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医学论文发表-机器学习揭示了对基质僵硬的反应
发布时间:2021-07-29 10:03:55  来源:  【 】   浏览:

医学论文发表-机器学习揭示了对基质僵硬的反应的中度乳腺癌细胞适应

· 弗拉达·罗佐娃

· 阿亚德·安威尔

· 安娜·古勒

· 哈米德雷扎·阿布赫尔·埃斯

· 扎赫拉·哈比尔

· 阿纳斯塔西娅·索科洛娃

· 马克西姆·加夫里洛夫

· 埃瓦·高迪,

· 马吉德·易卜拉希米·瓦尔基亚尼

· 让·保罗·蒂埃里

· 安德烈·兹维亚金

· 发布时间: 2021年7月23日

 

抽象

上皮-发感过渡(EMT)及其反向过程,即感性上皮过渡(MET),被认为在促进转移级联方面发挥着关键作用。转移性病变通常表现出与原发性肿瘤相似的上皮状状态,特别是通过E-cadherin介导的结膜复合物形成癌细胞群。然而,使类似间质的微观金属细胞恢复生长和在目标器官微环境中重新获得上皮表型的因素仍然难以捉摸。在这项研究中,我们利用基于图像的细胞分析和机器学习开发了一个工作流程,以检查单个乳腺癌细胞的形态、上下文和分子状态(MDA-MB-231)。MDA-MB-231对宿主器官微环境的异质反应由可控刚度的基板建模,其刚度从0.2kPa(软组织)到64kPa(骨组织)不等。我们确定了3种不同的形态细胞类型(形态),从紧凑的圆形到扁平的不规则形状的细胞,分别主要填充2-kPa和>16kPa基材。这些观察伴随着电子卡德林和维门汀表达的重大变化。此外,我们证明,骨模仿基板(64kPa)诱导多细胞簇形成,并伴有E-卡德林细胞表面定位。MDA-MB-231细胞通过形态适应、增殖率和细胞球体标记的变化以及骨模仿基板上的群集形成,对不同的基板刚度做出反应。我们的结果表明,最僵硬的微环境可以诱导MET。

作者摘要

上皮-间质过渡(EMT),上皮细胞失去细胞极性和细胞细胞粘附性,获得迁移和侵入性特性,成为间质细胞的过程,被认为是转移级联启动的关键作用。在遥远的器官中生存、转化和建立殖民地的中性细胞的能力是众所周知的,但并不被人们所熟知。为了深入了解这个过程,我们开发了一个工作流程,利用机器学习和细胞图像分析来检查单个(三重阴性)乳腺癌细胞的形态(或物理形态和结构)和生化特性如何因它们与可变刚度的基材的相互作用而变化。我们发现,间质乳腺癌细胞通过形态适应、增殖率变化和细胞细胞粘附蛋白E-cadherin等细胞细胞标记物对不同的基质刚度做出反应。令人惊讶的是,模拟骨骼刚度的最僵硬的测试基板上的细胞特性发生了巨大变化——它们形成了多细胞簇,在细胞粘附表面具有明显的E-cadherin定位。我们的结果表明,最僵硬的微环境可以诱导细胞从间质向上皮细胞表型过渡。医学论文发表-

引文:罗佐娃 VS, 安韦尔股份公司, 古勒 AE, Es HA, 哈比尔 Z, 索科洛娃 AI 等 (2021) 机器学习揭示了机械性乳腺癌细胞适应矩阵僵硬。PLoS 计算生物 17 (7): e1009193.https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193

编辑:尼尔·戈夫,以色列魏茨曼科学研究所

收到:2020年12月17日:接受:2021年6月17日:已发布:2021年7月23日

版权所有:2021年©罗佐娃等人。这是一个开放访问文章,根据《知识共享归属许可证》的条款分发,允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制,前提是原始作者和来源得到记分。

数据可用性:所有共焦显微镜文件均可从生物研究数据库(https://www.ebi.ac.uk/biostudies/)提供,加入编号为S-BIAD161。

资金:这项研究得到了俄罗斯联邦教育和科学部(minobrnauki.gov.ru)的支持,A.V.Z.收到了第075-15-15-192号赠款。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或编写手稿方面没有作用。

竞争利益:作者宣称不存在相互竞争的利益。

介绍

乳腺癌是女性最常见的癌症之一,2018年诊断出超过200万例新发病例[1],主要扩散到肝脏、骨骼、肺部和大脑[2]。大约15%的侵入性乳腺癌被归类为三重阴性乳腺癌(TNBC),其特征是缺乏雌激素和黄体酮受体和HER2放大。TNBC对目前的内分泌和其他靶向疗法没有反应,这些疗法将治疗方案限制在手术、化疗和放疗[3]。研究表明,与其他类型的乳腺癌[4]和更短的复发后存活率[5]相比,TNBC患者在头五年内复发和远期复发的概率更高。因此,了解TNBC转移的基本机制对于改善治疗结果至关重要。

与TNBC转移相关的可行假设之一与有机转移有关,起源于佩奇的"种子和土壤"假说[6,7]。它指出,某些癌症类型喜欢生长在某些器官的方式,不能解释的循环模式单独。事实上,大量证据表明,转移事件受到许多因素的调节,包括肿瘤内在特性、宿主器官微环境的特定特征及其相互作用[8]。在TNBC相关的细胞系中,MDA-MB-231被公认为一种高度中度侵入性细胞表型。值得注意的是,与TNBC的一般人群不同,MDA-MB-231在接种到免疫缺陷小鼠的血液[9]时,有在体内形成骨质疏松骨转移的倾向。

