《中国医学人文》杂志期刊论文发表

线粒体DNA异质性研究进展及其法医学应用

摘要：线粒体DNA（mitochondria DNA, mtDNA）作为人类第二套基因组DNA，具有母系遗传、拷贝数多、突变率高等特点。同一个细胞、组织或个体发现存在两种及以上不同的线粒体DNA序列时，称之为异质性，这一现象的存在使线粒体DNA在法医学的应用趋于复杂。本文综述了线粒体DNA的特点、异质性的组织特异性及检测方法，并探讨了异质性在法医学中的应用价值。

一、人类mtDNA的特点及法医学应用价值

人类mtDNA位于细胞质中，是一套独立于核染色体之外的完整的遗传物质，作为真核细胞内的重要细胞器，能量生成的场所，参与了脂肪酸及某些蛋白质的合成。1981年，安德森等人在英国剑桥桑格实验室完成了线粒体的全序列测定，称为安德森序列(Anderson sequence)；之后改进后称为剑桥参考序列(Cambridge Reference Sequence，rCRS)。mtDNA呈闭环双链结构，其全长包含16,569 bp，序列可分为编码区和非编码区两个部分。其中，编码区较为保守，共包含37个基因，分别是2个rRNA基因，22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因；非编码区（也叫控制区）既是mtDNA转录和复制的起点，又是突变发生的热点，其中D环区及复制起始点附近的多态性较高，即常见的高变区Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(HV-Ⅰ、HV-Ⅱ和HV-Ⅲ)。三个高变区域包含了线粒体DNA约25%的可变位点^[1]。控制区的这种高度多态性使得个体间存在较高的差异性，在法医学中应用中可用于进行个体识别；同时，碱基序列的这种高突变率使其为人类进化过程提供了很好的参考资料。

另外，相对于核DNA，mtDNA呈母系遗传，因而原则上同一母系个体的线粒体DNA序列相同，一般情况下不发生重组，在法医学研究的母系亲属关系鉴定中可发挥作用。同时，mtDNA广泛存在于人类各种细胞、组织、器官中，具有高拷贝数，当降解检材的核DNA破坏严重时，mtDNA可凸显出重要的利用价值。

二、mtDNA异质性现象

细胞中线粒体的数量根据不同组织或器官的能量需求不同含有的线粒体数目存在差异，通常一个线粒体含有2~10个mtDNA分子^[2]。由于没有组蛋白的保护、mtDNA修复效率低下、氧化环境局部化和复制增加，导致突变发生频繁，突变率大约是核DNA的6~17倍。因此，正常的mtDNA分子常和突变的分子混合在一起，呈现出一种“共存”状态，称为异质性，表现为同一个体的不同组织存在不同的mtDNA；同一组织的不同细胞存在不同的mtDNA；同一细胞不同线粒体内存在不同的mtDNA^[3]。根据这一表现形式^[4]，可以将其分为长度异质性(1ength hetemlasmy)和序列异质性(sequence heteroplasmy)两种类型。长度异质性表现为同一个体中出现两种或两种以上片段长度有差异的mtDNA，多发生于线粒体D环区，如HV-I的16184~16193np、HV-Ⅱ的303~315np和HV-Ⅲ的456~463、514~523和568~573np，除了514~523np是由于CA重复导致的长度多态性外，其他序列变异均为多聚胞嘧啶(C stretch)。序列异质性表现为同一个体中出现了两种或两种以上碱基序列不同的mtDNA，这种碱基序列的不同可以出现在一个或者多个核苷酸位置，大多表现为一个碱基的不同，即点异质性(point heteroplasmy)，在两个及以上碱基不同的情况发生率相对较低^[5]。  

