲养的苍蝇相比，Axenic野生型苍蝇的肠道脂质水平较高，但这种明显的趋势处于统计学意义的极限（p = 0.15）（图9）。为了检查体内结合的必要性，我们产生了三个UAS-PGRP-SA转基因突变体。这些是丝氨酸101，酪氨酸126和丝氨酸184到丙氨酸的点突变（图10A）。没有一种残基被选择用于诱变被认为与广泛的包装相互作用有关。因此，这些残基的改变预计不会破坏PGRP-SA的三级结构[48]。
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图 9.轴向蝇显示出肠脂水平的适度积累。
（A）在轴心条件下养殖的苍蝇平均具有更多的油红色内脏。（B）尽管观察到了趋势，但根据学生的t检验（ns = 非显着性）计算，这处于统计显著性（p = 0.15）的边缘。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.g009
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图 10.PGRP-SA 的细菌传感对于维持肠道细菌密度非常重要。
（A）突变（到丙氨酸）在跨越肽聚糖结合槽的三个残基中引入。体外研究[48]表明，S101A增加了肽聚糖（PG）结合，而Y126A和S184A消除了PG结合。（B） PGRP-SA 和 PGRP-SA 的野生型拷贝S101A型能够挽救因PGRP-SA功能丧失而导致的CFU的显着减少塞姆.（C）相比之下，PGRP-SA126A型和 PGRP-SAS184A型无法挽救肠道细菌密度的损失。使用学生的t检验（ns = 不显著，***p<0.001）进行统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.g010
S101位于肽聚糖（PG）结合槽的底部（图10A），S101A突变体体体外增加与细菌肽聚糖的结合[48]，这表明去除S101的羟基可以为PG创造更好的结合表面。相反，Y126A和S184A在体外废除了PG结合[48]。通过UAS在肠细胞中表达，野生型PGRP-SA转基因能够挽救5日龄PGRP-SA中肠道CFU的显着减少塞姆苍蝇（图10B）。UAS-PGRP-SAS101A型，也能够挽救肠道细菌密度的降低（图10B）。相反，UAS-PGRP-SA的表达126A型或UAS-PGRP-SAS184A型在肠细胞中无法挽救肠道CFU（图10C）。这表明只有具有完整结合PG能力的PGRP-SA蛋白才能挽救肠道细菌密度的丧失。
讨论
在肠细胞中没有细菌受体PGRP-SA的情况下，我们观察到肠道细菌密度降低。通过使用雷帕霉素来恢复它，雷帕霉素靶向TORC1或通过敲低肠细胞中的TOR。这表明免疫受体PGRP-SA的丧失，产生了不利于肠道细菌生长的代谢环境。我们的结果表明，这种关系的核心是4E-BP，它被拓领激活并被TORC1抑制。与此保持一致，PGRP-SA塞姆;NP1GAL4>4E-BP瑞艾用雷帕霉素治疗的苍蝇无法恢复肠道细菌密度。4EBP下游的肠脂分解代谢对于维持可培养细菌密度至关重要，因为脂肪酶Bmm的损失阻碍了雷帕霉素治疗后肠道细菌的恢复。肠细胞中bmm的沉默导致肠脂质积聚，并阻止通过雷帕霉素在PGRP-SA中恢复塞姆苍蝇。
我们的研究结果表明，在Toll的下游，肠细胞的肠道甘油三酯水平低于4E-BP控制。虽然PGRP-SA中可培养细菌组减少的现象塞姆苍蝇很容易在幼虫和幼蝇中表现出来，我们的结果表明，它在老年苍蝇中也存在。传统的养蝇技术可确保随着时间的推移，细菌的排便和再引入的稳定流。然而，当食物瓶迅速更换时，再感染减少，PGRP-SA中30天龄果蝇的CFU显着降低。塞姆比苍蝇。细菌组的保存依赖于PG识别作为PGRP-SA中肠道CFU的拯救塞姆苍蝇只有具有完整PG结合能力的PGRP-SA转基因才有可能。这表明细菌传感是激活该过程的初始触发点。