人们认识到,促进癌细胞转移进展的关键过程之一是上皮-发痒过渡(EMT)。在此过程中,细胞间结复合物的逐渐丧失在极化上皮细胞中启动,同时通过改造作用微滤网、较弱的细胞间粘附和许多其他间质标记[10-12]获得间质表型。因此,EMT 触发癌细胞从原发性肿瘤分离,通过周围的频闪入侵,侵入淋巴或血管,并传播到遥远的身体部位。

尽管其致命影响,转移是一个效率极低的过程[13]。在从血液中蒸发和从遥远器官的帕奇马渗透之后,传播的肿瘤细胞,无论是单独的还是在群落中,都暴露在一个陌生的微环境中,其特征是结构和分子成分截然不同。因此,我们理解癌症转移的一个关键差距在于传播肿瘤细胞与宿主器官微环境的初始相互作用及其成功成长为微金属。

具有激活EMT程序的癌细胞可以通过感官上皮过渡(MET)恢复上皮表型,允许它们在到达次要地点的目的地后建立新的菌落。原发性肿瘤和宿主器官微环境的细胞和非细胞成分在转移过程的每一步的启动和进展中起着至关重要的作用,包括EMT[12、14、15]和MET[16-18]。在非细胞成分中,细胞外基质(ECM)的特性,包括刚度、结构和组成,通过机械转移的调节[19,20]对癌细胞的可塑性有显著影响。最近的一些研究已经认识到,ECM的刚度是促成在各类癌症中促进EMT的关键机械因素之一[21-24]。

尽管进行了大量研究,EMT-MET假说未能解释癌细胞对二级器官的殖民化,这些细胞准不能参与MET。显示明显中枢表型的MDA-MB-231细胞系已被证明在体内[25]形成转移性病变。我们发现,全器官去细胞化肝脚手架中的MDA-MB-231殖民模式在松散的帕奇马尔(年轻的模块化,~2 kPa)和更密集的(年轻的模块化,>2 kPa)频闪脚手架隔间[26]之间差别很大,其中细胞形态是殖民模式的歧视者之一。细胞迅速渗透到乳腺组织中,其占主导地位的形态特征被确定为小圆形细胞,而主轴形的大脚印细胞在频闪隔间中很普遍。此外,还观察到了在频闪基板上聚集MDA-MB-231细胞的耐人寻味的倾向。医学论文发表-

在这项研究中,我们研究了癌细胞对与生理相关刚度水平形成的基质的异质反应。我们特意选择了本质上是中度MDA-MB-231细胞表型来研究细胞通过MET改变表型的微米化形成机制。

最近已经表明,癌细胞形态与肿瘤和转移潜力在体内相关,提供一个容易测量的数量[27]。因此,我们使用形态分析作为替代终点来测量僵硬对TNBC细胞行为的影响。我们利用免疫细胞化学研究了生化特征与形态特征的耦合,并考察了细胞聚集机制,这可能是形成微金属酶的关键过程。

分析和解释大型生物数据集的先进方法(包括从光电池图像中提取的单细胞测量)的快速进展,为单个细胞的物理和分子状态提供了有意义且经常出人意料的见解。与现有的基于人口的剖析[28,29]相比,这些方法允许捕获细胞异质性。根据最近的出版物,在我们的研究中,我们旨在通过采用单细胞分辨率技术[27,30]来展示一种更数据驱动的方法。事实上,机器学习算法能够编译大量的参数,并提取不同因素之间的关系,以捕捉肉眼看不见的模式。

在这项研究中,我们报告了单细胞水平上不同刚度基板的细胞适应性评估。使用基于多参数图像的细胞分析[31],然后应用机器学习技术,我们确定了具有不同形态细胞类型(形态)的亚种群,并演示了刚度与主流形态之间的关系。此外,我们还分析了几个生物标志物的表达水平,这些生物标志物通常与上皮和感性表型相关,以揭示基质刚度所中介的潜在分子变化。综合起来,我们的结果表明,较软的微环境,特别是在2kPa刚度水平,促进MDA-MB-231细胞更具侵略性的变形。耐人寻味的是,基质与骨组织相对应的64 kPa的刚度,促进了E-cadherin诱导明显细胞聚集的表达。

结果

细胞粘附到细胞外基质组件

在我们的研究中,我们使用具有代表性的人类TNBC细胞系MDA-MB-231来研究形态和分子变化,以响应基质刚度。首先,为了解开 ECM 的化学介质效应,我们探索了底层基板的生化成分如何影响细胞粘附。我们同时测试了总共36种条件,包括9种最常见的ECM蛋白,这些蛋白质采用不同的浓度和组合(参见材料和方法)。每个条件在印在水凝胶表面的 9 个点中复制,幻灯片其余部分的无污物确保特定的细胞附件。作为细胞粘附的代理,我们计算播种后 24 小时连接到每个点的细胞数量(S1 文本中的表 B 和图 B)。胶原蛋白1,6,纤维素和异构素似乎促进细胞粘附,而粘附胶原蛋白3,4,5,层压素和特罗波埃拉斯汀是非常小的(表B在S1文本)。进行了相关分析,以确定对于任何 ECM 蛋白质,其浓度与附着的 MDA-MB-231 细胞数量之间是否存在任何关联。图1A表明胶原蛋白I和纤维素浓度与附着细胞数量的相关性最高。相反,胶原蛋白 III 型、IV 型、V 型和特罗波拉斯汀的浓度较高,与附着细胞数量减少有关。因此,我们选择了胶原蛋白I型进行进一步调查。