三、mtDNA异质性的组织特异性

同一个体不同器官的异质性水平存在差异。研究表明，mtDNA异质性的组织特异性往往与组织代谢速率、细胞周期和能量需求有关^[6-7]。线粒体周转代谢率较高的组织或器官更易于进行突变的正向选择，而其他组织或器官则倾向于随机突变。组织发育过程中异质性的分离并不是随机的而是具有组织特异性的，且还受到线粒体突变的影响。例如，在血液中致病的 mtDNA A3243G 突变就会通过负向选择被淘汰，相反，在另一些组织逐渐积累^[6]，且这种增长的突变负荷和疾病的发展相关。Guney等人发现异质性在膀胱组织mtDNA中的发生率最高，且膀胱癌患者的膀胱组织中异质性发生率与正常人存在显著差异，说明膀胱癌的发生率与突变有关^[7]。

个体并非只有对致病突变的 mtDNA发生特异性选择。随着年龄增长，某些突变会在不同组织中呈现不同异质性水平，甚至仅在某些组织中表达。两种“正常”mtDNA 在不同组织中进行差异表达有可能是因为不同 mtDNA 与核基因组之间的作用不同，产生的与氧化呼吸相关的产物不同，也可能与组织的功能特性相关^[8]。2014年，Naue等人研究发现在不同组织中的点异质性存在差异，在血液、颊细胞、骨和肺中C具有较高的比例，在肌肉中T具有较高的比例^[9]。此外，还发现一些组织特异性异质性位点，如64np和408np只在肌肉中检测到了序列异质性，71np只在大脑中检测到了长度异质性，即异质性在肌肉、脑和毛发中的发生率较高，在心肌、血液中的发生率较低。

四、mtDNA异质性的检测方法

（1）Sanger测序

目前，Sanger 测序法被广泛应用于 mtDNA 异质性的检测，但对于低水平的 mtDNA 异质性的检测仍缺少足够的灵敏度和准确度^[10]。Naue等比较了采用Sanger测序、SNaPshot微测序和二代测序技术（Second generation sequencing, SGS）对个体的不同组织样本进行异质性检测，结果显示Sanger测序检测到的异质性数量很高，但对于低水平异质性的检出量，Sanger测序可能略低^[3]。另外，Sanger测序较SNaPshot微测序法而言，对单核苷酸比值的定量更为可靠，但对C的检测灵敏度较低^[11]。

（2）基因芯片技术

异质性往往集中在被称为突变热点的某些区域，因此，基于高通量捕获阵列的方法可以很好地研究记录的突变热点。Affymetrix设计了一个名为MitoChip的微测序芯片，用于检测线粒体基因组的异质性位点，可以作为癌症早期检测的工具，该工具可单次对大于29 kb的双链DNA进行测序^[12]。MitoChip v2.0对参与异质性检测的GSEQ 4.1算法进行了修改，将MitoChip的检出率提高到99.75%，准确率达到99.988%。

与Sanger测序相比，基因芯片技术具有检测周期短、成本低、产量高的显著特点，广泛应用于临床诊断领域。捕获阵列在单核苷酸测定中具有方便、高效的优点，但由于寡核苷酸探针的设计必须遵循现有序列，因此无法提供未知异常位点的信息，即仅能判断突变是否存在，而不能准确地知道位点的异质性比例。

（3）基于PCR的方法  

     实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qPCR)能够实时监测被扩增的DNA分子数量，从而确定单个细胞中mtDNA的拷贝数，以及一些mtDNA损伤等。TaqMan荧光探针是qPCR的一种主要方法。该技术利用与靶序列特异杂交的探针来标示扩增产物的增加，常被用在mtDNA的异质性检测。2016年，高慧等人利用TaqMan探针建立熔解曲线定量分析技术平台，实验结果提示TaqMan探针技术灵敏度不及DHPLC技术，但比Sanger测序技术多发现1例异质性突变，且操作简单，成本相对较低，更加便于在临床实施^[13]。2018年，Rong等人开发了一种TaqMan-MGB实时定量PCR技术，探针5’端标记VIC或6-FAM，3’端标记小沟结合蛋白(MGB)，可用于检测和定量单管分析中3243A＞G的异质性水平，对异质性的检测灵敏度低至0.1%，定量精确度可达4%^[14]。2014年，张小勤等人成功建立了一套实时荧光定量PCR结合突变阻滞形成系统(ARMS-qPCR)检测方法，能够精确检测出低于10％和高于90％的突变，同时得到野生型和突变型线粒体拷贝数^[15]。Belmonte等人基于数字PCR (dPCR)方法开发了检测ND4基因缺失的方法，对缺失位点的理论检出限可高达1%，缺失比例可精确至2.8%^[16]。

