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医学论文发表-植物病原体融合进化

发布时间：2021-08-24 10:01:20 来源：【大中小】浏览:次

医学论文发表-植物病原体融合进化，以抵消NLR免疫受体网络的冗余节点

· 莉达·德雷夫尼娜

· 毛里西奥·孔特雷拉斯

· 平崎阿达奇，

· 杰西卡·上普森

· 安吉尔·维加拉·克鲁塞斯

· 谢荣融，

· 扬·斯克纳尔

· 弗兰克·门克

· 萨姆·穆格福德

· 丹·麦克莱恩

· 马文博，

· 萨斯基亚·霍根豪特

· 阿斯卡·戈弗斯

· [ ... ],

· 索芬·卡蒙

· • 查看所有。

· 发布时间： 2021年8月23日

· https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136

抽象

在植物中，核苷酸结合领域和富含白细胞素的重复（NLR）蛋白质可以形成受体网络，赋予高度敏感的细胞死亡和先天免疫力。一类NLR，称为细胞死亡所需的NLR（NRC），是一个复杂的网络的中心节点，可以抵御多种病原体，并包括多达一半的单体植物。鉴于这种NLR网络的流行，我们假设病原体会趋同进化为针对NRC活动的分泌效应者。为了测试这一点，我们筛选了165个细菌，奥霉素，线虫和虫害效应剂的库，以抑制由NRC依赖性抗病蛋白Prf和Rpi-blb2触发的细胞死亡反应的能力。在已确定的5种抑制剂中，1种囊肿线虫蛋白和1种奥霉素蛋白抑制NRC2和NRC3自身免疫突变体的活性，但非NRC4，表明它们与传感器NLR伙伴无关地专门对抗NRC蛋白的子集。囊肿线虫效应器SPRYSEC15结合了NRC2和NRC3的核苷酸结合领域，而卵母细胞效应器AVRcap1b通过膜贩运相关蛋白质NbTOL9a（Myb 1样蛋白质9a的目标）抑制这些核子细胞的反应。我们的结论是，植物病原体已经进化，通过不同的机制来抵消NRC免疫受体网络的中央节点。与病原体效应器的进化可能已推动 NRC 多样化成为功能冗余节点，在大规模扩展的 NLR 网络中。

引文：德雷夫尼娜L，孔特雷拉斯MP，阿达奇H，乌普森J，韦尔加拉克鲁塞斯A，谢R等人（2021年）植物病原体融合进化，以抵消NLR免疫受体网络的冗余节点。PLoS 生物 19 （8）： e3001136.https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136医学论文发表-

学术编辑：董欣年，美国杜克大学

接收：2021年2月8日：已接受：2021年7月27日：已发布：2021年8月23日

数据可用性：所有相关数据均在本文及其支持信息文件中。MS蛋白质组学数据已通过 PRIDE 合作伙伴存储库存入 ProteomeXchange 联盟，该存储库具有数据集标识符 PXD023178 和10.6019/PXD023178。

资金：这项工作由盖茨比慈善基金会（TSL核心赠款）和生物技术和生物科学研究理事会（英国BBSRC）BB/P012574和BB/V002937/1资助。S.K.还从欧洲研究理事会（欧洲研究中心NGRB和布拉索夫项目）获得资金。L.D.由玛丽·斯克洛多夫斯卡-居里行动研究金（BoostR）资助，H.A.由日本科学促进会博士后研究金资助，A.V..C由英国植物病理学协会暑期助学金资助，J.U.由盖茨比慈善基金会博士生资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有作用。

竞争利益：我读过该杂志的政策，这份手稿的作者有以下相互竞争的兴趣：S.K.从NLR生物学行业获得资金。

缩写：AVR，阳萎;卡夫，花椰菜马赛克病毒;CC，线圈线圈;共同免疫沉淀;CP，涂层蛋白;ESCRT，运输所需的内分泌分类复合物;ETI，执行者触发的免疫力;EV，空矢量;人力资源，反应过度敏感;HRP，马萝卜过氧化酶：LC+MS/MS，液相色谱+串联质谱：LRR，富含柳辛的重复;MAPKK，线粒体活化蛋白激酶激酶：MHD，甲氨酸-异丁阿斯巴酸盐;NB-ARC，与APAF-1、各种R-蛋白和CED-4共享的核苷酸结合域;NLR、核苷酸结合域和富含白素的重复：NRC，细胞死亡所需的NLR;NTI，NLR触发的免疫力;PAMP，病原体相关分子模式;PRR，模式识别受体：PTI，PRR触发的免疫力;PVX，土豆病毒X：TIR，收费/间柳金-1受体;托尔，Myb 1样蛋白质的目标;TRV，烟草响尾蛇病毒：VIGS，病毒引起的基因沉默;Y2H，酵母双混合

介绍

多年来，我们对植物病原体和害虫致病机制的看法有了显著扩展。细菌、卵母细胞、线虫和虫子等各种寄生虫的宿主植物的操纵者比最初预计的要复杂得多。事实上，现在已经确定，这些寄生虫分泌了一组蛋白质，称为效应剂，调节植物的反应，如先天免疫，使宿主感染和殖民化。因此，破译效应者的生化活动，了解寄生虫如何成功殖民和繁殖，已成为分子植物病理学领域的主要概念范式[1，2]。事实上，效应器已经作为分子探针出现，可以用来解开宿主免疫系统的新成分和过程[2]。

迄今为止研究的大多数效应者抑制由病原体相关分子模式（PAMPs）诱导的免疫途径。这种所谓的PAMP或模式识别受体（PRR）触发的免疫（PTI）反应是由细胞表面PRR[3，4]（S1A图）调解的。然而，一组效应者具有阳萎（AVR）活性，无意中激活了核苷酸结合、富含白素的重复（NLR）类蛋白质的细胞内免疫受体，这种反应称为效应或NLR触发免疫（ETI/NTI）[5 +7]。在植物中，NLR 可直接或间接地按照各种机械模型（8，9）识别 AVR 效应器。NTI通常伴随着一种局部形式的程序化细胞死亡，称为超敏感反应（HR），它阻碍疾病进展[6，7，10，11]。由 AVR 效应器激活的 NLR 介导免疫力也可以被其他效应者[12]抑制。然而，与广泛研究的PTTI抑制效应器形成鲜明对比的是，效应者抑制NLR反应的机制仍然鲜为人知[3、13、14]。因此，了解效应者如何抑制NLR功能应该为这些免疫受体如何激活细胞死亡和先天免疫提供重要的见解，这是植物病理学领域的主要未解决的问题之一[15]。

NLR 是多域蛋白，具有与 APAF-1、各种 R 蛋白和 CED-4 （NB-ARC）共享的核苷酸结合域，以及至少 1 个附加域[16]。植物 NLR 的 C 终点站通常是一个富含白素的重复（LRR）域，但它们可以归类为具有不同 N 端域的植物遗传子组[16]18]。在血管膜中，NLR 形成几个主要的 phyl 遗传子组，包括具有 N 端收费/间质素-1 受体（TIR）域的 TIR-NLR，带有 Rx 型线圈（CC）域 CCR-与 RPW8 型 CC （CC）的 NLRR）域，和 CcG10-具有不同类型的 CC （CC）的 NLR 子包A 或CCG10）域。其中，CC-NLR 是最常见的类型，在血管瘤中形成了最大的 NLR 组[16、18、19]。TIR-和 CC 型 N 终端域涉及下游免疫信号、寡聚化和细胞死亡执行[20]。中央 NB-ARC 域展示了 ATP 结合和水解活动，并作为分子开关发挥作用，确定 NLR 非活动/活动状态[21]。最后，LRR域可以调解效应器感知，并经常参与分子内相互作用[8，21]。

植物基因组可以编码在50到大约1000NLR之间[17，22]。其中一些 NLR 是作为单个生化单元运行的功能单体，而另一些则成对或在更复杂的受体网络中工作[23]。配对和联网的 NLR 由功能专用传感器 NLR 组成，可检测病原体效应器和辅助 NLR，将这种效应器识别转化为高度敏感的细胞死亡和阻力。在索拉纳塞，NLR 的主要苯基遗传学包层形成了一个复杂的免疫受体网络，其中对大量传感器 NLR[24]需要多个辅助 CC-NLR，称为细胞死亡所需的 NLR。这些传感器NLRs，由R基因位点编码，对不同的病原体，如病毒，细菌，奥美塞特，线虫和昆虫产生抗药性[24]（S1B 图）。NRC 及其 NLR 合作伙伴共同组成了 NRC 超级夹板，这是一个支持良好的基因集群，分为 NRC 辅助包和 2 个较大的包衣，包括所有已知的 NRC 依赖传感器 NLR[24，25]。NRC超级克隆出现在1亿年前（Mya），它来自NLR对，它扩展为占星体植物物种NLRome的很大一部分[24]。目前的模型是，NRC在这个大规模多样化的领结网络中形成多余的中央节点，不同的 NRC 对其传感器 NLR 合作伙伴表现出一些特殊性。例如，细菌耐药性蛋白Prf以基因冗余的方式需要NRC2和NRC3，而马铃薯耐磨蛋白Rpi-blb2仅依赖于NRC4[24，26]（S1B图）。医学论文发表-

直到最近，支撑植物NLR活化的分子机制以及NTI通路和超敏细胞死亡的后续执行一直未知。最近对CC-NLR ZAR1（霍普兹激活电阻1）和TIR-NLRs ROQ1（XopQ 1的识别）和RPP1（对佩罗诺斯波拉寄生虫1的识别）结构的阐明产生了一个新的概念框架[27×30]。激活的 NLR 寡聚成车轮状的多美性复合体，称为电阻体。在ZAR1的情况下，激活诱导NB-ARC域的构象变化，导致ADP释放，然后是DATP/ATP结合和聚合ZAR1及其伙伴宿主蛋白质进入五角形电阻体结构[28，31]。ZAR1电阻体暴露了由N-终端+1螺旋形成的漏斗状结构，该结构被提议扰乱等离子膜的完整性，从而引发过敏性细胞死亡[28，29]。此 1 六边形由分子特征 MADA 主题定义，该图案存在于大约 20% 的血管瘤 CC-NLR 中，包括 NRC[25]。这意味着ZAR1抗体的生化"死亡开关"机制可能适用于NRC和其他MADA图案，其中包含不同植物分类的NLR。

NRC超级杂质在索拉诺植物中大规模扩展，在某些物种中，它占了NLRome的一半[24]。鉴于这种流行，我们假设病原体会趋同进化为针对NRC网络的分泌效应者。在这项研究中，我们筛选了来自6种主要寄生虫的效应蛋白集合，即细菌伪多莫纳斯注射器，奥米塞特植物花虫感染，囊肿线虫格洛博德拉罗斯托奇恩西斯和格洛博德拉帕利达，和虫子迈祖斯渗透和丙烯酸皮松，因为他们的能力，以抑制过敏细胞死亡触发的 Nrc 依赖传感器 Nlrs Prf 和 Rpi - blb2 。这些屏幕显示 5 个效应器作为 NRC 网络组件的抑制器。其中，奥霉素蛋白PITG-16705（PBHR_012，从今以后， AVRcap1b ）[32]和囊肿线虫蛋白SPRYSEC15（其中SPIRYSEC一词将被称为SS从这里开始）脱颖而出，能够特别抑制由NRC2和NRC3的自身免疫突变体触发的反应，但不是NRC4，表明他们能够抵消NRC辅助蛋白的子集独立于其传感器NLR合作伙伴。进一步研究表明，AVRcap1b 和 SS15 通过不同的机制抑制 NRC2 和 NRC3。虽然AVRcap1b抑制NRC2和NRC3介质免疫取决于膜贩运相关的蛋白质NbTOL9a（Myb 1样蛋白质9a的目标），SS15直接结合NRC2和NRC3的NB-ARC域扰乱其功能。我们的结论是，进化上不同的植物病原体已经融合进化出不同的分子策略来对抗NRC免疫受体网络的中心节点。因此，与病原体效应作用物的进化可能支持 NRC 作为功能冗余节点在大规模扩展的 NLR 网络中的多样化。

结果

***在植物*筛查中显示抑制 NRC 介导的超敏细胞死亡的病原体效应物**

为了确定病原体进化到针对NRC网络的程度，我们筛选了来自6个不同病原体物种的候选效应者，以评估它们抑制抗病性蛋白质Prf（对Pto/AvrPto的反应）引发的超敏细胞死亡的能力：NRC2/3 依赖性）和 Rpi-blb2（对 AVRblb2 的响应;NRC4 依赖）[24，26] 。效应器和空载体（EV，控制）在模型实验植物尼科蒂亚娜·本塔米亚纳的叶子中用Pto/AvrPto或Rpi-blb2/AVRblb2短暂表达，并评估为没有细胞死亡，这表明抑制表型（图1A）。我们的屏幕包括165名来自奥美塞特（P.感染者，63岁），细菌（P.注射器， 26），囊肿线虫（G.罗斯托基恩西斯，23岁和G。帕利达， 3），和虫子（M.珀西凯，47岁和A。皮苏姆， 3）。屏幕上使用的效果器面板由以前报告参与免疫抑制和实验室中现成的效果器的候选者组成。在测试的165个效应器中，2个效应器（AVRcap1b和SS15）抑制了Prf介导细胞死亡，3个效应器（PITG-15278、SS10和SS34）抑制了Rpi-blb2-介导细胞死亡（图1B 1D和S2，S1和S4数据）。 AVRcap1b 和 PITG-15278 是包含P效应器的 RXLR-WY/LWY 域名。节日[33，34] 。SS10、SS15 和 SS34 是包含G效应器的 SPRY 域。罗斯托基恩西斯[35]37] （图 2A， S1 表）.有趣的是，HopAB2（也称为AvrPtoB），它以抑制Prf介质细胞死亡[38]而闻名，在我们的测定中并不是一个强大的抑制剂，而只是在N的旧叶子中抑制Prf介质细胞死亡。本塔米亚娜（S3 图），叶年龄定义[39]。