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图1。ECM蛋白涂层的选择和实验设计。

(a) 热图显示 Pearson 的相关系数值,该系数测量 ECM 蛋白质浓度与所附细胞数量之间的关联。(b) 本研究中调查的基板刚度值。(c) 在设计实验中,MDA-MB-231细胞被播种在涂有胶原蛋白I型的不同刚度的硅胶基板上。 之后,细胞被培养为24小时,固定,染色为感兴趣的生物标志物,并使用共聚焦显微镜成像。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.g001

基于多参数的基于图像的细胞分析

对TNBC细胞僵硬引起的形态和分子变化的评估分几个步骤进行。首先,TNBC细胞在基材上培养,有5个弹性模组,从0.2 kPa到64kPa(图1B)不等。常规使用的组织培养板通常具有2-4 GPa的刚度,比人体中的组织(32,33)硬化多倍。另一方面,硅插入允许模仿生理相关条件。我们选择的刚度值是由器官和组织的刚性特征决定的,癌细胞在传播后就位于这些器官和组织中[32,34]。放置在井底的生物相容硅基板在细胞播种前涂上胶原蛋白I型,如图1C示意图所示。在同等密度下播种的TNBC细胞被培养了24小时,然后进行固定和免疫染色。

为了量化单细胞水平的刚度效应,我们采用了多参数图像分析,并结合统计分析和机器学习技术的应用。数据分析工作流程的关键步骤显示在图 2A 中。为了可视化细胞膜和细胞核,并评估每个细胞中生物标志物的表达,细胞被专门用荧光染料免疫,并使用共聚焦显微镜进行成像。我们平均划分了5个板,并染色了一半用于葡萄干素和泛细胞素,另一半用于E-cadherin,这使我们能够将每口油井的氟磷数量限制在4个,并避免信号重叠(参见材料和方法)。

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图 2.生成单细胞配置文件和数据分析工作流。

(a) 说明基于图像的单元分析和数据分析工作流程的关键步骤的流程图。(b) 图像分割过程的原理图表示:细胞被贴上WGA和DAPI的标签,以可视化细胞质和细胞核。提取的细胞轮廓用于量化每个细胞内的电子卡德林、维他汀或细胞克拉特因的强度。(c) 每个单元格计算的测量图示:荧光信号的几何参数、强度和纹理,以及上下文的测量。(d) 最后数据集摘要。左列指示每个刚度级别捕获的单元格比例。计算了细胞的形态和上下文特征(左):此外,还测量了荧光生物标志物信号的强度和质地(右图)。热图的每一行对应于一个单元格,每个列表示单个功能。Z-分数规范化应用于每个功能,以便无论规模如何,都允许直接比较。右列表示 z 得分值。医学论文发表-

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.g002

图像分割用于勾勒细胞和细胞核,并使用提取的边界来量化每个细胞内来自E-cadherin或维他汀和细胞克制素的荧光信号强度,并获取各种几何和上下文测量(图2B和2C,图A和B在S2文本中)。图 2D提供了最终数据集的全面摘要。对于910个细胞中的每一个,我们计算了150个描述细胞形态和背景的特征(图2D,左图)。其中包括细胞和核形状描述符,如面积、圆形和核细胞质比(NCR):测量形状不规则,如坚固性和紧凑性;以细胞中心与其细胞核之间的距离计算的细胞极性测量:和上下文测量,如相邻单元的数量和共享边界的比例。经目视检查,一些在最刚性条件下培养的细胞似乎形成多细胞群(84个细胞),因此被排除在主数据集中(826个细胞仍然存在)之外,并单独考虑。

刚度对TNBC细胞密度和形态的影响

我们首先试图评估细胞密度与基板刚度的差异。获得低倍率的图像,以捕捉位于每口井中心区域的细胞染色质的荧光信号(S2文本中的图 C)。细胞最初以同等密度播种,培养24小时,然后固定。我们观察到2和16 kPa的细胞密度显著提高,表明这些刚度水平对细胞附着或增殖或两者(图3A)都有积极影响。

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图 3.TNBC 细胞对基板刚度的明显适应。

(a) 细胞密度与基线(虚线)相比增加,因为细胞在具有不同刚度值的基材上培养了 24 小时,n = 4 复制每个刚度值。(b) 分析按基板刚度调节的前 10 个参数之间的关联。大多数测量是相关的,因此彼此高度相关。(c) 由于基板刚度,NCR、细胞周长、面积、最小直径、圆形和距离到最近细胞的分布发生变化。使用盒绘图报告分布:一个框显示中值,第一和第三夸脱,胡须表示中位数 +/-1.5 * IQR。韦尔奇的 t 测试评估差异的意义 ("***": p < 0.001, "**": p < 0.01, "*": p < 0.05), n = 细胞数量, 见S2 文本中的表 A 。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.g003

接下来,我们分析了描述单个细胞形态及其与周围细胞关系的150个特征。基板刚度的效果立即从平均分析(S3文本中的图A) 中显现出来:然而,进一步采用单一的基于细胞的方法来利用TNBC细胞群的内在异质性。斯皮尔曼排名相关系数分析(rs)揭示了与基板刚度值相关的几个细胞特征(S3文本中的图 B)。由于斯皮尔曼的相关性对非单调关系不强,我们使用另外两种方法(参见材料和方法,S3 文本中的表 A)验证了这些结果。显示与基板刚度最强相关性的前 10 个参数列表在S3 Text中的表 B 中以及功能描述中给出。虽然没有一个参数显示与基板刚度有很强的联系,但所有三种方法都表明存在某种依赖性。