我们的工作模型如图11所示。PGRP-SA识别肠道细菌组的成分，并激活肠细胞中的Toll通路。反过来，这保持肠细胞中4E-BP转录/ 4E-BP蛋白磷酸化的增加，保持稳定的肠脂分解代谢率。后者对于维持共生细菌的正常密度很重要。我们假设Bmm介导的脂质分解代谢受到4E-BP的调节，释放的甘油三酯作为维持共生细菌的燃料。与此相一致，通过沉默EC中的Bmm脂肪酶来停止脂质分解代谢，导致脂质积累和肠道CFU的减少。根据该模型，细菌应该引发脂质分解代谢，5天大的轴突蝇在其肠道中显示出脂质积累的明显趋势，但这在统计学上并不显着。霍乱弧菌的研究表明，肠道乙酸盐导致宿主胰岛素信号传导失活和肠细胞中脂质积累，导致宿主致死性[49]。PGRP-SA /Dif的损失会导致寿命缩短。这是否是由于脂质的长期积累是一个悬而未决的问题。
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图 11.概述PGRP-SA / Toll / Dif在肠道细菌组保留中的作用的示意图模型。
PGRP-SA识别肠道细菌组的成分，并激活肠细胞中的Toll通路。这增加了肠细胞中的4E-BP转录/ 4E-BP蛋白磷酸化。4EBP对于维持共生细菌的正常密度很重要。我们假设Bmm介导的脂质分解代谢受到4E-BP的调节，释放的甘油三酯作为维持共生细菌的燃料。
-厦门畜牧期刊杂志论文发表
需要更多的工作来了解储存的肠脂是否/如何释放到循环中，共生细菌如何接收它们以及PGRP-SA识别细菌组的哪些成分。
材料和方法
果蝇储备和程序
黄白色 （yw）果蝇菌株yw67c22、 1118和DGRP（果蝇遗传参考小组）25174作为对照遗传背景，与突变体PGRP-SA进行比较塞姆 [34] 和dif1 [27]或其他使用UAS-GAL4系统进行细胞特异性敲低的苍蝇。用于后者的果蝇菌株是来自维也纳库存中心的UAS品系，即UAS-PGRP-SA瑞艾（GD 线 37470）和UAS-4E-BP瑞艾（KK线100739），NP1-GAL4/Cyo;drsGFP/TM3 （RRID：BDSC 67088） 以及 UAS-TOR瑞艾（A15495 TRiP线）从布卢明顿股票中心。线路 UAS-PGRP-SA， UAS-PGRP-SAS101A型， UAS-PGRP-SA126A型和UAS-PGRP-SAS184A型是为本研究而构建的。用于同化PGRP-SA塞姆和dif1突变在25174遗传背景中，突变的雌性苍蝇被杂交到25174只雄性，在第一条（FM7）和第二条染色体（CyO）上具有平衡器，并建立了个体系（一位创始人女性X一只25174只雄性与平衡器）。然后，来自这些的雌性后代与25174（没有平衡器）回交，再过3代。在3代结束时，建立了20个单独的杂交（1个25174雄性，每个系平衡器X一个雌性），交叉平衡F1，并筛选非平衡F2后代是否存在纯合性中的相关突变。
在所有实验中，在25°C，70%湿度下，在12小时的光照：黑暗循环下，在玉米粉糖蜜培养基上饲养苍蝇。每条生产线的备用库存保持在18°C。 实验苍蝇在收集在装有新鲜食物的小瓶中后被允许交配两天。然后，它们根据性别被隔离成单独的小瓶。每次实验中，每个小瓶中大约有15到20只同性苍蝇，每两天放入新鲜食物中，直到30天。将雷帕霉素（37094，Sigma-Aldrich，USA）原料（10mg / ml）新鲜制备在100%乙醇中，并加入到微波飞食中，终浓度为200μM。同样量的乙醇（1：50稀释）也作为飞行器对照添加到飞行食物中。用雷帕霉素喂食苍蝇三天，之后将它们的内脏分离出来进行不同的实验。苍蝇食品配方为（至30L）：玉米粉1.8kg，麦芽提取物1.8kg，糖蜜500g，大豆粉216g，酵母粉366g，琼脂（Fisher Scientific，BPE2641-1）169g，4-羟基苯甲酸甲酯（Nipagin，Sigma-Aldrich W271004）74g，乙醇（VWR）703ml，[95%丙酸（Sigma-Aldrich P5561）5%磷酸（Sigma-Aldrich P5811）溶液140ml]，水28L。
肠道微生物群的培养依赖性定量
在磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中解剖单个中间体，然后使用无菌针头在MRS肉汤（CM0359，Thermo Fisher）中均质化。然后将所得的悬浮液接种在MRS琼脂（CM0361，赛默飞世尔）上，并在30°C下孵育48小时。计算每个板块中的菌落，并计算菌落形成单位（CFU）的log10值。按照上述步骤，将任何单个飞线的至少15个单独的内脏镀在单个MRS板上。使用学生的t检验对突变体和对照组的log10 CFU值进行统计比较，并在GraphPad Prism v.8.0中绘制图形。
肠道菌群的培养独立定量
通过使用高变量区域V3分析其16s核糖体RNA序列来鉴定果蝇肠道的微生物组成，广泛地鉴定微生物家族。
DNA 分离和处理从PBS中每种菌株的5天和30天龄的苍蝇中分离出40只中古苍蝇，并根据制造商的说明使用QIAamp DNA Mini Kit（51304，德国Qiagen）提取其基因组DNA（gDNA）。还包括无肠道测序对照，以排除试剂中的任何污染细菌。果蝇微生物组组成的读数受到细胞内共生体沃尔巴克氏体的挑战，已知其感染果蝇[50]。为了去除/减少沃尔巴克氏体的16S读数，提取的DNA用限制性内切酶BstZ17I（R3594S，NEB，UK）消化，该限制性内切酶仅在沃尔巴克氏体RNA的16S区域中切割[50]。将来自每个飞系的约500ng基因组DNA（gDNA）与BstZ17I孵育2小时，然后对酶进行热灭活。然后将消化的gDNA用作模板来扩增16S超可变区域V1-V3。该扩增步骤通过PCR与Phusion HF DNA聚合酶（MO530L，NEB，UK）一起进行。由于上述消化，沃尔巴克氏体16S区域在此步骤中未被扩增，导致肠道微生物群扩增子的产量更高。在对其16S gDNA进行PCR扩增后，沃尔巴克氏体V1-V3区域的消化导致产生了200bp和300bp条带，这两个条带都通过测序被证实属于沃尔巴克氏体。使用Qiagen PCR纯化试剂盒（27106，德国Qiagen）纯化PCR产物，然后将其用作扩增V3高变区（180-200bp）的模板。扩增后，将所得V3产物在1.2%琼脂糖凝胶上运行，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒（28706，德国Qiagen）切除和纯化200bp V3条带。
V3 文库准备多达 100ng 的 V3 DNA 样品（根据制造商的说明使用 Picogreen 测定法（P11496，美国赛默飞世尔）进行测量）用于文库制备。用于Ion Torrent试剂盒的NEB NextFast DNA文库制备集（E6270，NEB，UK）用于制备DNA文库。试剂盒中的NEB末端修复酶用于去除DNA悬垂，并确保每个DNA分子含有游离的5'磷酸盐和3'羟基，用于适配器连接。这是根据制造商的说明使用反应混合物和热循环条件进行的。然后将试剂盒中提供的独特离子Xpress条形码适配器（4471250，ThermoFisher Scientific）以及套件中提供的通用适配器连接到DNA链的末端并根据制造商的说明进行扩增。然后使用Agencourt AMPure XP DNA纯化珠（A63881，德国贝克曼库尔特）纯化所得的DNA文库，以去除产品中多余的条形码。使用SizeSelect 2%设置（E-Gel iBase Invitrogen）在2%E-gel（G661012，ThermoFisher Scientific，USA）上运行样品，并使用Agencourt AMPure XP DNA纯化珠（A63881，贝克曼库尔特，德国）提取并纯化300bp文库两次。然后使用6-8轮PCR扩增纯化的文库，并使用针对离子激流DNA标准品的特异性引物（KK4812，KAPA Biosystems，USA）的KAPA文库定量试剂盒进行定量（KK4812，KAPA Biosystems，USA）。然后将样品均匀混合至终浓度为350pM，使用Ion Chef系统加载到Ion 314TM芯片V2上，并根据制造商的说明使用离子质子系统（ThermoFisher Scientific）进行测序。