图1。五个效应者抑制Prf-（NRC2/3受抚养人）或Rpi-blb2+（NRC4受抚养人）调解细胞死亡。

（A）使用的细胞死亡检测策略的示意图表示。效应器和EV被转化为农用细菌，并在N中暂时共用。本塔米亚纳植物与Pto/阿夫尔普托或Rpi-blb2/AVRblb2。EV 被用作负控。HR 是根据渗透后 5 到 7 天之间修改后的 0/7 刻度（Segretin 和同事）评分的。（B） EV 的平均 HR 分数与每个测试效果器的平均 HR 分数的散射图（n = 165）;普托/阿夫尔普托（左面板）Rpi-blb2/AvRblb2（右面板）。具有抑制活动的效应器表示为图中的离群值。结果基于 6 个技术复制（S1和S3数据）。ΔPITG-15278的两个等位基因（P.侵扰菌株T30-4和17777）抑制Rpiblb2调解细胞死亡。PITG-15278 T30-4 在随后的实验中用作代表。（C）代表N.本塔米亚娜叶子渗透与适当的结构拍摄 5 - 7 天后渗透。测试的 R/AVR 对（Pto/AvrPto）或 Rpi-blb2/AVRblb2 标记在叶片面板上方，并在叶片图像上标记效果器。（D）人力资源在农业渗透后5天得分（S4数据）。结果以点图形式呈现，每个点的大小与每个生物复制中具有相同分数（计数）的样本数成正比。该实验独立重复了3次，进行了6次技术复制。EV 或每个单个效应器的列对应于来自不同生物复制的结果。点颜色表示病原体物种（B）中所示。统计测试是使用最佳 R 库[41]实施的。我们使用较低的意义截止 0.025 和上切口 0.975 进行了引导重新采样测试。在控制样本引导人群中，低于这些截止点的测试样本的平均排名被认为显著。条件之间的显著差异用星号（*）表示。统计分析的细节在S2图中介绍。AVR，阳萎;EV，空矢量;人力资源，反应过度敏感。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g001

图2。AVRcap1b 和 SS15 抑制由自动激活 NRC2 调解的细胞死亡活动H480R和 Nrc3D480V但不是 Nrc4D478V.

（A）包含P的 RXLR-WY/LWY 域的域组织。感染效应者AVRcap1b和包含G的B30.2/SPRY（IPR001870）域名。玫瑰花效应器 SS15，其中 Sp = 信号肽， R = Rxlr 图案， U = 非特性域。（B） NRC2、NRC3 和 NRC4 的示意图以及 MHD 主题中的变异站点。在多个序列对齐中，替换残留物以红色显示。（C）代表N.本塔米亚纳叶显示 Hr 后，共同表达 Ev， AVrcap1b，或 SS15，指示在叶板以上，与自身免疫 Nrc2H480R， NRC3D480V，和 Nrc4D478V突变体。植物在农用渗透5天后被拍照。（D） HR 在农用渗透后 5 天得分（S5 数据）。结果以点图形式呈现，每个点的大小与每个生物复制中具有相同分数（计数）的样本数成正比。实验分别进行了3次、6次技术复制。每个测试条件的列（标记在图的底部）对应于来自不同生物复制的结果。统计测试是使用最佳 R 库[41]实施的。我们使用较低的意义截止 0.025 和上切口 0.975 进行了引导重新采样测试。在控制样本引导人群中，低于这些截止点的测试样本的平均排名被认为显著。条件之间的显著差异用星号（*）表示。统计分析的细节在S4图中介绍。CC，线圈线圈;EV，空矢量;人力资源，反应过度敏感;LRR，富含柳辛的重复;MHD，甲氨酸-异丁阿斯巴酸盐;NB-ARC，与APAF-1、各种R-蛋白和CED-4共享的核苷酸结合域;WT ，野生类型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g002医学论文发表-

AVRcap1b 和 SS15 效应器抑制 NRC2 和 NRC3 的自身免疫突变体触发的细胞死亡，但不是 NRC4

为了确定已识别的效应者是否抑制传感器 NLR （Prf 或 Rpi-blb2）或底层辅助器 NLR （NRC2、NRC3 和 NRC4）的活动，我们通过变异甲氨基氨酸/异位丁阿斯巴蒂（MHD）图案生成构成活性（自身免疫性） NRC2H480R， NRC3D480V，和 Nrc4D478V [40| （图 2B）。当在N中瞬态表达时。本塔米亚纳，所有3NRC突变体造成细胞死亡，在没有病原体AVR效应（图2C）。接下来，我们将抑制器 AVRcap1b、SS15、PITG-15278、SS10 和 SS34 以及 EV 控制与 NRC2 共同表达H480R， NRC3D480V，和 Nrc4D478V在N.本塔米亚娜叶（S4 图， S4 数据）.PITG-15278、SS10 和 SS34 没有抑制任何自动激活的 NRC，表明它们针对的是传感器 NLR Rpi-blb2 或 Rpi-blb2 和 NRC4 之间的相互作用（S4 图）。有趣的是，AVRcap1b和SS15抑制了自身免疫性NRC2和NRC3引起的细胞死亡，从而重新概括了它们对传感器NLRS Prf（图2C和2D和 S5，S5 数据）的具体抑制。相比之下，AVRcap1b 和 SS15 并不影响 NRC4（图2C、2D 和 S5）的自动活动。这些结果表明，AVRcap1b 和 SS15 的抑制活性独立于传感器 NLR Prf，并且特定于 NRC2 和 NRC3。根据这些结果，我们专注于 AVRcap1b 和 SS15，因为它们可能作用于 NRC 网络的 NRC2 和 NRC3 辅助器节点，因此具有更大的潜力来揭示支撑助剂 NLR 激活和下游信号的分子机制。

AVRcap1b 和 SS15 效应器抑制通过 NRC2 和 NRC3 发出信号的多种抗病蛋白（传感器 NLR）

为了进一步挑战我们的发现，AVRcap1b 和 SS15 目标 NRC2 和 NRC3，但不是 NRC4，我们筛选了 2 个效果器，以抑制以前分配给 NRC 网络的 6 个抗病传感器 NLR（SW5b、Gpa2、R1、Rx、Bs2 和 R8）[24，25]。除了之前在N测试的 Prf 和 Rpi-b2 之外，我们还与这些 NRC 依赖传感器 NLR 暂时共同表达 AVRcap1b 和 SS15。本塔米亚娜离开使用农业渗透。其中，5 个 NLR 与其认知的 AVR 效应器共用，而我们使用的是 SW5b （SW5b）的构成活动版本D857V).我们还包括Rpi-vnt1作为NRC独立的NLR蛋白负控制[24]。有趣的是，虽然 SW5b 以前显示以冗余方式通过 NRC2、NRC3 和 NRC4 发出信号[24]，SW5bD857V仅通过 Nrc2 和 Nrc3 发出信号。这些实验表明，AVRcap1b 和 SS15 抑制了 SW5bD857V和 Gpa2 除了 Prf，但没有其他 5 Nlr （Rpi - blb2， R8， R1， Rx 和 Bs2）。然而，我们的发现与先前的研究表明SS15能够部分抑制Rx介质细胞死亡（35]）形成鲜明对比。此外，无论是AVRcap1b和SS15抑制细胞死亡调解的NRC独立的NLR Rpi-vnt1（图3和S6和S6数据）。这些结果与 AVRcap1b 和 SS15 抑制 NRC2 和 NRC3 的模型一致，但与 NRC4 不同，因为与 Prf 类似，这两个模型都为 SW5bD857V和 Gpa2 依赖于 NRC2 和 NRC3，而其他经过测试的 NLR 信号通过 NRC4 具体或冗余与 NRC2 和 NRC3[24，25]。

图3。AVRcap1b 和 SS15 抑制传感器 NLR 调解的细胞死亡，该传感器通过 NRC2 和 NRC3 发出信号，但不是 NRC4 发出信号。

代表叶板显示（A） EV 和 AVRcap1b 或（C） EV 和 SS15 的 HR 表型，并带有一系列传感器 NLR（标记在面板 B 和 D 的底部）。照片是在农艺渗透后5天拍摄的。（B， D）HR 结果以点图形式呈现，其中每个点的大小与具有相同分数（计数）的样本数成正比。每种治疗（S6数据）共完成了8次技术复制。统计测试是使用最佳 R 库[41]实施的。我们使用较低的意义截止 0.025 和上切口 0.975 进行了引导重新采样测试。在控制样本引导人群中，低于这些截止点的测试样本的平均排名被认为显著。条件之间的显著差异用星号（*）表示。统计分析的细节在S6图中介绍。EV，空矢量;人力资源，反应过度敏感;NLR、核苷酸结合域和富含白素的重复：Nrc，细胞死亡所需的 Nlr 。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g003

AVRcap1b 和 SS15 只有在没有 NRC4 的情况下才能抑制 Rx 介质细胞死亡

NRC 依赖传感器 NLR Rx 通过识别病毒涂层蛋白（CP）对马铃薯病毒 X （PVX）具有极高的抵抗力，它以基因冗余的方式依赖于 NRC2、NRC3 和 NRC4 [42×45]。NRC的基因冗余可以解释为什么Rx介质细胞死亡没有抑制AVRcap1b和SS15在N。本塔米亚纳（图3）。由于AVRcap1b和SS15抑制了NRC2和NRC3的细胞死亡活性，而不是NRC4，我们推断，在没有NRC4的情况下，这2个效应器应该能够抑制Rx介导细胞死亡。为了挑战这一假设，我们击倒了Rx转基因N中的NRC。使用烟草响尾蛇病毒（TRV）诱发的基因沉默的本塔米亚纳植物，无论是单独（TRV：NRC4）还是组合（TRV：NRC2/3）（图4A）。在用TRV接种三周后，我们在NRC沉默的叶子中与CP共同表达AVRcap1b或SS15。这些实验表明，AVRcap1b和SS15抑制了NRC4沉默叶子中的Rx介质细胞死亡，但不是在NRC2/3沉默的叶子中，也不是在TRV：EV控制（图4B+4E和S7和S7数据）中。这些结果进一步验证了我们先前的发现，即 AVRcap1b 和 SS15 可以特别抑制 NRC2 和 NRC3 的活动，但不能抑制 NRC4 的活动。

· 原始图像

图4。AVRcap1b 和 SS15 抑制NRC4- 沉默的 Rx 转基因尼科蒂亚娜本塔米亚纳植物中的 Rx 介质细胞死亡。

（A）所采取的沉默和渗透战略的示意图。代表N的照片。本塔米亚纳叶显示HR后，共同表达（B）EV或AVRcap1b和（D）EV或SS15在TRV：EV，TRV：NRC2/3，和TRV：NRC4沉默的Rx转基因N。本塔米亚纳植物，其中EV被用作负控制。沉默治疗（TRV：EV，TRV：NRC2/3和TRV：NRC4）在叶片面板上方指示。植物在农用渗透5天后被拍照。细胞死亡反应在农用过滤（S7 数据）（C） EV 和 AVRcap1b 和（E） EV 和 SS15 后 5 天评分，并呈现为点图，其中点颜色表示 EV（蓝色）、AVRcap1b（绿色）或 SS15（橙色）和点大小与相同分数（计数）的样本数量成正比。实验独立重复了3次。每个复制都由每个 EV、AVRcap1b 或 SS15 的沉默处理中的不同列表示。统计测试是使用最佳 R 库[41]实施的。我们使用较低的意义截止 0.025 和上切口 0.975 进行了引导重新采样测试。在控制样本引导人群中，低于这些截止点的测试样本的平均排名被认为显著。条件之间的显著差异用星号（*）表示。统计分析的细节在S7图中介绍。EV，空矢量;人力资源，反应过度敏感;VIGS，病毒引起的基因沉默。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g004