需要注意的是,其中一些测量结果并非相互独立,从图 3B中显示的相关矩阵可以看出,例如,细胞区域的增加自然导致其周长的扩展。刚度对NCR、细胞周界、面积、最小直径、圆形和距离最近细胞的价值分布的影响在S3文本中的图3C和图C中得到了证明。选择这些变量是因为它们提供了有关系统的补充信息(对|rs|< 0.8)。值得注意的是,在组织病理学中常用的NCR作为恶性肿瘤的预测器[35]被发现具有最高的绝对相关系数(|rs|=0.31)。本地最大值可在 2 kPa 中看到,其中细胞显示范围更广的 NCR 值,中位数更高。相反,观察到最小的NCR值为32 kPa,呈向最坚硬基板(64 kPa)倾斜的积极趋势。

矩阵僵硬改变 TNBC 细胞变形之间的平衡

由于分析的TNBC细胞表现出连续的形态状态,对不同细胞形态的识别变得复杂起来。包括主要组件分析 (PCA) 在内的尺寸减少技术没有显示细胞群中一系列密切相关的变形(S4 文本中的图 A)。但是,一种称为分层聚类 (HC) 的无人监督的机器学习算法允许根据数据点(此处是单个单元)根据其个人资料相似性将其分组到组(此处为单元格变形)。因此,我们确定了三个细胞的亚种群,这些细胞显示出与不同的细胞形态有关的形态。我们的分析得到了两个集群有效性指数(剪影评分和戴维斯-布尔丁指数)的支持,该指数旨在选择数据集中的集数(S4 文本中的图 B)。图 4A演示了将 HC 应用于包含形态和上下文测量的单细胞剖面的结果。为了测量细胞的外观,我们通过计算每个组的模组(图4B)来识别每个组的代表性对象。medoid 定义为与群集中其他对象的平均距离最小的数据点;因此,它在概念上类似于一个中心,但仅限于集群的成员。医学论文发表-

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图4。使用机器学习识别细胞变形。

(a) HC的结果应用于826个细胞,其依据是由150个形态和上下文特征组成的单细胞特征之间的相似性。左柱表示在细胞总数中识别出的三个细胞变形(绿色、蓝色和红色)。热图的每一行对应于一个单元格,每个列表示单个功能。底部描绘了特征的子组。(b) 三个已确定的细胞组中每个细胞组的代表对象(类人)。(c) 按它们对群集分离的贡献排名前六位的特征。使用框图报告值的分布:一个框显示中值,第一和第三夸脱,胡须表示中位数 +/-1.5 * IQR。韦尔奇的 t 测试评估差异的重要性 ("***": p < 0.001)。(d) 预测前两台 PC 上的数据,以及识别的细胞变形的可视化。"×"标记表示这些群体的中心。(e) 每个细胞的比例在刚度值之间变化。条形图表示平均比例,错误条表示 95% 的置信间隔,该值通过图像分组单元来计算。插图显示每个集群中的单元总数。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.g004

然后,我们评估了每个功能对集群可分离性的贡献。所有刚度级别的六个最重要的特征是紧凑度、偏心度、圆形、周长、细胞质圆形和区域(图 4C、图 C 和S4 文本中的 D)。紧凑度描述了膜的凹度,偏心与细胞的拉长有关,圆形测量与完美圆的相似性。三个细胞形态(p < 0.001)之间的周界和区域之间的这些特征显著不同。前两个主要组件 (PC) 数据的投影说明了星团间空间关系 (图 4D)。这些结果以及图5中描述的代表性示例表明,细胞变形1、2和3的外貌明显不同,主要表现为具有跛脚细胞、大扁平细胞和紧凑圆球的不规则形状细胞。

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图 5.细胞形态的可视化。

细胞在不同刚度水平上培养的具有代表性的图像,与三个细胞形态相对应,由聚类算法确定。下排提供了 RF 分类器分类为三个细胞变形之一的 Clumped 细胞的例子。细胞膜使用 WGA 染色可视化。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.g005

有趣的是,我们观察到细胞群在基板刚度值(图4E)中的细胞形态组成存在相当大的变化。值得注意的是,所有细胞形态在 2kPa– 变形 1 和 2(绿色和红色)显示局部极端值,而变形 3(蓝色)显示局部最大值。小圆细胞(变形3;蓝色)在2 kPa中盛行,在较硬的基材上,细胞主要被归类为变形1和2,即更硬的基板促进细胞的扩散和拉长,突出地表达拉米利波迪亚(c.f. Fig 5)。请注意,细胞形态依赖与基板刚度在 64 kPa 中下降 - 变形 3 细胞群与基板刚度相比的预期趋势发生逆转,而变形 1 和 2 细胞群的预期增长则无法保持。值得一提的是,图3A中描述的细胞密度似乎并没有影响细胞形态,从细胞邻居数量和共享边界的分数(S4文本中的图E)的分布可以看出这一点。在评估每个特征对集群可分离性的贡献时,我们发现这些参数并不重要,相互信息分别为 0.06 和 0.05。综合这些结果,表明对矩阵刚度的异质反应表明形态和细胞群在2 kPa的组成有显著变化,并表明TNBC细胞具有较高的形态适应性。

生物标志物的表达是僵硬依赖

为了证实我们的观察结果,我们评估了基质刚度在报告单细胞水平细胞细胞和细胞粘附的关键生物标志物表达方面的作用。如前所述,在图2D中,大约一半的细胞群用于评估E-cadherin(图2D,右下角)的表达,而另一半同时染色为葡萄干和细胞素(图2D,右上)。