离子质子系统在合成测序原理下工作。在这种方法中，通过跟踪pH值的变化来鉴定核苷酸碱基。在dNTP聚合过程中形成磷酸二酯键会导致质子的释放，这可以通过pH变化来检测。Ion Torrent系统使用放置在每个微孔中的ISFET（离子敏感场效应晶体管）检测器检测pH值中的这些变化。来自数百万个ISFET检测器的信号通过CMOS阵列芯片中继，该芯片提供核苷酸读数[51]。-厦门畜牧期刊杂志论文发表
序列分析离子质子系统产生的测序数据使用ThermoFisher Scientific Ion Reporter软件进行处理。序列作为 BAM 文件上传，并使用标准设计的宏基因组学 16S 工作流程版本 5.10（赛默飞世尔）进行分析，并带有上述 V3 引物和自定义参数（如下所述）。这些序列是针对 Curated MicroSEQ（R） 16S Reference Library v2013.1 引用的。对读取进行过滤，以便在每次读取中检测到单端引物，从结果中排除小于115 bp的序列，并且包括所有与至少90%的数据库序列一致的读取。至少具有一个唯一读取的操作分类单元（OTU）被拾取。分别在97%和99%序列同一性处进行分界线，用于属和种水平的分配。连续两次命中之间的差异设定为0.8%。对应于属于无形体科（不构成肠道微生物组成员）的果蝇共生体序列的读数映射被排除在下游分析之外。每个科的相对丰度是通过将每个科的映射读数除以每个样本的总映射读数（减去无形体科）来估计的。使用PAST3软件分别绘制α（Simpson's 1-D和Shannon H）和β多样性（PCA图）指数来测量每个样品内和每个样品之间的微生物群多样性。在同一项研究中，阿尔法多样性同时考虑了物种的丰富度和丰度。辛普森和香农指数通常用于对人口的阿尔法多样性进行评分。辛普森指数（D）衡量从属于同一物种的种群中选择两个个体的概率，而香农多样性指数（H）根据预测样本中物种的不确定性（即熵）来衡量物种的丰富度和均匀性[52]。Beta多样性分析比较样本群体之间的细菌组成，并绘制具有代表性的原理成分分析（PCA）图。PCA图中点之间的距离表示基于其组成的样本之间的相似性/异性程度[53]。这些实验中的所有图形都是在GraphPad Prism v.8.0中生成的。PCA图在PAST3软件中准备，并使用Inkscape v.0.92.4进行编辑。
使用 qPCR 测量基因表达
在PBS中解剖每条线的十只苍蝇，并分离出它们的内脏。匀浆肠道，并使用Norgen总RNA纯化加试剂盒（48400，Norgen-Biotek，加拿大）提取总RNA。使用Nanodrop测量RNA浓度（50-500ng / μl）和纯度（260nm / 280nm吸光度比）。RNA（260nm）和蛋白质（280nm）的吸光度比表明样品中RNA的纯度。对于一条单一的飞线，从10个内脏池中分离出RNA。这是每条飞行线执行三次。根据制造商的说明，总RNA被用作使用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒（11754050，Thermo Fisher，USA）制备cDNA的模板。QPCR是使用从苍蝇内脏的总RNA（如上所述）产生的cDNA作为模板进行的。SensiFAST SYBR No-ROX试剂盒（BIO-98020，Bioline，德国）和序列特异性引物用于在Qiagen Rotor基因Q qPCR仪器的帮助下定量4E-BP与管家基因RP49的转录本水平。添加的cDNA量标准化为前体RNA的25ng / μl。根据制造商的说明进行定量。核糖体蛋白49基因（RP49）被用作内部对照。三个生物重复分别加载（三个技术重复）（n = 9），并使用GraphPad Prism v.8.0中的学生t检验绘制ΔΔCT值并分析统计显著性。
寿命分析