**AVRcap1b 和 SS15 以 NRC2 和 NRC3（但不是 NRC4 依赖的方式）对 Rx 介质的马铃薯病毒 X的极端耐药性进行妥协医学论文发表-**

我们之前表明，NRC2、NRC3和NRC4的收缩不仅损害了 Rx 介导的超敏细胞死亡，还消除了对 PVX 的极端耐药性，导致导致病毒传播的坏死病变 [24]。为了确定由AVRcap1b和SS15调解的抑制转化为减少病毒感染的程度，我们测试了影响者对PVX的抗药性妥协的能力。我们暂时表示AVRcap1b或SS15在Rx转基因N。本塔米亚纳植物，被沉默的NRC要么单独（TRV：NRC4）或组合（TRV：NRC2/3，TRV：NRC2/3/4）。然后，我们用携带PVX（pGR106：:P VX：：GFP）的农用细菌菌感染叶子，并采用牙签接种方法和记录了接种点的尾随坏死病变的形成（见PVX感染检测（农业感染）][24，43，46]（图5A）。与以前的实验[24]一致，我们在NRC三重静音 Rx 叶（TRV：NRC2/3/4）中观察到尾随坏死，无论 AVRcap1b 或 SS15 的存在或不存在（图 5B 和 5C、S8和S9数据）。我们还观察到尾随坏死时，AVRcap1b或SS15表示在NRC4沉默（TRV：NRC4）Rx叶，表明两个效应器损害Rx介导阻力时，NRC4耗尽（图5B和5C，S8和S9数据）。相比之下，Rx 介质对 PVX 的耐药性在NRC2/3沉默（TRV：NRC2/3）叶子中并未受到 AVRcap1b 或 SS15 的影响。不同治疗方法中的病毒积累通过由PVX的亚基因组促进物：：GFP（图5D和5E）驱动的GFP蛋白的西性斑点检测得到验证。与基于病变大小和PVX积累（图5C×5E）的AVRcap1b相比，PVX电阻的扰动受到SS15的影响更为明显。这些结果表明，AVRcap1b和SS15效应剂不仅抑制NLR介导细胞死亡，而且抵消通过NRC2和NRC3调停的抗病表型。

图5。AVRcap1b 和 SS15 在 NRC4 沉默的工厂中对 Rx 介质的极端耐光伏性进行了妥协。

（A）吴先生及其同事先前描述的牙签接种方法允许检查尾随坏死病变的扩散，由于Rx.EV、NRC2、NRC3或NRC4的局部耐药性在Rx-转基因N中单独或组合地沉默。本塔米亚纳植物由 Trv 。（B） EV 或 AVRcap1b 和（C） EV 或 SS15 通过农用渗透在 PVX 接种前 1 天在 NRC 沉默植物的叶子中表达。PVX-GFP （pGR106-GFP）是使用牙签接种方法接种的，根据面板（A）。照片是在PVX接种12-16天后拍摄的。坏死病变的大小是使用斐济（以前图像J）（S8数据）测量的。从不同生物复制中获得的数据以不同的颜色呈现。样本之间的统计差异分析与混合模型ANOVA和Tukey HSD测试（p值<0.01），其中固定的效果是沉默处理（TRV：EV，TRV：NRC2/3，TRV：NRC4，TRV：NRC2/3/4）与EV或AVRcap1b和随机效果是实验复制。条件之间的显著差异用星号（***，p值<0.0001）（S9数据）表示。每个治疗观察到的代表性表型在框图下方显示。免疫博客分析PGR106-GFP牙签接种部位的GFP积累在（D）AVRcap1b和（E）SS15在Rx转基因或WT N的存在。本塔米亚纳植物。AVR，阳萎;CBB，库马西亮蓝色：EV，空矢量;HSD，诚实显著差异;NRC，细胞死亡所需的NLR;PVX，马铃薯病毒X;TRV，烟草响尾蛇病毒;WT ，野生类型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g005

酵母双混合屏幕显示 AVRcap1b 和 SS15 效果器的候选主机相互作用器

为了调查 AVRcap1b 和 SS15 如何抑制 NRC 活动，我们着手识别其主机交互器。我们用效应器作为诱饵在不偏不倚的酵母双混合（Y2H）屏幕上对N.本塔米亚娜– 混合组织 cDNA 库（ULTImate Y2H，催眠服务，法国巴黎）。AVRcap1b对大约1.4亿个克隆进行了筛选，结果有13个候选者从总共35个阳性克隆（S2表）中相互作用蛋白质。SS15对大约6100万个克隆进行了筛选，结果从总共202个阳性克隆（S3表）中筛选出10个候选蛋白质。值得注意的是，NRC3 和 NRC4 是已恢复的 SS15 蛋白质相互作用体之一，鉴于 NLR 蛋白很少从 Y2H 屏幕中恢复，这一点值得注意。从Y2H屏幕中恢复的NRC3和NRC4片段与CC-NB-ARC域相匹配，表明SS15可以结合NRC蛋白质的N终端一半（图6A，S3 表）。NRC2 未在 SS15 的 Y2H 屏幕中恢复为交互器;然而，我们不能排除，这可能是由于这种NLR或其亚域在酵母菌株中积累不良。

图 6.SS15，但不是AVRcap1b，与植物中的NRC有联系。

（A） NRC蛋白质域组织示意图，显示来自水生服务屏幕（S3 表）的Y2H命中。（B） C-终端 4xmyc 标记 NRC2、NRC3 和 NRC4 的 CoIP 实验，带有 C-终端 HA 标记的 AVRcap1b：6xHA 和 N-终端标记为 4xHA：SS15（上图所示）。COIP 与 MYC 珠（MYC IP）和总蛋白质提取物（输入）获得的蛋白质在免疫膨胀时，左侧标有适当的抗血清。蛋白质的近似分子量（kDa）显示在右边。鲁比斯科装载控制是使用皮尔斯染色进行的。该实验在不同的下拉条件下进行了3次以上，结果相似。CC，线圈线圈;共同免疫沉淀;HD1，螺旋域1：LRR，富含柳辛的重复;NBD，核苷酸结合域;NRC，细胞死亡所需的NLR;WHD，有翼的氦域;Y2H，酵母双杂交。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g006

为了进一步调查 SS15 和 NRC 之间的相互作用，我们寻求划定 NLR 中的绑定域。由于来自Y2H屏幕的猎物片段覆盖了NRC3和NRC4（图6A）的CC-NB-ARC域，我们生成了CC和NB-ARC域截断，并在额外的Y2H实验中测试它们与SS15的相互作用。这些测定显示，SS15 与 NB-ARC 结合，但与 NRC2、NRC3 和 NRC4（S8 图）的 CC 域绑定。与先前的观测结果一致，AVRcap1b在这些Y2H实验中没有与NRC的CC或NB-ARC域（S8图）进行交互。

**与 AVRcap1b 不同，SS15 与植物中的NRC2 和 NRC3 有联系**

Y2H的结果促使我们调查AVRcap1b，SS15和NRC之间的关联，使用共同免疫沉淀（coIP）的蛋白质表达在N。本塔米亚纳，这应该揭示在更生理相关的情况下，影响者和全长NRC蛋白之间的关联。为此，我们与 NRC2：4xMyc、NRC3：4xMyc 和 NRC4：4xMyc 在N中共同表达 AVRcap1b：6xHA 和 4xHA：SS15。本塔米亚纳叶使用农业渗透，并使蛋白质提取物受到抗Myc免疫沉淀和西方斑点分析。这些实验表明，SS15与NRC2和NRC3共同免疫沉淀，但与NRC4（图6B）没有。虽然我们确实在 Y2H 中检测到 NRC4 和 SS15 之间的关联，但我们只能在某些生物复制品中检测到弱 NRC4 信号，这表明 SS15 也可能与植物中的NRC4 关联，但与 NRC2 和 NRC3 相比，亲和力明显较低（S9 图）。这一结果符合我们的观察，即SS15无法抑制细胞死亡检测中的NRC4。就AVRcap1b而言，coIP实验与Y2H屏幕一致，因为我们没有检测到AVRcap1b与任何3个NRC（图6B）之间的关联。

SS15 直接将 NRC3 的 NB-ARC 域在体外绑定

为了进一步研究SS15与NRC的NB-ARC域之间的关联，我们利用大肠杆菌作为异质表达系统，将这些蛋白质纯化为体外检测。我们成功获得了同质 SS15 和 NRC3 NB-ARC 域（NRC3）NB-弧形）蛋白质，但由于溶解性和稳定性问题，无法获得纯化的 NRC2 NB-ARC 或 NRC4 NB-ARC 域。我们进行了纯化 SS15 和 NRC3NB-弧形凝胶过滤，发现这些蛋白质在239毫升和227毫升，分别对应42.52和27.75千达（图7）。为了确定这两种蛋白质是否形成复杂的体外，我们混合了表达单个蛋白质的细胞，并共同复制了SS15和NRC3NB-弧形用于凝胶过滤检测（见蛋白质-蛋白质相互作用研究：E的蛋白质纯化。大肠杆菌和体外蛋白质-蛋白质-相互作用研究）。SS15 和 NRC3 的共用混合物NB-弧形导致峰值移位，蒸合体积为 211 毫升，对应于 84.02 kDa。SDS-PAGE对新峰值下的分数的进一步验证证实了这两种蛋白质的存在（图7）。在我们的凝胶过滤分析中，蛋白质分子量校准导致对蛋白质预测分子质量的估计过高，无论是单独还是复杂（NRC3）NB-弧形是 41 kDa， SS15 是 24.5 kDa，和 NRC3NB-弧形・SS15 复合物为 65.5 kDa）。然而，结果表明，每个状态的单体形式存在于溶液中，并且在这些实验条件下，2种蛋白质可能进入1：1复合物中。综合起来，这些结果表明SS15与NRC形成了一个复合体NB-弧形体外。

图7。SS15 将 NRC 蛋白质的 NB-ARC 域在体外结合。

SS15 约束 NRC3NB-弧形域体外。为 SS15（顶部）、NRC3 获得的凝胶过滤痕迹NB-弧形域（中），和复合物的1：1混合物（底部）。插图显示在椭酿峰上收集的分数的 SDS-PAGE 凝胶。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g007医学论文发表-

SS15 与 NRC2 和 NRC3 的 p 循环突变体关联

NLR 蛋白 NB-ARC 领域内的 p 循环图案对于 ATP 结合和水解至关重要，这是一个生化步骤，对于 NLR 寡聚化和激活至关重要[47]。为了确定SS15是否与NRC的p环突变体有关，我们在N.进行了coIP实验。本塔米亚纳与 Nrc p 循环突变体 Nrc2K188R， NRC3K191R，和 Nrc4K190R [24].这些实验表明，SS15与NRC2（NRC2）的p环突变体有关K188R）和 NRC3 （NRC3）K191R) (S10 图）。由于 SS15-NRC 关联不需要完整的 p 循环，我们的发现表明 SS15 可能以 NRC2 和 NRC3 的非活动形式进入复杂状态。

SS15 与激活的 NRC2 形式关联

接下来，我们调查了 SS15 与激活的 NRC2 和 NRC3 关联的程度。我们共同表达 4xha：：SS15 与 C-终端 4xMyc 标记的 NRC2 自身免疫形式H480R和 Nrc3D480V在N.本塔米亚纳使用农业渗透，使蛋白质提取物接受抗Myc免疫沉淀和西式污点分析。我们发现SS15与NRC2共同免疫沉淀H480R，表明此效应器与激活形式的 NRC2 （图8）关联。我们为 NRC3 提供的结果D480V然而，由于这种蛋白质的积累不良，在西方的污点分析中无法在这些条件下检测到，这种蛋白质没有定论。尽管如此，我们的总体结论是，SS15 结合了非活动形式和激活形式的 NRC2。

· 1原始图像

图8。SS15 与自动激活 NRC2 关联。

N-终端4xHA标记的SS15在N中暂时共用。本塔米亚纳与 C 终端 4xmyc 标记 - Nrc2， Nrc3， Nrc4， Nrc2H480R， NRC3D480V，和 Nrc4D478V.IP 是与与 Myc （Myc IP）抗体结合的阿加罗斯珠执行的。CoIP 获得的蛋白质提取物（输入）和蛋白质总在免疫膨胀时右侧贴有适当的抗血清。蛋白质的近似分子量（kDa）显示在右边。鲁比斯科装载控制是使用皮尔斯染色进行的。此实验代表 2 个独立复制。共同免疫沉淀;IP，免疫沉淀。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g008

AVRcap1b associates with the Nicotiana benthamiana ENTH/VHS-GAT domain protein TOL9a in planta

Given that AVRcap1b did not interact with NRCs, we reasoned that this effector targets another host protein that is involved in NLR immunity. To narrow down the list of 13 candidate interactors obtained from the Y2H screen, we subjected AVRcap1b to in planta coIP coupled with tandem mass spectrometry (IP-MS) using methods that are well established in our laboratory [48–50]. IP-MS experiments with GFP::AVRcap1b resulted in the identification of 8 unique AVRcap1b interactors that were not recovered with the control GFP::PexRD54, another P. infestans effector of a similar fold and size (S11 Fig, S4 Table). Three of the 8 interactors were different members of the Target of Myb 1-like protein (TOL) family of ENTH/VHS-GAT domain-containing proteins that function in membrane trafficking as part of the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) pathway [51,52] (Figs 9A and S10 and S4 Table). One of these candidate TOLs, Nbv6.1trP4361, was independently recovered in the Y2H screen (S2 Table). Therefore, we decided to further investigate the corresponding protein (hereafter referred to as NbTOL9a) as a candidate host target of AVRcap1b.