图 6A表示整个基板刚度值中 E-卡德林的平均表达水平发生变化。两个本地最大,在2kPa和64 kPa,显然是可观察到的。MDA-MB-231细胞也显示出在2kPa(图6B)下维他汀表达的峰值。同时,细胞克制素的平均荧光强度逐渐增加,为16-64 kPa(图6C)。我们还计算了细胞克林与维他汀 (CVR) 的表达比例,并检查了其在刚度值 (图 6D)中的分布情况,观察了至少为 2 kPa 的非线性趋势。值得注意的是,与最柔软的基板(0.2 kPa)相比,2 kPa(因此CVR)的E-卡德林和维门汀的表达存在显著差异,表明TNBC细胞对矩阵刚度的微小变化也非常敏感。此外,为了研究分子分布的变异性,以响应基质刚度,我们在描述E-卡德林、维他林和细胞素(S5文本中的图A)的全套特征上执行了PCA。虽然无法观察到明显分离的组,但硬度值为 2.0 kPa 和 32.0 kPa 的基板培养的细胞似乎位于星团的对立面,符合图 6中的趋势。医学论文发表-

· 原始图像

图6。与上皮和发音表型相关的生物标志物表达的变化。

(a-c)来自电子卡德林、维门汀和细胞素的平均荧光信号分别跨越不同刚度的基材。(d) 根据所有刚度值计算细胞素的荧光强度与葡萄干(CVR)的比率。因为 (a-d) 值是均值,错误条表示标准偏差。橙色线显示平均值,波段表示 95% 置信间隔。韦尔奇的 t 测试评估差异的意义 ("***": p < 0.001, "**": p < 0.01, "*": p < 0.05), n = 细胞数量, 见S2 文本中的表 A 。(e) Box 绘制了比较来自属于三个细胞形态的细胞中来自 E-卡德林、细胞克林和维门汀的平均荧光信号的图纸。从最右侧的情节可以看出,三个单元格变形之间的 CVR 似乎没有区别。使用框图报告值的分布:一个框显示中值,第一和第三夸脱,胡须表示中位数 +/-1.5 * IQR。韦尔奇的 t 测试评估差异的重要性 ("***": p < 0.001, "**": p < 0.01, "*:p < 0.05)。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.g006

我们的下一个目标是将已识别的细胞变形与生物标志物的表达水平联系起来。鉴于集成荧光信号与细胞区域成正比,并且发现细胞区域是区分星团的关键特征之一,我们再次检查了按细胞区域正常化的荧光信号("平均强度")。值得注意的是,小圆细胞(变形3:蓝色)中E-卡德林的平均强度明显高于其对应细胞(图6E)。与我们的预期相反,在维他汀或CVR中,三个细胞形态之间没有区别,如图6E所见。总体而言,这些结果证实了MDA-MB-231细胞对基质刚度的高灵敏度。E-卡德林和维门汀(以及 CVR 中的最低值)在 2 kPa 的增加表明在这些基材培养的 MDA-MB-231 细胞中可能发生事件。

刚性基板促进细胞簇的形成

在最刚性的基材上观察到多细胞聚类的明显趋势。与其他单个细胞生长的刚度水平不同,在64 kPa培养的细胞中,大约一半似乎形成紧密的细胞簇,表明基质的刚度可能是一个促进因素。图 7A中显示了单个细胞和聚类细胞的代表图像(另称为"单"和"Clumped")。从上述分析中排除了被挤出的细胞,并单独检查(S6文本中的图A)。对64 kPa培养的单细胞和团块细胞群的比较显示,除了明显的区别(S6文本中的图B)外,由于总细胞面积(图7B)的差异,这两组细胞的NCR值明显不同,而核区域是可比的。

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图 7.在 64 kPa 中培养的单个细胞和聚类细胞的比较。

(a) 在 64 kPa 培养的个体和团块细胞的示例图像。染有DAPI(蓝色)和WGA-FITC(绿色)的细胞可视化细胞核和细胞质,以及电子卡德林(品红色)。(b) 单细胞和结块细胞之间的主要区别。(c) 细胞形态组成凸起细胞群。(d) 单细胞和结壳细胞中电子卡德林的平均强度和平均边缘强度。测量的示意图插图提供在底部。(e) 位于细胞边缘的总细胞荧光信号的分数。64 kPa 的单细胞和结块细胞分别绘制。(f) TNBC细胞(紫色)在我们的3D肝组织模型的帕伦奇马尔(左)和频闪(右)隔间中显示出截然不同的形态和殖民模式。对于 (b)、(d) 和 (e),值表示均值,错误条表示标准偏差。韦尔奇的 t 测试评估差异的重要性 ("***": p < 0.001, "**": p < 0.01, "*:p < 0.05)。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.g007

随机森林分类模型经过培训,将细胞分类为细胞变形之一(变形 1、2 或 3),并在测试集上进行了验证,得分为 0.98(详情见材料和方法)。该模型接下来用于估计在凸起细胞中形态的分布。从图4D可以得出结论,在64 kPa培养的单细胞中,大多数表现出不规则的形状(变形1:绿色),其中包括具有跛脚突起的相对较大的细胞,经目视检查证实。相反,变形3在细胞群中占普遍(56%)而只有少数细胞假设变形2。

对E-cadherin的荧光信号分布的分析揭示了一种奇特的模式:虽然单细胞中E-cadherin的平均强度较高,但凸起细胞表明细胞表面的E-cadherin的局部化程度增加,表明细胞间粘附(图7D)的容量更强。此外,我们检查了位于细胞边缘的整个细胞荧光信号的一小部分。图 7E演示了所有刚度级别的细胞与单独绘制的单细胞和结块细胞值的比较。单细胞细胞和结块细胞之间可以注意到细胞表面局部电子卡德林的分数的显著差异。此外,在2-kPa基材上培养的细胞也显示出交界E-卡德林的增加。后一种观察再次表明,在2-kPa和64kPa基材培养的细胞之间,细胞行为可能具有共性。医学论文发表-