在进行寿命测定之前，yw和yw dif1苍蝇被回交了两代，以消除任何近亲繁殖的突变。将两天龄的交配雌蝇分批收集，每小瓶10只，分12小瓶（每条苍蝇线120只）。这些苍蝇每2天被倒入新鲜食物中，直到所有苍蝇死亡。通过计算每隔一天死亡的苍蝇数量来监测生存情况。在倾倒过程中飞走或因手动处理而死亡的下落不明的苍蝇被记录为审查。死亡和审查的苍蝇的数量被制成由Matthew Piper（澳大利亚莫纳什大学）设计的自定义excel模板中，该模板用于生成寿命图。使用Log-rank测试对两种不同苍蝇品系的寿命进行了统计学比较，其中通过分析事件发生（死亡）的概率来检查两个种群在一个时间点之间的差异[54]。
甘油三酯测量
将新孵化的L1幼虫以50/小瓶的密度接种在小瓶中，并在25°C下生长以同步培养。适龄的成虫分批处理，每批处理雄性八次，雌性分批处理六次。仅提供男性数据（值得注意的是，女性没有偏离获得的结果）。立即在匀浆缓冲液[0.05%吐温-20和2x蛋白酶抑制剂（罗氏）在H中处理样品2离心（5000转/分，1分钟）后，将上清液转移到新管中并再次跨度（14000转/分，4°C时3分钟）。为了测量甘油三酯，将80μl上述上清液与1ml甘油三酯试剂（Thermo-Fisher）混合，并在37°C下孵育10分钟。 测量是在外径处进行的520并与标准化曲线进行比较。为了测量蛋白质水平，将100μl最终上清液与700μlH结合2O和200μlBio-Rad蛋白测定试剂并在室温下孵育3分钟。外径测量595与标准化曲线进行比较。
肠道解剖和免疫染色
对于肠道成像，在施耐德的培养基中解剖来自麻醉苍蝇的内脏，并在4%多聚甲醛（PBS）中固定30分钟，在PBS中冲洗，然后在洗涤溶液中洗涤三次（每只5分钟），在PBS中洗涤0.1%Triton X-100（Sigma-Aldrich）。将组织在封闭溶液（0.1%Triton X-100，2%BSA（Sigma-Aldrich））在PBS中封闭60分钟，并在4°C下用一抗免疫染色过夜。 然后将样品在室温（RT）下洗涤4×5分钟，在洗涤溶液中，在RT下与二抗一起孵育2小时，像以前一样再次洗涤，并用DAPI 1：1000染色（Sigma-Aldrich）。将洗涤的内脏安装在带有矢量防护仪安装介质的载玻片中（矢量实验室）。使用以下一抗：小鼠抗β-半乳糖苷酶（40-1a-S，发育研究杂交瘤库，爱荷华州，美国） - 1：1000;山羊抗HRP（123-165-021，杰克逊免疫研究实验室。公司）-1:500.我们使用驴抗小鼠Alexa 568抗体（Invitrogen） - 1：250和驴抗山羊Alexa 568抗体（Invitrogen） - 1：250。
成像数据分析
以20倍放大倍率对内脏进行成像，并将所有与DAPI小核共定位的GFP标记细胞（esg > Gal4）计数在从边界2-3向前延伸的近似大小的区域中;绘制的值是每单位面积或每总DAPI染色细胞的GFP标记细胞数。使用ImageJ软件分析图像。
毛细管喂养测定（CAFE测定）
如前所述[46]对食物摄入量进行了分析，并进行了一些修改。测试了每种基因型50只苍蝇。将10只苍蝇的批次放入小瓶中，底部有湿纸巾，毛细管食物源含有蓝色染料。监测喂养8小时（亮起）和1小时（熄灭灯）。每1小时记录一次进食量，每2天更换一次毛细管。-厦门畜牧期刊杂志论文发表
统计分析
使用GraphPad Prism 6或R分析数据。首先进行了D'Agostino和Pearson综合正态性测试。如果发现数据拟合正态分布，则使用参数化检验，首先是方差分析，然后是Tukey多重比较检验。对于不符合正态分布的情况中的Thor-LacZ计数数据，我们进行Kruskal-Wallis检验，然后进行Dunn的多重比较检验以澄清显着性。使用R来分析GFP计数数据，使用准泊松回归将其拟合到广义线性模型，然后使用ANNOVA和Tukey的多重比较检验来寻找显著性。对于qPCR，基因表达数据通过一系列顺序校正进行标准化，包括对数变换，均值居中和自动缩放[55]。
油红色染色
如前所述进行油红染色[56]。简而言之，将苍蝇内脏在冰上的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中解剖，并用4%甲醛固定45分钟。用PBS，双蒸馏水和60%异丙醇溶液连续洗涤胆汁。使用先前制备的0.1%油红O（Sigma-Aldrich）异丙醇储液溶液在水中制备6：4稀释的新鲜工作原料。胆汁孵育20分钟，然后用60%异丙醇和水（三次）洗涤。