· 原始图像

图9。AVRcap1b 与植物园的Nbtol9a 有联系。

（A） NbTOL9a 域组织示意图，显示屏幕上的 Y2H 命中（S2 表）。（B） AVRcap1b 和 5 NbTOL 家族蛋白（Nbtol9a、NbtOL9b、NbTOL3、NbTOL6 和 NbTOL9c）之间的 CoIP 实验。N-终端 GFP 标记的 AVRcap1b 与所有 5 种 NbTOL 蛋白质暂时共用，融合到 C 终端 6xHA 标签上。N-终端 GFP 标记 PexRD54 用作负控制。IP 是与 GFP （GFP-IP）或 HA （HA-IP）抗体结合的阿加罗斯珠子进行的。总蛋白质提取物在免疫膨胀时，左侧标有适当的抗血清。蛋白质的近似分子量（kDa）显示在右边。鲁比斯科装载控制是使用皮尔斯染色进行的。此实验代表 3 个独立复制。共同免疫沉淀;IP、免疫沉淀;北卡罗来纳州恩布托尔本塔米纳Myb 1样蛋白质的目标;Y2H，酵母双杂交。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g009

N的计算分析。本塔米亚纳基因组揭示了 4 个托尔参数，除了 Nbtol9a，我们称之为 Nbtol9b （Nbv6.1trp9166）， Nbtol3 （Nbv6.1tra40123）， Nbtol6 （Nbv6.1trP73492）和 Nbtol9c （Nbv6.1trA64113）遵循以前发布的命名（S5 表， S12 图）[53]。为了验证AVRcap1b和NbTOL蛋白之间的关联，我们用C-终端6xHA标记的5个TOL参数的融合，在N.。。本塔米亚娜离开，并进行了抗GFP和抗HA免疫沉淀。AVRcap1b 与 Nbtol9a 相关，在较小程度上与 Nbtol9b 和 Nbtol9c 在 Gfp 下拉（Gfp IP）中相关。但是，AVRcap1b 仅与 NbtOL9a 在互惠 HA 拉下（HA IP）（图 9B）中相关联。在这两项实验中，NbTOL9a蛋白与负控制GFP：:P exRD54没有关联。这些结果表明，AVRcap1b 与 NbTOL 家族成员有联系，对 NbTOL9a 表现出更强的亲和力。基于这一结论，我们随后将实验重点放在了NbTOL9a上。

Nbtol9a 消极地调节 Nrc2 和 Nrc3 触发的细胞死亡，但不是 Nrc4 或 Nbzar1

为了获得更多关于NbTOL9a在NRC调解的超敏细胞死亡中的作用的见解，我们改变了NbTOL9a在N的表达方式。本塔米亚娜。首先，我们调查了沉默NbTOL9a对NRC自身免疫的影响。我们生成了一个发夹沉默构造（RNAi：：NbTOL9a），在N的瞬态表达测定中调解NbTOL9a的沉默。本塔米亚娜叶（S13 图）。然后，我们与 Nrc2 共同表达 Rna：：Nbtol9aH480R和 Nrc3D480V使用N的农业渗透。本塔米亚娜离开，以测试Nbtol9a的沉默对 Nrc2 和 Nrc3 调解细胞死亡的程度。为了提高检测的稳健性，我们使用了增加的A浓度。图梅法西斯表达 Nrc2H480R和 Nrc3D480V（OD600= 0.1、0.25 或 0.5）。Nbtol9a的沉默在所有测试的 Od600浓度增强 NRC2 触发的细胞死亡反应H480R和 Nrc3D480V但不影响 Nrc4D478V或恩布扎 1D481V（NRC 独立的 NLR;[54]），与 RNAi 相比：：GUS沉默控制（图10和S14和S10数据）。

图10。Nbtol9a 的沉默增强 Nrc2 调解的细胞死亡H480R和 Nrc3D480V但不是恩布扎 1D481V或 Nrc4D478V.

（A）代表N.本塔米亚娜叶显示 Hr 后， Nrc2 的共表达H480R， NRC3D480V， NRC4D478V，和恩布扎 1D481V与 Rnai：：格斯（控制）和 Rnai：Nbtol9a （标记在叶板上方）。为了提高检测的稳健性，我们使用了增加的A浓度。图梅法西斯表达 Nrc2H480R， NRC3D480V， NRC4D478V，和恩布扎 1D481V（OD600= 0.1、0.25 或 0.5）（S10 数据）。在农艺渗透5天后，人力资源响应被评分并拍照。（B）人力资源结果以点图形式呈现，其中每个点的大小与具有相同分数（计数）的样本数成正比。完成了三个生物复制，由RNAi的列表示：GUS和RNAi：：NbTOL9a，每个治疗组合。统计测试是使用最佳 R 库[41]实施的。我们使用较低的意义截止 0.025 和上切口 0.975 进行了引导重新采样测试。在控制样本引导人群中，低于这些截止点的测试样本的平均排名被认为显著。条件之间的显著差异用星号（*）表示。统计分析的细节介绍在（S14图）。人力资源，反应过度敏感。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g010

接下来，我们通过与N的自身免疫性NRC共同表达NbTOL9a过度表达的效果。本塔米亚娜离开使用农业渗透。自 Nrc2 以来H480R自身免疫反应比 NRC3 弱得多D480V，我们专注于NRC3D480V在此和随后的实验中，因为它提供了一个更可靠的细胞死亡-基于测定读数。Nbtol9a 过度表达减少了 Nrc3 触发的细胞死亡反应D480V但不影响 Nrc4D478V或构成活跃的 MEK2DD，一种线粒体激活蛋白激酶（MAPKK）参与植物免疫信号，我们包括作为额外的控制（图11和S15和S11数据）。总共，这两组实验表明，NbTOL9a 以符合 NRC2 和 NRC3 调解豁免的负面监管作用的方式调节 NRC2 和 NRC3 活动。

图11。Nbtol9a 的过度表达抑制自动激活 Nrc3D480V但不是 Mek2DD或 Nrc4D478V.

（A）代表N.本塔米亚纳叶显示 Hr 后，与 Mek2 共同表达 Ev 和 Nbtol9a （上面贴有叶板标签）DD， NRC3D480V，和 Nrc4D478V.在农艺渗透后 5 天（白光下的左面板，紫外光下的右面板自动荧光），对 HR 响应进行评分并拍照。MEK2DD被列为细胞死亡的阳性控制（S11数据）。（B）人力资源结果以点图形式呈现，其中每个点的大小与具有相同分数（计数）的样本数成正比。完成了三个生物复制，每个治疗（MEK2）的EV、NbTOL9a列表示DD， NRC3D480V， NRC4D478V).统计测试是使用最佳 R 库[41]实施的。我们使用较低的意义截止 0.025 和上切口 0.975 进行了引导重新采样测试。在控制样本引导人群中，低于这些截止点的测试样本的平均排名被认为显著。条件之间的显著差异用星号（*）表示。统计分析详情请介绍于（S15图）。EV，空矢量;人力资源，反应过度敏感。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g011

在没有 Nbtol9a 的情况下，对 Nrc3 的 Avrcap1b 抑制受到损害

我们发现NbTOL9a在NRC2和NRC3调解的细胞死亡中表现出负面的监管作用，这使我们得出了AVRcap1b正在选择NbTOL9a执行其抑制活动的假设。为了测试这一点，我们与自身免疫突变体NRC3共同表达AVRcap1bD480V或 Nrc4D478V在N.本塔米亚娜叶子表达要么 Rnai：：Nbtol9a （Nbtol9a沉默）或 Rnai：：Gus （负控制）。与图2一致，AVRcap1b的过度表达抑制了NRC3引发的细胞死亡D480V但不是由 Nrc4D478V (图12， S12 数据）。然而， Nbtol9a的沉默损害了对 Nrc3 的 Avrcap1b 抑制D480V自身免疫和部分恢复细胞死亡表型（图12，S12 数据）。这些结果表明，AVRcap1b基因要求NbTOL9a完全降低NRC3细胞死亡活性，并有可能选择这种宿主蛋白来执行其抑制活动。

图12。沉默的 Nbtol9a 妥协了 Avrcap1b 调解的对 Nrc3 的压制。

（A）代表N.本塔米亚娜叶显示 Hr 后，共同表达 Rnaa：：格斯和 Rnai：：Nbtol9a与 Nrc3D480V• EV， NRC3D480V• AVRcap1b， NRC4D478V• 电动汽车和 NRC4D478V• 阿夫卡普 1b。人力资源响应得分和拍摄5天后，农业渗透（左面板在白光下，右面板自动荧光紫外线下）（S12数据）。（B）人力资源结果以点图形式呈现，其中每个点的大小与具有相同分数（计数）的样本数成正比。结果基于3个生物复制。统计测试是使用最佳 R 库[41]实施的。我们使用较低的意义截止 0.025 和上切口 0.975 进行了引导重新采样测试。在控制样本引导人群中，低于这些截止点的测试样本的平均排名被认为显著。条件之间的显著差异用星号（*）表示。统计分析详情详情请列于（S16图）。人力资源，反应过度敏感。医学论文发表-

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g012

**Nbtol9a 与植物中的Nrc 不关联**

鉴于 Nbtol9a 对 NRC2 和 NRC3 进行负面监管，我们假设 NbTOL9a 与 NRC2 和 NRC3 关联以执行其免疫调节功能。此外，由于 AVRcap1b 要求 NbTOL9a 完全抑制 NRC3，因此 AVRcap1b 可以通过更改 NbTOL9a-NRC 关联来充当抑制器。为了验证这些假设，我们与 NRC2：4xMyc、NRC3：4xMyc 和 NRC4：4xMyc 共同表示 NbTOL9a：6xHA，无论是在 GFP 在场：：AVRcap1b 还是N中的免费 GFP。本塔米亚纳叶使用农业渗透，并进行了抗Myc免疫沉淀，然后西方污点分析。我们包括 AVRcap1b：4xMyc 作为与 Nbtol9a 关联的正控。虽然我们能够成功检测到NbTOL9a：6xHA和AVRcap1b：4xMyc之间的关联，但我们没有观察到NbTOL9a：6xHA与所测试的3种NRC蛋白质之间的任何关联，无论GFP：AVRcap1b是否存在（图13）。这些结果表明，NbTOL9a介质的NRC2和NRC3的负面调控不涉及植物中这2种蛋白质之间的关联，或者，涉及蛋白质-蛋白质相互作用，这些相互作用过于短暂，无法由coIP检测到。此外，我们的结论是，AVRcap1b不会改变NbTOL9a+NRC协会（或缺乏这些关联）来执行其免疫抑制活动。

图13。NbTOL9a 不与植物中的NRC 关联。

在存在和缺席 AVRcap1b 的情况下，在 Nbtol9a 和 NRC 之间进行 CoIP 实验。C-终端 6xHA 标记的 NbTOL9a 与 NRC2、NRC3 和 NRC4 蛋白质在免费 GFP （EV：GFP）或 N 终端 GFP 标记 AVRcap1b 面前融合到 C 端 4xmyc 标签上。C-终端 4xmyc 标记的 AVRcap1b 被用作与 NbTOL9a 关联的正控。IP 是与与 MYC （MYC-IP）抗体结合的阿加罗斯珠子一起执行的。总蛋白质提取物在免疫膨胀时，左侧标有适当的抗血清。蛋白质的近似分子量（kDa）显示在左边。鲁比斯科装载控制是使用皮尔斯染色进行的。此实验代表 2 个独立复制。共同免疫沉淀;IP、免疫沉淀;Nrc，细胞死亡所需的 Nlr 。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g013

讨论

本研究的目的是解决索拉纳西寄生虫已经进化出针对NLR免疫受体NRC网络的效应蛋白的假设。我们通过执行效果学屏幕证实了这一假设，该屏幕产生了 5 个影响器，这些效应器可以破坏 NRC 网络：SS10、SS15 和 SS34，来自囊肿线虫G。玫瑰花和AVRcap1b和PITG-15278从马铃薯晚病原体P.节日。这5个效应器可以抑制N诱发的超敏细胞死亡。本塔米亚纳由Prf或Rpi-blb2，2 NRC依赖传感器NLRs，作为真正的抗病蛋白发挥作用。有趣的是，这些效应器似乎在NRC网络的不同点（图14）中发挥作用。虽然 SS10、SS34 和 PITG-15278 抑制 Rpi-blb2 调解的细胞死亡，但它们不会干扰下游助手 NRC4 的自身免疫突变体。然而，SS15 和 AVRcap1b 可以有力地抑制 NRC2 和 NRC3 的自身免疫突变体，表明它们的行为处于 NRC 助手或其下游路径的水平。我们发现，SS15 直接结合 NRC2 和 NRC3 的 NB-ARC 域，而 AVRcap1b 与 NbTOL9a 关联，需要此宿主蛋白来完全抑制 NRC3。我们的结论是囊肿线虫和P。侵扰者会聚合进化序列无关的效应器，瞄准NRC网络的关键节点或其下游组件，以抑制宿主免疫信号。本文还强调了使用效应器作为探针来解剖免疫的关键调控成分以及研究NLR受体与它们形成的网络之间的复杂相互作用的价值。

图14。进化的发病原体已经进化成针对索拉纳赛NLR网络的多个层。

P.侵扰和 G.2种进化性独特的病原体，已经进化出抑制NRC网络调解信号的效应器。囊肿线虫病原体的两个效应器，G.罗斯托基恩西斯（SS10 和 SS34），和 1 效应器从灾难病原体， P.感染者（PITG-15278）抑制 NRC4 依赖传感器 NLR R r r- blb2 的功能。囊肿线虫效应器 SS15 与 NRC2 和 NRC3 的非活动形式和激活形式的 NB-ARC 域结合。通过绑定 NRC2 和 NRC3 的 NB-ARC 域，SS15 能够抑制其功能。P.感染效应器 AVRcap1b 抑制 NRC2 和 NRC3 的功能，在 NRC3 的情况下，AVRcap1b 抑制需要与 ESCRT 相关的蛋白质 NbTOL9a。ESCRT，运输所需的内分泌分类复合物;ETI/NTI，效应者/NLR触发的免疫力;NB-ARC，与APAF-1、各种R-蛋白和CED-4共享的核苷酸结合域;NLR、核苷酸结合域和富含白素的重复：Nrc，细胞死亡所需的 Nlr 。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.g014