讨论

众所周知,转移级联的早期步骤是由上皮-感性过渡(EMT)促进的,允许癌细胞分离、迁移和传播。然而,人们对于癌症转移如何从最初将循环肿瘤细胞传播到继发器官以及随后形成转移性病变(13)缺乏了解。先前的研究指出了EMT反向过程的重要性,即转移性生长的中性上皮过渡(MET),尽管这个过程仍然鲜为人知,与EMT的诱导者不同,MET的诱因很少[25]。

E-cadherin是上皮细胞的一种特征,其表达在许多癌症类型中仍然存在,包括原发性肿瘤和转移性肿瘤。此外,E-cadherin结区复合物对于转移过程中发生的几个过程至关重要–集体细胞迁移和高汇合细胞增殖[36]。MDA-MB-231的MB2骨髓热带同源亚线在骨转移中表达E-卡德林, 支持通过在骨血管利基[25]与 E 选择素结合而诱发的 MET 的发生,尽管这些观察指向了 EMT 主转录调节器的"非规范 MET 程序",其RNA 表达方式不变,如蜗牛 1/2、Twist1/2 和 Zeb1/2 建议混合表型[37]。

根据这一新证据,我们选择了以高中性指数[38]为特征的细胞系MDA-MB-231。MDA-MB-231细胞具有攻击性,耐治疗的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞本质上是发热细胞,因为上皮生物标志物E-cadherin表达被E-cadherin促进剂的甲基化压抑。我们测试了一组生理相关的刚度水平,从非常柔软(0.2 kPa)到高度刚性(64 kPa),并检查了MDA-MB-231细胞群的异质反应。体内循环肿瘤细胞通过先心周利基(2 kPa)居住一段时间进入骨髓,在那里它们部分恢复上皮特征。他们后来进入骨基质(64 kPa),并成为骨解,同时转向上皮状表型。

我们可以根据上述最近的意见,就我们的结果提出若干评论。首先,我们对MDA-MB-231细胞粘附于ECM不同成分的研究表明,这些细胞的偏好和抑制粘附性存在显著差异,其中胶原蛋白类型1显示出最大的粘附。诱导更强粘附的 ECM 组件可能有助于组织中的细胞阻塞,而与细胞附件减少相关的组件可促进细胞迁移。

其次,我们注意到细胞密度最高,为2和16 kPa,涉及最高的增殖与凋亡比、细胞粘附或两者兼有。细胞密度和细胞形态之间可能存在因果关系,例如,特定的细胞形态可能具有较高的增殖与凋亡比。相反,更高的细胞密度可能导致更小的更圆的细胞。虽然我们不能排除这种依赖,但我们的结果几乎没有支持这种可能性。

第三,通过评估单个细胞的特征,我们表明MDA-MB-231细胞在显示一个连续体形态的同时,可能与三种不同的形态类型(称为细胞形态)有关。机器学习技术允许根据三个子种群的几何和上下文参数来识别它们,并通过提取关键区分参数来描述每个变形。虽然可以通过改变凹陷(图4A)中的截止(图4A)产生更精细的分区,但在高级别细胞组中,则可以生成到已识别的三个亚种群。综合起来,我们的结果表明,变形1对应于具有各种不规则和跛脚突起的细胞,变形2由大扁平细胞组成,变形3以小紧凑的圆形细胞为代表。值得注意的是,在他们最近发表的研究中,Devaraj和Bose报告了MDA-MB-468细胞的类似形态状态[39]。

需要注意的是,在基板刚度值中,显示的明显形态特征显得高度可变。这涉及到细胞通过重塑其基质粘附和细胞骨质来响应基质刚度变化。值得注意的是,已识别的变形之间的比率随着基板刚度的非线性方式增加而变化。具体来说,变形 3 占主导地位为 2 kPa,但在较高的刚度值下存在明显较少。有趣的是,在最近的一项理论研究中,作者表明细胞过渡到三个细胞形态之一:弱粘附(类似于变形3),拉长多个突起(变形1),或新月状(变形2),这取决于细胞基质粘附的强度[40]。

值得注意的是,富含细胞的单细胞克隆显示的细胞形状与变形1相类似,没有表现出很高的转移潜力[27]。两种变形1和2都显示更坚硬的基材上的细胞数量增加。据报道,单个MDA-MB-231细胞的形态特征已经持续了几个星期。具有相同形态类型的单细胞克隆在体内行为模式中表现出相似的特征,包括肿瘤原性、循环生存和转移潜力[27]。在细胞功能方面,主要与变形2相对应的扁平细胞预计将与基板产生强相互作用,并且由于存在大的稳定焦粘附物[41]而可能是自焚的。同时,变形1显示的突出的跛脚足是细胞功能的标志。最后,变形3可能表现出阿米贝类运动,但是,需要视频显微镜来证实这一假设。

此外,我们评估了报告细胞细胞和细胞间粘附的三个生物标志物的表达水平的变化,旨在调查这些变化与细胞形态之间的联系。虽然细胞克林的表达被发现随着刚度逐渐增加,但维门汀的强度在较软的刚度值下表现出非线性关系峰值。有趣的是,我们还观察到E-cadherin的局部最大值,以及2 kPa的葡萄干表达峰值——这种僵硬对于肝和肺等帕伦奇型组织来说是典型的。机械解释表明,符合要求的基质排除了广泛分布的细胞-基质结的形成,使细胞缩回一个小的圆形足迹。这妨碍了细胞的活力,并导致维门汀的向上调节,以恢复这种特性典型的间质细胞。