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PGRP-SA塞姆突变蝇的肠道祖细胞较少。
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S1 图PGRP-SA塞姆突变蝇的肠道祖细胞较少。
（A）在没有感染的情况下，ISC（HRP阳性，GFP阳性）分裂产生EB（HRP阴性，GFP阳性）。然而，在缺乏PGRP-SA的20天龄苍蝇中，没有观察到这种分裂（另见插图）。（B）祖细胞和ISC的定量表明这些显着降低（*p<0.05;误差线显示95%置信区间，分析了来自4个生物重复的肠道）。GFP表达由UAS依赖性mCD8GFP转基因指导，其标记了包括ISC和EB（DAPI所有细胞核）的祖细胞膜。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s001
（TIFF）
S2 图Toll10B在没有PGRP-SA的情况下拯救祖细胞数。
在没有功能性PGRP-SA的情况下，表达祖细胞中Toll受体（Toll10B）功能版本获得功能版本的UAS-转基因激活ISC分裂，如用抗磷酸化 - 组蛋白-3抗体（PH3 +）和定量（右图）染色5日龄雌性的中间图所示。值得注意的是，ISC是肠上皮的唯一PH3 +细胞。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s002
（JPG）
S3 图失去Dif但不享受会导致细菌密度的损失。
（A）肠细胞中的Dif RNAi导致细菌CFU的显着减少。（B）相比之下，失去食欲导致肠道细菌组的两个主要成分显着增加，即乳酸杆菌和醋酸杆菌属。使用学生的 t 检验 （*p<0.1， **p<0.01， ***p<0.001） 进行统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s003
（JPG）
S4 图拓领信号通路的成员参与维持肠道细菌组。
（A） PGRP-SA塞姆苍蝇的寿命显着减少。使用对数秩测试（***p<0.001）进行性别特异性成对统计比较。（二）断续器令吉7苍蝇的肠道CFU显著减少。使用学生的t检验（ns = 不显著，***p<0.001）进行统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s004
（JPG）
S5 图30 天龄的 PGRP-SA塞姆当每12小时更换一次食物时，苍蝇失去细菌密度的速度比它们的遗传背景更快。
（A）yw苍蝇中细菌密度的损失在第20天（从成年期的第1天开始）稳定下来，而（B）在PGRP-SA中的类似处理塞姆苍蝇导致细菌密度损失超过20天，因为在30天大的yw和PGRP-SA的直接比较中可以看到（C）塞姆苍蝇。使用学生的t检验（***p<0.001）对突变体和对照组的值进行统计比较。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s005
（TIFF）
S6 图拓领信号传导的丧失会导致肠道细菌的丧失。
（A）当比较yw与PGRP-SA时，来自分离肠道的16S rRNA（右凝胶）的半定量PCR显示总肠道细菌的年龄依赖性降低塞姆或dif1到内部对照（肌动蛋白;左凝胶）。（B）相对于肌动蛋白的16S条带（使用图像J）的定量显示16S的数量显着减少（***p<0.001，ns = 不显着，通过学生的t检验）。每个点代表相对于相应肌动蛋白对照（n = 10）的一个条带的定量。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s006
（JPG）
S7 图重复实验以检查yw和PGRP-SA的肠道细菌组多样性塞姆苍蝇（见图2）。