（4）二代测序技术

目前，二代测序技术日益成熟、成本大幅下降，给生物学、人类学、医学等领域带来了新的突破，当然对法医遗传学这一应用性学科也带来了极大的冲击和挑战。利用二代测序技术，可以在短时间内完成对线粒体DNA基因组的深度测序，得到整个线粒体DNA基因组序列的异质性位点遗传信息，结果更加准确可靠，测序灵敏度也进一步提高。King等基于Nextera XT文库制备试剂盒和Illumina MiSeq平台从283名个体中获得了高质量的全基因组线粒体DNA单倍型，结果显示了线粒体基因组中变异的分布，并进一步证明了编码区域比非编码区域内的变异更多^[17]。

然而，由于mtDNA异质性通常以混合数据出现在序列信息中，因而数据解释与证据价值阐释就变得更加复杂，目前尚无统一的标准。对于来自不同个体mtDNA的混合、线粒体假基因(nuclear mitochondrial pseudogenes，NUMTs)的污染、测序错误等都可能产生混合数据，如何将真正的异质性和与其他原因导致的混合数据进行区分尤为重要。NUMT是位于核DNA中与mtDNA具有高度相似性的序列，它是线粒体基因向核基因组转移造成的。例如，人类8号染色体几乎包含一个完整的mtDNA序列，插入到SDC2的第一个内含子中^[18]。现有研究表明，每个个体平均携带750个NUMTs，其中约4个是个体所特有的^[18-19]。NUMTs可能会干扰mtDNA异质性的判读，因而在分析mtDNA序列时需要更严谨。

同时，由于二代测序平台的一些特点，测序过程中存在着无法避免的系统性错误。例如，Illumina GA平台使用相同的激光激发A/C和G/T，会产生相似的发射光谱，导致A/C和G/T误差。目前，二代测序的异质性研究通常会选择1%~2%的异质性阈值，当涉及到低水平或罕见的异质性(0.5%或更低)时，测序错误可能会干扰真正异质性的识别，无法区分测序错误和真实的mtDNA序列。

五、法医学应用

异质性的存在违背同一个体mtDNA序列一致的情况。在法医学实际工作中，异质性的存在使得基于mtDNA进行个体识别、母系亲缘关系鉴定可能产生不确定性，下排除结论应非常谨慎。在案件材料鉴定中，遇到1或2个碱基发生差异，应考虑异质性的存在，在有条件的情况下可以再采集其它的生物性检材进行复查。国际法医DNA遗传委员会指出异质型的出现并不会使mtDNA的分析失效，相反当两份检材都出现了同样的异质型，则进一步加强了同一性的证据作用。沙皇NicholasⅡ遗骸身份的认定就是在对可疑沙皇的遗骸中抽提的mtDNA序列分析时，在HVⅠ区16,169处发现了C和T两种碱基异质性，而沙皇同母亲兄弟的遗骸除了所检测的其它739个碱基一致外，在16,169处也被检测出有同样的异质性，进一步确认了这些遗骸的身份^[20]。 这一案例提示我们mtDNA异质性在法医学鉴定中可作为特殊的遗传标记进一步增加遗传学证据的强度。

六、结语

近年来，随着检测技术的不断开发，学者们对于线粒体DNA的研究从原有的高变区拓展到全基因组序列，从原有的碱基序列单一读取到深度分析，线粒体DNA异质性也日益受到关注，研究进入了一个新的阶段。对于同一个体不同组织及不同年龄段人群异质性、在体内的水平和组织分布、人群中的发生频率等仍于研究阶段。因而，进一步了解异质性的发生规律、发生热点及频率信息有助于更好的服务于法医学鉴定工作，更好的诠释法庭证据。

参考文献：