最僵硬的基板 (64 kPa) 典型的骨组织诱导 TNBC 细胞行为的巨大变化。我们观察到MDA-MB-231细胞的亚群,这些细胞形成了多细胞群("团团")。与在同一基材上培养的单个细胞("单细胞")相比,这些细胞在E-cadherin的形态和表达上似乎都有明显的差异。值得注意的是,与单细胞中普遍存在的大不规则足迹相反,凸起的细胞大多表现出小圆形态。与整体细胞群相比,在64 kPa基质培养的单细胞中的E-卡德林表达显著较大,而在Clumped细胞中,其表达率相对较低。然而,在凸起的细胞中,电子卡德林的定位向细胞表面发生了相当大的变化。以前,由于细胞-细胞-卡德林介质接触的成熟[42],在E-cadherin信号定位方面也观察到了类似的趋势。此外,已经表明,随着细胞粘附的增加,细胞变小,其特征是跛脚菌形成(43)减少,从而为单细胞和结块细胞之间的形态差异提供了潜在的解释。医学论文发表-

在细胞-细胞交界处,E-cadherin的主要表达方式有利于骨型组织中间质细胞集群形成的僵硬诱导机制。众所周知,E-卡德林的表达改变了细胞形态,减少了MDA-MB-231细胞中类似成纤维细胞的迁移[44]。此外,通过MDA-MB-231[17]中E-卡德林基因表观遗传调控的变化,二级站点的局部微环境可能诱导E-cadherin的再表达。因此,高细胞外基质(ECM)刚度可能是导致细胞聚集的因素之一,如果不是关键因素的话,然后是E-cadherin的重新表达和细胞形态、迁移和侵入行为的变化[45]。然而,虽然器官僵硬可能在骨转移中发挥作用,但它可能不是其他器官(如肝脏、肺和大脑)的一个因素,这些器官通常也由乳腺癌细胞殖民。

这些结果也符合我们先前研究的观察结果,我们调查了 MDA - MB - 231 细胞[ 26 ]对肝和频闪室的殖民化。我们表明,细胞生长和入侵模式,以及它们的形态,严重取决于ECM的刚度。特别是,它发现,在迅速增殖的细胞深到软(2 kPa)帕伦奇马尔组织,一个小球形的形态特征占主导地位(图7F,左)。同时,密集的频闪基板刺激了以拉长和大脚印为特征的形态类型(图7F,右图)。最后,在频闪舱中还专门检测到MDA-MB-231细胞的多细胞和多层星团形成的趋势。

总的来说,我们的工作有助于证实肿瘤微环境对癌细胞形态和分子适应性有显著影响的证据。E-cadherin介质簇形成的细胞行为的戏剧性变化发生在与骨组织相关的最坚硬的基质上,这涉及到一个潜在的新促进剂,用于集群在转移中至关重要的间质细胞[4647]

此外,它解决了种群内部异质性问题,并提出了一个评估单个细胞形态和分子状态的框架。我们相信,只要确保与共聚焦显微镜成像和无支架或基于凝胶的 3D 培养物相容,就可以采用建议的工作流程来分析在各种条件下培养的细胞群,并使用一系列细胞模型。

然而,值得一提的是,本研究中使用的MDA-MB-231细胞系早在很久以前就已建立起来,多年来一直被选入一种非常稳定的高度间质转移表型。将来,我们的目标是调查分化的乳腺癌细胞是否表现出对各种基板刚度类似的反应。使用不同的细胞系和单细胞测序[48,49]观察到对EMT或MET诱导器的可变反应。为了进一步调查这一现象,有必要分析单个细胞衍生的克隆,以确定哪些克隆可以形成群集。此外,在最刚性基板上观察到的多细胞群可能是通过其他球童形成的。需要进一步的实验来验证这些观察结果,这些观察结果与染色为β-卡泰宁的细胞以及F-actin一起显示其在细胞皮层的定位。最后,对公开提供的病理学样本上的机器学习模型的验证可以阐明这项研究的转化潜力,特别是在数字病理学领域。

材料和方法

道德认可和同意参与

这项研究不需要人类或动物伦理学的批准。

分析基板

为了选择最佳的 ECM 蛋白进行涂层,细胞被播种在细胞外基质筛选阵列上,ECM 选择阵列套件 Ultra-36(美国圣地亚哥高级生物矩阵),其中含有水凝胶表面的 36 个 ECM 条件。每个条件是1至4种人类衍生的 ECM 蛋白的组合,总浓度为 250μg/mL。它被复制在9个点,每个点的直径为400μm(图A在S1文本)。使用以下 ECM 蛋白:胶原蛋白 I 、 胶原蛋白 III 、 胶原蛋白 IV 、 胶原蛋白 V 、 胶原蛋白 VI 、 纤维素 、 乳胶素 、 异黄素 、 特罗波拉斯汀(S1 文本中的表 A ) 。阵列已按照制造商的说明进行清洗并准备进行细胞播种。

为了研究刚度的效果,细胞被播种到CytoSoft成像24井板(高级生物矩阵),其中含有每口井底部不同刚度的薄硅层。硅的弹性模组为0.2 kPa、2 kPa、16 kPa、32 kPa和64 kPa。玻璃底24井板(伊比迪,德国格雷费尔芬)用于控制实验,并按照相同的协议处理,除非另有说明。板井涂有人类I型胶原蛋白溶液3毫克/mL,紫外醇(高级生物矩阵)。胶原蛋白在 1 倍 DPBS (15μg/mL) 中稀释,并将 1 mL 的溶液分配到每口井中,以彻底涂覆表面。涂层板在室温下孵化,覆盖1小时。孵化后,涂层表面用 PBS 冲洗两次。