我们的发现有助于解释为什么植物已经进化出具有复杂结构的NLR受体网络。我们先前假设NLR网络，如NRC网络，有助于保持免疫系统的稳健性，鉴于外部扰动[55]。NRC 网络的一个关键特征是，NRC 充当中心节点，在多种抗病蛋白（NLR 传感器）的下游发挥作用，这些蛋白质在索拉纳塞形成大规模扩展的噬菌体。NRC 节点具有重叠的 NLR 传感器特异性，并显示不同程度的冗余[24]。鉴于NRC对多种抗病蛋白的免疫信号至关重要，它们将成为病原体效应者的理想靶点。我们的发现，2个遥远相关的病原体，一个乌米切特和囊肿线虫，进化效应器，以抑制NRC信号通过不同的机制，支持这一假设。因此，人们很容易推测，NRC的冗余已成为提高工厂逃避免疫抑制能力的战略。例如，虽然 SS15 和 AVRcap1b 都是 NRC2 和 NRC3 的强力抑制器，但它们无法抑制其参数 NRC4。即使存在 NRC2 和 NRC3 抑制器，此冗余也将允许主机启动有效的免疫反应。然而，应该指出，虽然我们确实观察到SS15和NRC4在Y2H屏幕之间的结合，他们的关联是非常薄弱的或无法检测的植物。植物中的生理条件可能不利于 SS15 和 NRC4 之间的关联，这符合我们的观察，即 SS15 不能抑制 NRC4 信号。有趣的是，大多数依赖 NRC 的马铃薯破坏 R 基因，例如 R1、R8 和 Rpi-blb2，通过 NRC4[24]发出信号。因此，NRC4可能已经演变为帮助NLR，主要功能与晚破坏R基因，因为它逃避P的抑制。节日。然而，Rpi-amr1最近被证明要求NRC2和NRC3抵抗P。感染，表明传感器NLR，辅助NRC和病原体效应器之间的相互作用是极其复杂的[56]。尽管如此，这项工作支持了NLR网络通过冗余信号结构使植物免疫系统更具弹性的假设。然而，病原体效应者瞄准NLR网络的程度以及他们这样做的分子机制，仍然不完全了解。医学论文发表-

植物免疫的一个新兴范式是，NTI和PTI信号采用共同的模块并相互强化，模糊了这两类植物免疫之间的划分[57]60]。NTI 抑制效应器（如 AVRcap1b 和 SS15）可能同时通过针对共享的免疫信号节点来损害 NTI 和 PTI。因此，NTI抑制剂的识别可以转化为关于基础抵抗的新见解，并帮助我们进一步破译植物免疫系统的复杂性质。

虽然囊肿线虫效应器SS15用来抑制NRC2和NRC3的精确分子机制仍有待确定，但我们的实验提供了一些重要的见解。SS15 结合了非活动（图6B和S9和S10）和构成活跃形式的 NRC （图 8），大概通过他们的 NB-ARC 域（图 7）。只有少数效应者直接约束 NLR 以抑制其活动的例子。NleA，人类肠道病原性E的效应者。大肠杆菌被证明通过直接结合来抑制NOD样受体（NLR）NLRP3，从而干扰脱脂，这对刺激性活化至关重要[61]。Nlea 通过与 PYD 和 LRR 域（62]进行交互，与无处不在和未受怀疑的 NLRP3 关联。虽然NleA使用的确切机制目前尚不得而知，但作者理论认为，NleA与PYD和LRR域的结合可能通过阻止NLRP3与其他下游信号伙伴的相互作用或阻止脱位酶进入多结合NLR[62]来抑制NLRP3的激酶形成。P.感染 IPI-O4 是一种植物病原体效应剂，报告可结合 NLR 以抑制宿主免疫力。陈和同事[63]和卡基和同事[64]显示，P.感染效应者 IPI-O4 通过直接与 N-终端 CC 域结合，损害了 NLR 抗病蛋白 RB（也称为 Rpi-blb1）调停的 HR，可能与 AVR 效应者 AVRblb1 的结合竞争，该蛋白是 IPI-O4 的同源体。因此，IPI-O4 直接作用于传感器 NLR，更让人想起我们在这里报告的 3 Rpi-blb2 抑制器，而不是 NRC 抑制器 AVRcap1b 和 SS15 （图 13）。

最近对ZAR1、RPP1和ROQ1结构的阐释表明，NB-ARC域的结构改造，一个涉及NLR激活的区域，对于抗体形成至关重要[27]30]。SS15 用来抑制 NRC 调解免疫的机制可能涉及篡改 NB-ARC 结构重组。例如，在哺乳动物系统中，一种称为MCC950的化合物直接结合NLRP3的非活动形式和激活形式，以抑制其功能[65，66]。MCC950 将中央 NACHT 域（相当于植物 NLR 的 NB-ARC 域的哺乳动物）结合在一起，以干扰 ATP 水解并防止对 NLRP3 激活和随后的火药体组装至关重要的构象变化。这最终推动 NLRP3 走向封闭和非活动构象[65，66]。根据我们的发现，我们建议 SS15 可以作为 NLR 抑制剂，通过绑定 NB-ARC 域并迫使 NRC2 和 NRC3 处于灭活状态，从而直接干扰 NRC 活动，可能通过类似于 MCC950 的机制。进一步研究 SS15 在多大程度上干扰 NRC NB-ARC 域的结构改造，将为机械洞察该效应器如何抑制 NRC2 和 NRC3 提供机械见解。

与SS15不同，AVRcap1b来自马铃薯晚期病原体P。感染者间接抑制自身免疫性NRC2和NRC3的功能，因此可能针对这些细胞死亡执行者NLR下游的宿主蛋白。我们确定 TOL 蛋白家族成员 NbTOL9a 为 AVRcap1b 的宿主目标，并表明该宿主蛋白是 NRC3 介质超敏细胞死亡的阴性调制剂。TOL蛋白是ESCRT机制的关键组成部分，在细胞内蛋白质贩运中具有良好的特征作用[52，67，68]。在 ESCRT 贩运通道的早期步骤中，它们通过 ENTH/VHS 和 GAT 域与无处不在的货物相互作用[51+53]充当无处不在的受体。康兰和同事[69]确定了一个托利家族成员，是P的近亲。注射器效应器AvrPto，当这种效应蛋白在N中短暂表达时。本塔米亚纳叶组织。此外，这种托利蛋白的沉默导致P的生长减少。注射器光伏。塔巴奇在N.本塔米亚纳，这符合我们的观察，TOL蛋白可以作为植物免疫信号的负调节器。AvrPto 与 TOL 的近亲性事实进一步将 NRC 网络与 TOL 蛋白连接起来，因为 AvrPto 被 NRC2 和 NRC3 依赖传感器 NLR Prf 所认可。这些发现共同强化了我们的假设，即 TOL 可以充当这个复杂免疫信号网络的负调节器。然而，TOLS用于调节植物免疫力的精确机制仍不得而知。就NbTOL9a而言，这种负面调控似乎并不涉及NbTOL9a和NRC之间的蛋白质-蛋白质相互作用。在哺乳动物系统中，ESCRT通路通过修复等离子膜受损部分[70]72]，对多种形式的程序化细胞死亡（包括坏死和热质疏松症）进行负调节。AVRcap1b 有可能选择 NbTOL9a 在植物细胞中劫持类似的免疫调节贩运途径，以抵消 NRC 介配的 HR 细胞死亡并抑制免疫力。这种模式将符合观察，囊肿贩运是由P大规模重新编程。感染期间的感染影响者[49，73]75] 。

有趣的是，即使AVRcap1b和SS15是强大的NTI抑制剂，它们可以激活某些索拉纳西物种的免疫力。例如，AVRcap1b可以激活具有NLR抗病基因Rpi-cap1的索拉努姆辣椒的加入免疫力，因此名字AVR[32，76]。另一方面，SS15在尼科蒂亚娜塔巴库姆被一种尚未描述的蛋白质所识别，导致HR细胞死亡[35]。AVRcap1b 和 SS15 都充当 NLR 免疫力的触发器和抑制器，这一事实进一步突出了效应者与 NLR/NLR 网络之间存在的复杂共同进化动力学，以及需要进行考虑到这些复杂表态相互作用的研究。此外，了解 AVRcap1b、TOL 和 NRC 之间的相互作用将有助于提高我们对控制植物免疫的监管机制的了解，并确定由复杂的免疫受体网络调解的多方宿主-病原体相互作用的结果。

NLR生物学领域在过去几年中取得了重大进展，然而NLR激活下游的遗传成分和免疫信号通路仍然模糊不清[77]。此外，支撑配对和联网NLR激活和随后细胞死亡反应的精确分子机制仍不得而知。在这里，我们深入了解了植物病原体用来抵消宿主免疫功能的分子策略。我们确定了 5 个影响因素（SS15、AVRcap1b、PITG-15278、SS10 和 SS34），这些影响器会损害 NRC 网络的组件。我们专注于 SS15 和 AVRcap1b，因为这些效应器可以抵消 NRC 或 MADA 型 CC-NLRS-在免疫受体网络中形成中心节点。因此，SS15 和 AVRcap1b 具有独特的潜力，可以发现有关 MADA 型 CC-NLR 电阻体及其下游信号元件激活的宝贵机械细节。事实上，这些遥远的相关病原体，一种卵母细胞和囊肿线虫，已经独立进化出作用物来对抗NRC2和NRC3，这进一步突出了NRC在调解对孤独寄生虫的免疫方面所起的关键作用。除了 SS15 和 AVRcap1 之外，我们还可以通过研究 PTIG-15278、SS10 和 SS34（本研究中确定的 3 Rpi-blb2 抑制剂）来学到很多东西。进一步的研究可能使我们能够确定这3个效应者用来抑制宿主免疫力的目标和机制。最近，来自奥霉素病原体植物多拉辣椒和虫害M的效应者。渗透被证明聚集在主机E3 SUMO韧带SIZ1抑制植物免疫[78]。结合我们的工作，这表明微生物病原体、食草昆虫和寄生线虫可能比预期的更具有常见的毒性机制。研究免疫抑制剂有可能促进我们对支撑植物免疫受体网络的功能原理和进化动力学的理解。然后，可以利用这些知识来指导育种抗病性的新方法，以最大限度地提高作物保护，例如，通过工程NLR来避免病原体抑制。

材料和方法

植物生长条件

野生型和 Rx 转基因[79] N 本塔米亚纳线生长在一个受控的生长室，温度为 22 至 25°C，湿度为 45% 至 65%，光/暗周期为 16/8 小时。

基因克隆和合成

效果器库。

抑制检测中使用的病原体效应物的所有序列信息都可以在S1 表中找到。

P.感染效应器，没有信号肽[33，34]，被优化为索拉努姆管状体，并由 Genewiz （南普莱菲尔德，新泽西州，美利坚合众国）合成到 puc57 - amp。效应器序列由普西翁高保真DNA聚合酶（热费舍尔）从pUC57-amp载体放大，纯化放大器直接用于金门组装成0级通用接受器pUAP1（塞恩斯伯里实验室（TSL）SynBio，第63674号添加基因）。用于 PCR 放大的引数列在S6 表中。表达结构是由金门组装的0级模块成二元载体pICSL86977OD[与花椰菜马赛克病毒（CaMV）35S促进剂和章鱼合成酶基因）终结者]（添加基因号86180）。PITG-05910 和 PITG-22926 由 GENEWIZ（美国新泽西州南普莱菲尔德）合成为 pUC57-kan 作为金门 L0 模块，然后分组成二元载体 pICH47742 [添加基因号 48001]，以及 pICH51266 [35S 推广人+Ω促进器，添加基因号 50267]和 pICH41432 [奥托平合成酶终结者，添加基因号 50343]。所有构造都通过测序进行验证。

G.罗斯托基安西斯效应器SS4，SS8，SS9，SS15，SS16和SS19克隆成pBINPLUS表达载体与N终端4xHA标签由阿斯卡戈弗斯（荷兰瓦格宁根大学皮肤病实验室）[36，80]。G.帕利达效应器序列 12N3， 33H17[81]由 GENEWIZ （南平原，新泽西州，美国）合成为金门 0 级模块成 pICH41155， Gpa-SS37[82]由 GENEWIZ （南平原，新泽西州，美国）合成为金门 0 级模块到 pUC57-kan.剩余的G.从https://parasite.wormbase.org网站[37]中提取了玫瑰花效应器序列，由 GENEWIZ（美国新泽西州南普莱菲尔德）合成为金门 0 级模块，制成 pUC57-kan。这些效应器被分组成二元载体 pICH47732 [添加基因否。 50434]，连同pICH51266 [35S促进者+Ω促进剂，添加基因号50267]，和pICH41432[奥托平合成酶终结者，添加基因号50343]进行细胞死亡抑制检测。

绿桃虫（M.渗透）和豌豆虫（A.皮苏姆）效应器克隆成pCB302-3在A。Tumefaciens应变 GV3101：:p M90 由萨斯基亚·霍根豪特（英国诺维奇约翰·因内斯中心）提供）番茄细菌斑点病原体（P.注射器）效应器克隆成 pEarly 门 100 在A.Tumefaciens菌株 C58C1 由马文波提供（前加州大学，美国河滨分校，目前为英国诺维奇塞恩斯伯里实验室）。