（A）该图代表了16S下一代测序揭示的在5天龄和30天龄雌性yw，ywseml蝇的肠道中观察到的细菌家族的相对丰度。 x 轴表示不同年龄的 y 应变，y 轴表示相对映射的读数。（n = 40 内脏/菌株）。（B）PCA图，以显示相同基因型（圆圈）的样本在统计学上难以区分，而基因型之间显着不同（***p<0.001）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s007
（TIFF）
S8 图雷帕霉素恢复PGRP-SA中的肠道祖细胞（IPC）塞姆突变 体。
在中肠前部（见示意图），PGRP-SA中的IPC降低塞姆突变 体。添加雷帕霉素能够恢复它们。这是15个内脏的代表性结果。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s008
（TIFF）
S9 图雷帕霉素治疗和mTOR的肠道特异性敲低对30日龄微生物组成的影响。
（A）.该图表示在30天龄苍蝇yw，ywseml和用雷帕霉素和ywseml处理的苍蝇的肠道中观察到的微生物家族的相对丰度;NP1>电动瑞艾（+/-雷帕霉素）由16S下一代测序揭示。x 轴表示不同年龄的 y 应变，y 轴表示相对映射的读数。（n = 40 内脏/菌株）。（B）上述30天龄苍蝇的主成分分析（PCA）（n = 40内脏/菌株）。（C）主成分分析（PCA）比较了上述基因型的5天和30天（对于5天大的苍蝇，见图4）。（n = 40 内脏/菌株）。
-厦门畜牧期刊杂志论文发表
（TIFF）
S10 图系统性 C.白色白化病感染激活肠细胞中果蝇4E-BP（Thor）的转录。
（A）thor-lacZ; esg-ts<GFP苍蝇注射C。在感染后36小时对白色山药进行采样，并与未治疗（体内平衡）或注射PBS（无菌损伤）进行比较。用DAPI（蓝色），抗β半乳糖苷酶（红色）和抗GFP表达细胞（标记ISC和EB）染色的肠道细胞。图中是中肠前部在63倍处拍摄的代表性图像（B）。全身感染时thor-lacZ表达的定量。使用ImageJ测量强度，对所有样品进行背景减法。分析了10个肠道（每个肠道分析约50个细胞），显示95%可信区间，*p<0.05，*** p<0.001。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s010
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S11 图Toll10B的过表达会增加4E-BP的磷酸化形式。
在祖细胞（在Toll10B面板中标记的GFP）中，Toll受体的组成形式Toll10B的过度表达导致即使没有功能性PGRP-SA（下图）的磷酸化形式的4E-BP（p4EBP，箭头）的发生也会导致细胞自主增加。Myo1Ats>UAS-Rheb被用作肠细胞中p4EBP染色的阳性对照（在UAS-Rheb面板中标记的GFP）。棒材为30μm。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s011
（JPG）
S12 图4EBP对于维持可培养的肠道细菌密度非常重要。
与NP1-GAL4驱动程序相比，肠细胞中通过RNAi消耗4EBP，男性和女性的CFU减少（****p<0.0001，**p<0.01学生的t检验）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s012
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S13 图食物摄入不受缺乏PGRP-SA，4E-BP，TOR或雷帕霉素给药的影响。
通过CAFE方法测量成年后第1天至第5天交配雌性的食物消耗量;每个点代表一个小瓶（每个小瓶10只苍蝇）（n = 每个基因型和治疗的15个小瓶）;无比较有统计学意义（p>0.05，未成对的t检验）。
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009992.s013
（TIFF）
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