NRC 结构的合成。

全长N.本塔米亚纳NRC2a辛（NCBI 加入号 KT936525）•24]，NRC3WT，和 Nrc4WT由GENEWIZ（美国新泽西州南平原菲尔德）合成成pICH41155作为金门L0模块（S7表）。这些序列被手动驯化以删除 BpiI 和 BsaI 站点。

NRC2、NRC3 和 SW5b 的站点定向突变。医学论文发表-

NRC2、NRC3 和 SW5b 的自动突变体通过在 NRC2 的 MHD 图案中引入组氨酸（H）到精氨酸（R）突变，以及在 NRC3 和 SW5b 的 MHD 图案中将阿斯酸（D）替换为虚线（V）来生成。S8 表中列出的引物用于用与 Phusion 高保真DNA聚合酶（热费舍尔）的反 PCR 引入突变。pICH41155：：NRC2， PCR8：NRC3WT [26[和 pICH441155：：SW5b[24]分别用作 NRC2、NRC3 和 SW5b 的站点定向突变的模板。变异变种通过测序进行验证，然后分包到 pICSL86977OD [添加基因号 86180] （用于 NRC2）H480R和 Sw5bD847V）和 pich86988 [添加基因号 48076] （Nrc3）D480V).本研究中使用的自动NRC4突变体以前被描述[25]。经过验证的质粒随后被转换为GV3101：pM90，用于细胞死亡检测屏幕。

为了确定一个完整的p环是否对NS15在植物关联NRC2和NRC3中是必不可少的，一个赖氨酸（K）到精氨酸（R）突变被现场定向突变独立引入到两种蛋白质的p环中，使用磷离子高保真DNA聚合酶（热费舍尔）。pCR8：NRC2WT-ns 和 PCR8：NRC3WT-ns[26]用作模板。用于引入突变的引物列在S8 表中。变异的 NRC 变体通过测序进行验证，并分组到 pICH86988 [添加基因号 48076] 以及 pICSL50010 [C-终端 4xMyc 标签，附加基因号 50310]。这两种构造都经过测序验证，并转换为A。图梅法西恩斯GV3101：:p M90。

克隆成E。大肠杆菌表达载体蛋白质纯化。

SS15： DNA 编码 SS15 残留 Ser-25 到 Ile-246 （缺乏信号肽）被放大从 pBINPLUS：：4HA：：SS15 质粒（使用S15 表中显示的底漆），并克隆到 pOPINS3C 载体中，从而生成带有 SS15 的 N 端 6xHis-SUMO 标签，由 3C 裂口站点（pOPINS3C：SS15）链接 [83]。

NRC2、NRC3 和 NRC4 的 NB-ARC 域名：对于 NRC2，生成了具有替代域边界的 2 个 NB-ARC 域结构。DNA 编码 NRC2 NB-ARC 域残渣 Val-148 到 Tyr-508 （NRC2）148–508或 Val-148 到 Asn-496 （NRC2）148–496）被放大从 pich41155：Nrc2a辛（使用S15 表中显示的引物）并克隆到矢量 pOPINS3C 中，生成一个 N 终端 6xHis - SUMO 标签，该标签由 3C 站点（ pOPINS3C ： NRC2 ）链接148–508和 popins3c： Nrc2148–496，分别）。同样，DNA编码NRC3 NB-ARC残留瓦尔-152至Ser-507（NRC3）NB-弧形）被放大从 pICH41155：NRC3WT（使用S15 表中显示的引物）和 DNA 编码 NRC4 NB-ARC 域阿拉-150 到 Lys-491 （NRC4）NB-弧形）被放大从 pICH41155：NRC4WT（使用S15表中显示的引言）并克隆成上述矢量pOPINS3C（pOPINS3C：NRC3）NB-弧形和 popins3c： Nrc4NB-弧形，分别）。

生成 C 终端 4xMyc 标记 NRC2 和 NRC3 自动活性突变体。

生成 NRC2H480R*4xMyc 和 Nrc3D480V*：4xMyc，停止科顿从 picsl86977od： nrc2 中删除H480R和 pICH86988：：NRC3D480V由普西翁高保真DNA聚合酶（热菲舍尔）使用引物在S8表。纯化放大器直接用于金门组装成二元载体 pICH86988 [添加基因号 48076]，以及 pICSL50010 [C-终端 4xMyc 标签，添加基因号 50310]。这两种结构都通过DNA测序得到验证，然后转化为A。细菌株GV3101：:p M90。

生成 N 终端 GFP 标记、C 终端 6xHA 标记和 C 终端 4xmyc 标记的 AVRcap1b。

用于coIP实验的AVRcap1b结构是由金门组装产生的。要生成 GFP：：AVRcap1b，级别 0 pUAP1：：AVRcap1b 被组装成二元载体 pICH86966 [添加基因号 48075] 由 pICSL13008 驱动 [CaMV 35S 促销员+5] 未翻译的领先烟草马赛克病毒， TSL 合成生物®， pICSL30006 [GFP，添加基因号 50303]，和 pICH41432 [奥托平合成酶终结者，添加基因号 50343]。要生成 AVRcap1b：：6xHA 和 AVRcap1b：L4xmyc，停止科顿被 Phusion 高保真 DNA 聚合酶（热费舍尔）使用S6 表中列出的引物从 pUAP1：：AVRcap1b 中删除。纯化放大器直接用于金门组装成二元载体 pICH47742 [添加基因号 48001] 由 pICH85281 驱动 [曼诺平合成酶促进器]Ω （Maspro]），添加基因号 50272]， pICSL50009 [6xHA，添加基因号 50309]，和 pICSL60008 [阿拉伯多普西斯热休克蛋白终结者（HSPter）， TSL SynBio] 。所有构造都通过DNA测序进行验证，然后转换为A。细菌株GV3101：:p M90。

Nbtol 参数克隆。

我们使用Nbv6.1trP4561的对等爆炸搜索，这在IP-MS和Y2H测定中都被识别出来，并挖掘V6.1转录仪（https://benthgenome.qut.edu.au/）来寻找额外的托尔序列。我们与基于基因组的预测蛋白体[84]交叉验证提取的 TOL，并删除了可能的重复，这些重复表示由于组装了短读序列。我们总共确定了 5 个 TOL 参数，我们称之为 Nbtol9a （Nbv6.1trp4361）， Nbtol9b （Nbv6.1trp9166）， Nbtol3 （Nbv6.1 trA40123）、NbTOL6 （Nbv6.1trP73492）和 NbTOL9c （Nbv6.1trA64113）（S5 表）。Nbtol 参数使用 GENEWIZ（美国新泽西州南普莱菲尔德）合成为 pUC57-Kan 作为 L0 模块。个别的 TOL 参数由 Phusion 高保真DNA聚合酶（热费舍尔）进行 PCR 以删除止损（S12 表中列出的底漆信息）。纯化放大器直接用于金门组装成二元载体 pICH47732 [添加基因否。 50434]，连同 pICH51266 [35S 推广人+Ω发起人，添加基因号 50267]，pICSL50009 [6xHA，添加基因号 50309]，和 pICH41432 [奥托平合成酶终结者，附加号 50343]。所有构造都经过DNA测序验证，并转化为A。图梅法西恩斯GV3101：:p M90。

通过农业渗透进行细胞死亡和抑制检测

用于细胞死亡检测的构造信息在S9 表中汇总。NLR免疫受体和认知效应器以及具有EV或效应器构造的自动免疫受体的瞬态表达是按照先前描述的方法[13]进行的。简言之，4到5周大的N.本塔米亚纳植物被A渗透。图梅法西恩斯GV3101：:p M90菌株携带文本中不同指示蛋白质的表达载体。A.在渗透缓冲器（10 mM MES，10 m M MgCl）中调整了图梅法森悬架2，和 150 μm 乙酰胺酮（ph5.6）到最终 Od600在S9 表中表示。奥德600所有效应者调整为 0.2。对于 Nbtol9a 过度表达分析， Nbtol9a： 6xha 构造在最后的 Od 中被硬币过滤6000.2.细胞死亡，HR，表型在农艺渗透后5至7天得分，除非另有说明，使用先前描述的量表[85]，从0（未观察到坏死）修改为7（结膜坏死）。

NRC 同源的病毒诱导基因沉默（VIGS）

VIGS 在N.本塔米亚纳如前所述[86]。暂停 A.Tumefaciens应变 GV3101：:p M90 容纳 TRV RNA1 （pYL155）和 TRV RNA2 （pYL279），与 NRC 的相应片段2， NRC3和NRC4，混合在渗透缓冲（10 mM 2 -[N-摩尔磷酸] - 乙烷磺酸 [MES]; 10m MgCl2;和 150 μM 乙酰胺酮（pH 5.6）到最后的 OD600 0.3 。两周大的N.本塔米亚纳植物被A渗透。VIGS 检测的图梅法西斯;上叶在2至3周后用于进一步的农业过滤。NRC2/3双沉默、NRC4和NRC2/3/4三次沉默构造之前已描述[24，26]。医学论文发表-

PVX 感染检测（农业感染）

TRV感染后3周使用植物。植物感染了PVX（pGR106），使用牙签接种方法，通过A表示。图梅法西恩斯[24，46]，并检查从接种点的尾随坏死病变的传播[43]。pGR106：:P VX：：GFP 构建生成之前描述[24]。在PVX牙签接种的前一天，EV和pICH86977：：AVRcap1b 或 pBINPLUS：：4HA：SS15 结构通过农业渗透到Rx植物的叶子中表示，这些植物受到NRC2/3双、NRC4和NRC2/3/4三重沉默的影响。然后，渗透区域用记号笔圈住。NRC同源被VIGS压制，如上文所述，在Rx转基因N。本塔米亚娜。牙签被浸入了A文化中。土司密特窝藏PVX-GFP载体，然后用来穿孔在N的叶子小孔。本塔米亚娜。照片是在PVX接种后3周拍摄的，在斐济（原图片J）测量病变的大小。病变大小的散射图是使用 ggplot2 封装在 R 中生成的，如前所述[87]。核心孔（0.8 厘米）2）用于收集叶盘从接种地点 3 周后 PVX 接种免疫膨胀与抗 GFP （B-2， sc9996 HRP，圣克鲁斯生物技术）.GFP 积累可视化皮尔斯 ECL 西（32106，热科学），并在必要时高达 50% 超级信号西 Femto 最大灵敏度基板（34095，热科学）.

尼科蒂亚娜本塔米亚纳和***阿拉比多普西斯塔利亚娜*托尔蛋白的基因分析**

在N中发现的NbTOL参数的氨基酸序列。本塔米亚娜和以前出版的A.塔利亚娜AtTOL蛋白[53，88] 使用 Clustal 欧米茄[89]对齐。然后，在 MEGAX[90]中手动编辑对齐。对齐中的间隙被手动去除，只有 ENTH 和 GAT 域用于生成噬菌体树。N的最大可能性树。本塔米亚娜和A.塔利亚娜TOL 使用 JTT 模型在 MEGAX 中生成，并且基于 1，000 次迭代（S12 图）的引导值。然后使用 iTOL[91]可视化生成的树。用于制作树的对齐是作为S13 数据提供的。

发夹RNA介质基因沉默

沉默的碎片被放大出N。本塔米亚纳cDNA由普西翁高保真DNA聚合酶（热费舍尔）使用引物列在S10表。沉默片段的特异性是使用N分析的。本塔米亚纳基因组序列及相关基因沉默目标预测工具（SGN VIGS工具：https://vigs.solgenomics.net）。据严和他的同事说，纯化放大器被克隆成pRNAi-GG载体[92]。结构通过DNA测序验证，然后转换为A。tumefaciens应变 GV3101：:p M90。沉默逃避恩布托莱 9a （Nbtol9a）辛）由 Genewiz （南普莱菲尔德，新泽西州，美国）在 puc57 - kan 合成，并根据吴和他的同事[24]生成。叶子被硬币过滤与 prnaai - gg：：Nbtol9a或 prnai - gg：：Gus，在最后的 Od6000.5，以及文本中指示的不同蛋白质与最终 Od600在S10表中表示。如上所述，叶子上的HR细胞死亡得分为5至7天。

蛋白质与蛋白质相互作用研究

酵母双混合屏幕。

不偏不倚的Y2H屏幕由催眠服务（http://www.hybrigenics.com，巴黎，法国）执行。对于AVRcap1b（残留阿拉62 ×Pro678，缺乏信号肽）被克隆成pB27和pB66诱饵质粒，作为C终端融合莱克萨（LexA-AVRcap1b）和Gal4（Gal4-AVRcap1b），分别。2个屏幕是针对随机准备的N执行的。本塔米亚娜- 混合组织 cDNA 库。对于LexA-AVRcap1b，共筛选了5，280万次相互作用（大约5倍的库覆盖范围），并全面分析了9个阳性克隆。对于Gal4-AVRcap1b，共筛选了8，760万次相互作用（大约8倍的库覆盖范围），并充分分析了26个阳性克隆。这些克隆对应于14种不同的注释蛋白，其中一种是未知的（S2表）。对于SS15（残留Ser25 -停止246，缺乏信号肽）被克隆成pB27作为C终端LexA诱饵（LexA-SS15），并筛选对随机准备N。本塔米亚娜- 混合组织 cDNA 库。共筛选了6，140万次相互作用（大约6倍的库覆盖），并完全处理了202个阳性克隆，对应10种不同的注释蛋白质，其中3种未知（S3表）。相互作用是根据其预测的生物分数进行分类的，这是一种评估相互作用可靠性的指标，根据片段之间诱饵结合竞争的统计模型计算[93，94]。

为了缩小区域内调温SS15和NRC之间的蛋白质-蛋白质相互作用，我们生成了NRC2、NRC3和NRC4 CC和NB-ARC域截断，并使用媒人黄金系统（美国Takara Bio）进行了Y2H实验。在这项研究中生成的PGBKT7（诱饵）中编码AVRcap1b（负控制）和SS15的普拉斯米德DNA（使用S11表中显示的引物），被共同转化为化学上称职的Y2HGold细胞（Takara Bio，美国）与个别NRC截断在pGADT7（猎物）（使用引物显示在S11表），如前所述[95，96]，在AH109酵母菌株。在选择板上生长的单个菌落在 5 毫升 SD 中接种-勒-特普夜间28°C（ST0047，高村生物，美国）。然后，饱和培养物被用来对OD进行连续稀释6001, 10+1和 10+2分别。然后在 SD 上发现每次稀释的 3 μl 音量-勒-特普板（ST0048，高村生物，美国）作为增长控制和 SD- 卢 - 特普 - 阿德 - 他板（ST0054，高村生物，美国）包含 X -α加仑，并辅以 0.2% 腺苷.板块在28°C下孵育3至6天，然后成像。每个实验至少重复3次，结果相似。商业酵母结构用作正（pGBKT7-53/pGADT7-T）和负（pGBKT7-Lam/pGADT7-T）控件（克隆技术）。

在植物子网。

蛋白质样本是从2N中提取的。本塔米亚娜离开 3 天后，农业渗透和同质化在 Gten 提取缓冲 [10% 甘油， 25 m Tris- hcl （pH 7.5）， 1 m M EDTA， 150 m Nacl， 2% （w/v）聚乙烯聚丙烯酮， 10 m 二甲基三醇， 1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（SIGMA）， 0.2% IGEPAL （西格玛）][97]。最终浓度 OD600用于每种蛋白质在S13表中表示。在 5，000 ×克的离心 20 分钟后，超纳特通过迷你萨特 0.45 μM 过滤器（萨托里乌斯·斯特蒂姆），用于 SDS-PAGE。对于 coIP，1.4 毫升过滤的总蛋白质提取物与 30μl 的 GFP-Trap-A 阿加罗斯珠（德国慕尼黑的 Chromatek）、抗 c-myc 阿加罗斯珠（A7470、SIGMA）或抗 HA 亲和力基质珠（罗氏）混合，在 4°C 下孵育结束 1 小时。珠子用免疫沉淀洗涤缓冲器（GTEN提取缓冲器0.3%（v/v）IGEPAL（SIGMA））洗了5次，并重新沉积在70μl SDS装载染料中。蛋白质在 70°C（GFP）或 95°C（用于 myc 或 HA）的 10 分钟内加热，从而从珠子中分离出。免疫沉淀样品由SDS-PAGE分离，并根据制造商的说明，使用跨布洛特涡轮转移系统（慕尼黑Bio-Rad）转移到聚乙烯二氟化物膜上。在特里斯缓冲的盐水加上Tween 20（TBS-T）中，在4°C或室温下至少1小时，Blots被预先锁定了5%的脱脂奶粉。在 TBS-T 中 5% 脱脂奶粉中稀释 1：5，000 稀释 5% 脱脂奶粉时，检测到 HA 探针（F-7）马萝卜过氧化酶（HRP）结合抗体（圣克鲁斯生物技术）、c-Myc （9E10） HRP （圣克鲁斯生物技术）或抗 GFP （B-2） HRP （圣克鲁斯生物技术）抗体。蛋白质被可视化与皮尔斯ECL西（32106，热科学），并在必要时高达50%的超级信号西Femto最大灵敏度基板（34095，热科学）。膜成像是使用图像量LAS 4000发光成像仪（GE医疗保健生命科学，皮斯卡塔韦，新泽西州）进行的。鲁比斯科装载控制是使用皮尔斯（24580，热科学）或即时蓝色（剑桥Expedeon）染色的。

蛋白质净化从E.大肠杆菌和体外蛋白质-蛋白质相互作用研究。

重组SS15蛋白（缺乏信号肽）是使用E。大肠杆菌用 pOPINS3C：SS15 转化的飞毛化细胞[98]（见上面的基因克隆和合成部分）。细胞培养在自动感应介质[99]中生长在 30°C 到 A6000.6 至 0.8，随后在 18°C 下进行隔夜孵化，并通过离心进行收获。颗粒细胞被重新吸收在50mM Tris HCl（pH 8），500mM NaCl，50mM甘油，5%（vol/vol）甘油，和20mM imidazole（缓冲A）补充了cOmplete EDTA无蛋白酶抑制剂片剂（罗氏）和解剖声波。澄清的细胞解解剂应用于尼2+-连接到 AKTA 纯系统的 NTA 列。6xHis®SUMO-SS15 是一步到位与洗脱缓冲器（缓冲器 A 包含 500 mM imidazole），并直接注入到超级 200 26/600 凝胶过滤列预先平衡在缓冲 B （20 mM HEPES （pH 7.5）， 150 m M NaCl，和 1 m M Tcep）。含有6xHis+SUMO-SS15的分数被集中并浓缩到2至3毫克/毫升。6xHis®SUMO 标签通过添加 3C 蛋白酶（10 μg/mg 融合蛋白）和在 4°C 下隔夜孵育而裂开。裂开的 SS15 使用 Ni 进一步净化2+-NTA 列（收集 eluate），然后如上所述进行凝胶过滤。蛋白质的浓度是通过吸收量280纳米（使用SS15，35920M的摩尔灭绝系数计算得出的）来判断的+1厘米+1).

重组 NRC3NB-弧形是使用E制作的。大肠杆菌Lemo21 （DE3）细胞与 pOPINS3C 转换：NRC3NB-弧形（详情请参阅基因克隆和合成部分）。细胞培养在 30°C 的自动感应介质中成长为 A6000.6 至 0.8，随后在 18°C 下进行隔夜孵化，并通过离心进行收获。颗粒细胞在缓冲剂A中重新使用EDTA无蛋白酶抑制剂片剂，并通过声波解解。澄清的细胞解解剂应用于尼2+-连接到 AKTA 纯系统的 NTA 列。6xHis_苏莫-NRC3NB-弧形被一步埃勒特缓冲器（缓冲器A包含500mm imidazole），并直接注入到超级x 200 26/600凝胶过滤列预先平衡在缓冲B（20 mM HEPES（pH 7.5），150 mM NaCl和1m TCEP）。包含 6xHis+SUMO-NRC3 的分数NB-弧形集中和浓缩到1毫克/毫升。6xHis®SUMO 标签通过添加 3C 蛋白酶（10 μg/mg 融合蛋白）和在 4°C 下隔夜孵育而裂开。裂开的 NRC3NB-弧形使用 Ni 进一步净化2+-NTA 列（收集 eluate），然后如上所述进行凝胶过滤。蛋白质的浓度是通过吸收量280纳米（使用NRC3的计算摩尔灭绝系数来判断的）NB-弧形， 48020 M+1厘米+1).

用 NRC3 在复合体中净化 SS15NB-弧形， E.大肠杆菌培养是针对 SS15 和 NRC3 单独生长的NB-弧形如上所述，通过离心机收获。表达 SS15 和 NRC3 的颗粒细胞NB-弧形分别在缓冲剂A中重新使用，辅以无EDTA蛋白酶抑制剂片剂。重新悬念后，SS15 和 NRC3NB-弧形表达细胞通过声波混合和解解在一起。澄清细胞解解剂（含6xHis+SUMO-NRC3）NB-弧形和 6xHis - 苏莫 - Ss15）适用于尼2+-连接到 AKTA 纯系统的 NTA 列。6xHis®SUMO 标记蛋白（SS15 和 NRC3）NB-弧形）被一步一步地与洗脱缓冲（缓冲器 A 包含 500 m M imidazole）和直接注入超级 200 26/600 凝胶过滤列预先在缓冲 B （20 m M HEPES （pH 7.5）， 150 mM NaCl，和 1 mM TCEP）中预平衡。包含 6xHis+SUMO-SS15 和 6xHis+SUMO-NRC3 的分数NB-弧形集中和浓缩到1至2毫克/毫升。6xHis®SUMO 标签通过添加 3C 蛋白酶（10 μg/mg 融合蛋白）和在 4°C 下隔夜孵育而裂开。裂开的 NRC3NB-弧形和 SS15 复合体被进一步净化使用 Ni2+-NTA 列（收集 eluate），然后如上所述进行凝胶过滤。包含 NRC3 复杂部分的分数NB-弧形和SS15汇集在一起，集中。复合物的浓度是通过吸收量280纳米（使用SS15和NRC3的计算摩尔灭绝系数）来判断的NB-弧形， 83940 M+1厘米+1).

IP-MS

总蛋白质是从N中提取的。本塔米亚娜离开3天后，农业渗透的GFP：：AVRcap1b或GFP：:P exRD54[74]，并遭受免疫沉淀使用GFP_Trap_A珠（克罗莫泰克，慕尼黑，德国），如前所述[50，97，100]。PexRD54 被包括为一个控制，因为它也是一个大的 P.节日RxLR 效应器和广泛的研究表明，它的作用可能独立于 NRC 网络[74，75]。最终 OD600每种蛋白质在S13表中表示。免疫沉淀样品由SDS-PAGE（4%至20%梯度凝胶，Biorad）分离，并沾染了库马西辉煌的蓝色G-250（简单蓝色安全污渍，异体蛋白）。浓缩蛋白质样本从凝胶中切出（约5×10毫米），并用试丁素消化。提取的肽通过液相色谱和串联质谱仪（48，50+）与轨道疗法融合质谱仪和纳米流-HPLC系统U3000（英国热费舍尔科学）[48，50]进行分析。共提交了3个生物复制品，每个样本类型。医学论文发表-

质谱数据处理。

如前所述[48]50，97，100] ，峰值列表是使用 MS 转换[101]和吉祥物服务器 2.4.1 上识别的肽使用吉祥物大蒙（矩阵科学）从原始数据中提取的。峰值列表被搜索对N。benthamiana基因组数据库称为Nicotiana_Benthamiana_Nbv6trPAplusSGNUniq_20170808（398，682序列;137，880，484残留物），辅以常见的污染物。搜索设置允许尝试肽与多达2个可能的误切和充电状态+2，+3，+4，碳水化合物甲基化半胱氨酸（静态）和氧化甲基氨基酸（可变）修改和单位位素前体和片段离子质量容差分别为10ppm和0.6 Da。诱饵数据库用于验证肽序列匹配。吉祥物结果在脚手架4.4.0（蛋白质组软件）中结合，其中肽序列匹配和推断蛋白的阈值分别超过95.0%和99%，每个蛋白质至少识别2种独特的肽。上述蛋白质列表的光谱计数为定量值，在Excel（微软）中进行了出口和进一步分析。有关已识别的肽的更多信息，可在S14 表中找到。

MS蛋白质组学数据已通过 PRIDE[102]合作伙伴存储库存入到 ProteomeXchange 联盟，该存储库具有数据集标识符 PXD023178 和10.6019/PXD023178。

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效应器可以抑制 ETI/NTI。

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S1 图。效应器可以抑制 ETI/NTI。

（A） ETI/NTI 抑制效应器抵消了其他具有 AVR 活性（AVR 效应器）的效应因果机引起的 NLR 免疫力的激活。迄今已研究的大多数效应者通过对 PTI 信号中涉及的各种主机目标采取行动来抑制 PTI。然而，我们对NTTI抑制效应器的机制以及这些效应器如何抵消NLR受体功能和/或抗体形成（B）索拉纳塞的NRC网络知之甚少。帮手 NLR （NRC2、NRC3 和 NRC4）具有一系列 R 基因的冗余功能，这些基因可对多种病原体产生抗药性。这些 R 基因编码 NLR 传感器，这些传感器专门检测来自多种病原体（如卵母细胞、细菌、线虫、病毒和虫子）的效应。许多依赖NRC的R基因在农业学上都很重要。带 N 端扩展的传感器 NLR（蓝色）在 N 终点站具有额外的域，以深蓝色表示。病原体效应因素已发展到以NRC帮手为目标的程度目前尚不清楚。图为[24，55] 。AVR，阳萎;ETI/NTI，效应者/NLR触发的免疫力;NLR、核苷酸结合域和富含白素的重复：NRC，细胞死亡所需的NLR;PAMP，病原体相关分子模式;PRR，模式识别受体：PTI，PRR触发的免疫力。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s001

（蒂夫）

S2 图。对5个候选效应器的细胞死亡抑制分析，用Pto/AvrPto或Rpi-blb2/AVRblb2进行硬币过滤。

统计分析是使用最佳R库（麦克莱恩，2019年）（S4数据）进行的。（A/D）每个面板对应来自 Pto/AvrPto 或 Rpi-blb2/AVRblb2（上图所示）的结果，与 EV（深蓝色）、AVRCAP1b（绿色）、HopAB2（深色）共同表达紫色）、PITG-15278（浅紫色）、SS10（浅蓝色）、SS15（深橙色）或SS34（浅橙色），其中EV被用作负控制，标记在图下方。左面板表示排名数据（点）及其相应的手段（虚线），每个点的大小与每个特定值的观测数成正比（每个面板下面计算键）。我们使用较低的意义截止 0.025 和上切口 0.975 进行了引导重新采样测试。在控制样本引导人群中，低于这些截止点的测试样本的平均排名被认为显著。右侧的面板显示 1，000 引导样本排名值的分布，其中曲线下方的蓝色区域表示分布的 0.025 和 0.975 百分位。EV，空矢量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s002

（蒂夫）

**S3 图。霍普阿布2抑制Prf调解细胞死亡在N.本塔米亚娜在幼叶中并不明显。**

P.注射器效应器霍普A1，霍普AB1，霍普AB2，霍普AB3和霍普AF1在N与Pto/AvrPto短暂共用。本塔米亚娜离开。叶子在渗透5天后被拍到。霍普阿贝2抑制Pto/阿夫尔普托在N。本塔米亚纳在叶 5 （老叶，左），但不是在叶 3 （年轻叶，右）定义[39]。照片代表 3 个技术重复。EV，空矢量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s003

（蒂夫）

S4 图。AVRcap1b 和 SS15 抑制由自动激活 NRC2 调解的细胞死亡活动H480R和 Nrc3D480V，但不是 Nrc4D478V突变体。

（A/F）叶板：代表N的照片。本塔米亚娜叶显示 Hr 后，共同表达自身免疫 Nrc2H480R， NRC3D480V，和 Nrc4D478V突变体，指示叶板的左边，有EV，AVRcap1b，PITG_15278，HopAB2，SS10，SS15，或SS34（标记在叶子上）（S4数据）。中间面板：HR 在农用渗透后 5 天得分，使用修改后的 0/7 刻度（Segretin 及其同事），并在农用渗透后 5 天拍摄。HR 结果以点图形式呈现，每个点的大小与每个生物复制中得分相同（计数）的样本数成正比。每个效果器都由不同的点颜色表示（参见图的右侧键）。实验分别进行了3次、6次技术复制。每个测试效果器的列对应于来自不同生物复制的结果。正确的面板：统计分析是使用 Besthr R 库进行的（麦克莱恩，2019 年）。点表示排名数据及其相应的手段（虚线），每个点的大小与每个特定值的观测数成正比（每个面板下方的键计数）。右侧的面板显示 1，000 引导样本排名的分布，其中曲线下方的蓝色区域表示分布的 0.025 和 0.975 百分位。如果给定条件的排名平均值在 EV 控制的平均分布的蓝色百分位内或超过蓝色百分比，则差异被认为是显著的。条件之间的显著差异用星号（*）表示。EV，空矢量;人力资源，反应过度敏感。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s004

（蒂夫）

S5 图。与自动NRC2共同表达的AVRcap1b和SS15细胞死亡抑制检测的统计分析H480R， NRC3D480V，和 Nrc4D478V.

统计分析是使用最佳R库（麦克莱恩，2019年）（S5数据）进行的。每个面板对应来自（A、D） NRC2 的结果H480R，（B， E） NRC3D480V，或（C， F） Nrc4D478V（上图所示），与EV（蓝色）、AVRcap1b（绿色）或SS15（橙色）共同表达，其中EV被用作负控制（在地块下标记）。左面板表示排名数据（点）及其相应的手段（虚线），每个点的大小与每个特定值的观测数成正比（每个面板下面计算键）。右侧的面板显示 1，000 引导样本排名的分布，其中曲线下方的蓝色区域表示分布的 0.025 和 0.975 百分位。如果给定条件的排名平均值在 EV 控制的平均分布的蓝色百分位内或超过蓝色百分比，则差异被认为是显著的。EV，空矢量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s005

（蒂夫）

S6 图。AVRcap1b 或 SS15 抑制 NRC2/3 依赖传感器 NLR 的统计分析。

统计分析是使用最佳R库（麦克莱恩，2019年）（S6数据）进行的。（A/D）在每个面板中，来自一系列不同传感器 NLR（下图所示）的结果与 EV（蓝色）、AVRcap1b（绿色）或 SS15（橙色）共同表达，其中 EV 用作负控（见右侧的键）。面板（A）和（C）表示排名数据（点）及其相应的方法（虚线），每个点的大小与每个特定值的观测次数成正比（指左侧的计数键）。面板（B）和（D）显示 1，000 引导样本排名值的分布，其中曲线下方的蓝色区域表示分布的 0.025 和 0.975 百分位。如果给定情况的排名平均值在每次治疗的 EV 控制平均分布的蓝色百分位内或超过蓝色百分比，则差异被认为是显著的。EV，空矢量;NLR，核苷酸结合域和富含白细胞素的重复。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s006

（蒂夫）

S7 图。统计分析表明，AVRcap1b和SS15抑制了NRC4沉默的Rx转基因N中Rx介质细胞死亡。***本塔米亚纳*植物。医学论文发表-**

统计分析是使用最佳R库（麦克莱恩，2019年）（S7数据）进行的。（A/F）每个面板代表不同的沉默处理（上图所示）。左图表示排名数据（点）及其相应的方法（虚线），每个点的大小与每个特定值的观测数成正比（指每个面板下方的计数键）。正确的图显示了 1，000 引导样本排名的分布，其中曲线下方的蓝色区域说明了分布的 0.025 和 0.975 百分位。如果给定条件的排名平均值在 EV 控制平均分布的蓝色百分位内或超过蓝色百分比，则差异被认为是显著的。EV，空矢量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s007

（蒂夫）

S8 图。SS15 将 NRC 蛋白质的 NB-ARC 域结合在酵母中。

SS15 和 AVRcap1b 的 Y2H 检测，具有 NRC2、NRC3 和 NRC4 的 CC 和 NB-ARC 域。酵母生长的控制板在左边（SD-Leu-Trp，ST0048，美国高拉生物），四重奏介质，右侧辅以X-a-gal（SD-Leu-Trp-Ade-His，ST0054，美国高拉生物）。商业酵母结构用作正（pGBKT7-53/pGADT7-T）和负（pGBKT7-Lam/pGADT7-T）控件。选择板中蓝色着色的生长和发展都表明蛋白质与蛋白质的相互作用。SS15 和 AVRcap1b 融合到 GAL4 DNA 绑定域（诱饵），截断的 NRC 融合到 GAL4 激活域（猎物）。每个实验重复3次，结果相似。CC，线圈线圈;NB-ARC，与APAF-1、各种R-蛋白和CED-4共享的核苷酸结合域;NRC，细胞死亡所需的NLR;Y2H，酵母双杂交。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s008

（蒂夫）

S9 图。SS15 和 NRC2、NRC3 和 NRC4 之间的 CoIP 实验。

N-终端 4xHA 标记的 SS15 （SS15）和 SS9 （SS9）分别与融合到 C 端 4xMyc 标签的 NRC 蛋白质进行单次瞬时共用。SS9 被用作负控制。IP 与与抗 Myc （MYC IP）或抗 HA （HA IP）抗体结合的阿加罗斯珠一起执行。总蛋白质提取物在免疫膨胀时，左侧标有适当的抗血清。蛋白质的近似分子量（kDa）显示在右边。鲁比斯科装载控制使用 CBB 染色进行。这个实验是2个独立复制的代表。CBB，库马西亮蓝色：共同免疫沉淀;IP，免疫沉淀。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s009

（蒂夫）

S10 图。SS15 与植物中的 NRC2、NRC3 和 NRC4 p 循环突变体有关联。

（A） N-终端4xHA标记的SS15在N中暂时共用。本塔米亚纳与 C 终端 4xmyc 标记 Nrc2， Nrc4， Nrc2K188R， NRC3K191R，和 Nrc4K190R.IP 是与与抗 Myc （Myc IP）抗体结合的阿加罗斯珠进行的。CoIP 获得的蛋白质提取物（输入）和蛋白质总在免疫膨胀时右侧贴有适当的抗血清。蛋白质的近似分子量（kDa）显示在右边。鲁比斯科装载控制使用 CBB 染色进行。此实验代表 3 个独立复制。CBB，库马西亮蓝色：共同免疫沉淀;IP，免疫沉淀。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s010

（蒂夫）

S11 图。通过 IP-MS 确定的 AVRcap1b 目标。

（A）免疫亲和力丰富蛋白质丰度图，根据AVRcap1b和PexRD54鉴定的蛋白质组生成。蛋白质丰度是根据3个复制物中每个效应器确定的总平均光谱计数计算的。日志2计算了 AVRcap1b 的平均计数比率除以 PexRD54 的平均计数。然后，所有确定的261种蛋白质从最高比例排序到最低比例，并按此顺序绘制（详情请参阅S14 表）。比例最高的蛋白质对应于最有可能的AVRcap1b（蓝色）特异性相互作用物。最有可能与 PexRD54 相对应的蛋白质以绿色标记。在两个效应器中都发现了灰色蛋白质。（B） IP-MS实验中确定的八种假定独特的AVRcap1b蛋白（基于先前提到的平均光谱计数比率）。在使用 AVRcap1b 的 3 个独立复制品中，每个复制项中获得的独特光谱计数都包含在右侧。IP-MS，免疫沉淀-质量测量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s011

（蒂夫）

S12 图。来自N的托尔蛋白的最大可能性的基因树。本塔米亚娜和A.塔利亚娜.

蛋白质序列使用欧米茄。ENTH 和 GAT 域用于进一步分析。苯遗传树采用JTT替代模型和1000次启动迭代，在MEGAX中建造。引导支持高于 80 的分支用红点表示。NbTOL9a 由 2 个红色星号表示。比例条表示每个位点氨基酸替代的进化距离。琼斯·泰勒·桑顿;托尔， Myb 1 样蛋白质的目标。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s012

（蒂夫）

**S13 图。RNAi：：NbTOL9a沉默构造有效地降低了NbTOL9a的蛋白质积累水平。**

WT NbTOL9a （NbTOL9a：6HA）和合成版本（辛布托利9a：6xHA）与 RNAi 暂时共同表达：：GUS或 RNAI：NbTOL9a.SYNNBTOL9a：：6xHA被用作一种控制，不是针对击倒的RNAi：：NbTOL9a。总蛋白质提取物被免疫膨胀与HA抗血清。蛋白质的近似分子量（kDa）显示在右边。鲁比斯科装载控制是使用皮尔斯染色进行的。WT ，野生类型。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s013

（蒂夫）

S14 图。统计分析显示 Nbtol9a 的沉默增强细胞死亡由 Nrc2 调解H480R和 Nrc3D480V但不是扎 Zar1D481V或 Nrc4D478V.

统计分析是使用最佳R库（麦克莱恩，2019年）（S10数据）进行的。每个面板都表示A的日益协调。图梅法西斯表达 Nrc3D480V和 Nrc4D478V（OD600= 0.1、0.25 或 0.5）。（A） NRC2H480R，（B） NRC3D480V，（C） NRC4D478V，和（D）扎 1D481V.左侧大多数面板表示排名数据（点）及其相应的方法（虚线），每个点的大小与每个特定值的观测数成正比（指数字的计数图底）。右面板显示 1，000 引导样本排名值的分布，其中曲线下方的蓝色区域表示分布的 0.025 和 0.975 百分比。如果 RNAi 的排名平均值：NbTOL9a（紫色）属于或超过 RNAi 平均分布的蓝色百分比，则差异被认为显著：：每个治疗组合的GUS（蓝色）。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s014

（蒂夫）

S15 图。由自动激活 NRC3 调解的人力资源统计分析D480V，但不是 Mek2DD或 Nrc4D478V，当 Nbtol9a 表达过度时，减少。

统计分析是使用最佳R库（麦克莱恩，2019年）（S11数据）进行的。对于（A） MEK2DD，（B） NRC3D480V，和（C） Nrc4D478V，最左边的面板表示排名数据（点）及其相应的方法（虚线），每个点的大小与每个特定值的观测数成正比（指数字的计数图底）。右面板显示 1，000 引导样本排名值的分布，其中曲线下方的蓝色区域表示分布的 0.025 和 0.975 百分比。如果 AVRcap1b （紫色）的排名平均值在每次治疗（MEK2）的平均 EV 控制（蓝色）分布的蓝色百分位内或超过蓝色百分位，则差异被认为是显著的DD， NRC3D480V，和 Nrc4D478V），在EV或NbTOL9a的存在。EV，空矢量;人力资源，反应过度敏感。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s015

（蒂夫）

S16 图。NRC3 的统计分析D480V细胞死亡抑制调解由 Avrcap1b 在 Nbtol9a 沉默。

统计分析是使用最佳R库（麦克莱恩，2019年）（S12数据）进行的。自动激活 NRC3 （NRC3）D480V）与 EV （负控制）或 AVRcap1b （标记在情节底部）共同表达，与 RNAi：：GUS （蓝色）或 RNAi：：Nbtol9a （紫色）沉默治疗。（A）表示排名数据（点）及其相应的手段（虚线），每个点的大小与每个特定值的观测次数成正比（指右侧的计数键）。（B）显示 1，000 引导样本排名的分布，其中曲线下方的蓝色区域表示分布的 0.025 和 0.975 百分位。如果给定条件的排名平均值在相应 RNAi 平均分布的蓝色百分比内或超过蓝色百分比，则差异被认为是显著的：：每个给定治疗（NRC3）中的GUS控制D480V• EV， NRC3D480V• AVRcap1b， NRC4D478V• 电动汽车和 NRC4D478V• AVRcap1b）。EV，空矢量。

https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3001136.s016

（蒂夫）