细胞培养

MDA-MB-231(ECACC 92020424)乳腺癌细胞经过亚培养,并保存在杜尔贝科的改良鹰的中等/营养混合物F-12火腿(DMEM/F-12) 的完整培养介质中:西格玛-奥尔德里希)补充10%胎儿牛血清(FBS:西格玛-奥尔德里希,美国森特-路易斯)和1%青霉素-链霉素(PS;吉布科,沃尔瑟姆,美国)。细胞在37°C的潮湿大气中孵育,二氧化碳占5%2.一旦汇合率达到80%,细胞就会通过。细胞用PBS清洗,特里普勒(吉布科)用于细胞分离。在 37°C 下与 TrypLE 一起孵育 5 分钟后,细胞中添加了完整的介质。细胞悬架在500克时离心5分钟。ECM 选择阵列和细胞软板的种子密度为 0.3×105电池/mL 和 0.75×105单元格/mL,分别。然后,样品在染色前孵育24小时。我们在Cytosoft板上进行了一系列测试,以优化显微镜的播种密度。MDA-MB-231细胞的高增长率导致一种共生积累,在过度重叠的情况下,这种聚合性会阻碍细胞的精确分割。这排除了细胞培养在较长的时期。医学论文发表-

染色程序

ECM 选择阵列用 5 mL 暖 1x 汉克的平衡盐解决方案与 Ca 清洗2+和毫克2+(赫布斯:吉布科)。然后,细胞通过在1倍PBS中加入5毫升冷4%的甲醛(PFA)从无甲醇16%甲醛溶液(美国沃尔瑟姆的热费舍尔科学)中制备而成。幻灯片在 4°C 下在 PFA 溶液中留出 5 分钟,在室温下留下 10 分钟,然后用 1 倍 HBSS 再次清洗。为了可视化细胞核,细胞被4,6-二恶英-2-苯丙烯二氢氯化物(DAPI,西格玛-奥尔德里希)染色。幻灯片上覆盖着用于成像的 PBS。

CytoSoft 板中的细胞用 4% PFA 固定,在室温下离开 15 分钟。固定细胞膜被贴上FITC结合WGA(西格玛-奥尔德里希,1:300)的标签,并在HBSS中稀释10分钟,在37°C。 接下来,细胞在室温下在PBS中使用0.2%的Triton渗透15分钟,然后使用1%的牛血清白蛋白(BSA:西格玛-奥尔德里希)在PBS在室温下1小时。每个盘子的一半油井都沾上了电子卡德林,另一半沾染了维他明和细胞素(S1文本中的图C)。样品在室温下孵育1小时,主要抗体如下:小鼠抗维他明(1:100:英创,沃尔瑟姆,美国)和兔子抗泛细胞克林(1:100:英国剑桥的阿卡姆或大鼠抗E-卡德林(1:200;西格玛-奥尔德里希)。为了进行荧光显微镜检查,细胞在室温下用荧光标记的二级抗体对相应的宿主物种进行了1小时的治疗:山羊抗兔亚历克萨氟647(1:300:Abcam), 山羊反鼠标亚历克萨氟 568 (1:300;英异激素),山羊抗鼠亚历克萨氟647(1:200:阿卡姆)。DAPI 被纳入最后 10 分钟的孵化,然后与 PBS 一起清洗。所有原发性和次要抗体在阻塞溶液中稀释。最后,在每口井中加入 1 mL 的 PBS,并在成像前将板储存在 4°C。我们的测量表明,刚度对免疫细胞化学测定中使用的荧光标签的光学特性影响微乎其微(如S8 Text所述)。

图像采集

为了评估细胞对不同 ECM 蛋白质的粘附性,使用直立的表观荧光显微镜 Axio 成像器 Z2(德国蔡司)获得图像,其干燥 EC 计划-新流 5×/0.16 目标。为了研究基板刚度的效果,使用倒置共聚焦激光扫描显微镜(LSM 880,德国卡尔蔡司)进行了高放大成像,配备了油浸计划-阿波奇罗马特40×/1.3目标透镜。沾染DAPI的细胞核通过405纳米激光在激发下成像,发射过滤器调整为411-494纳米。WGA-FITC 对通过 491–544 nm 带通滤波器收集的 488 nm 激光和辐射感到兴奋。维门汀对561纳米激光感到兴奋,发射带通过滤器在568-620纳米范围内。泛细胞克拉汀和E-cadherin的所有图像都是在633纳米激光的激发下获得的,发射在638-755纳米范围内被检测到。为了避免信号重叠,每个荧光镜都按顺序进行成像,在通道之间进行帧转换。每个井中随机选择 9–15 个视场进行图像采集。细胞密度是根据同一系统获得的具有干燥计划-阿波奇罗马特10×/0.45目标的图像计算的。

图像分析和细胞分割

包含来自细胞膜和核信号的获取图像在 ImageJ v2.0.0 中预处理并细分[50]。通过带内核σ的高斯过滤器(0.25um)进行降噪。颜色阈值应用于将细胞和核从背景中分离出去,然后手动分割相邻的细胞,以确保最高精度。图像中未完全存在的细胞或与其他细胞重叠的细胞被排除在进一步的单细胞分析之外。但是,在计算上下文测量(如单元格邻居的数量或共享边界的长度)时,会考虑这些因素。用蒙面细胞和核创建的图像用于从单个细胞中提取特征。完整的数据集包含 910 个单元格。S2 文本中的表 A 提供了每个条件的分段单元件的确切数。

功能提取

使用 CellProfiler 3.1.8 软件[51]执行自动功能提取。使用细胞Profiler的内置插件获得细胞和细胞核形状、上下文测量、DNA强度和质地、膜、细胞素和葡萄干素的测量。首先,从数据集中删除了零方差和绝对像素坐标的变量。设计了其他特征,如细胞极性测量(细胞中心及其核之间的距离)、核细胞质比(细胞核和细胞质区域的比例)和边缘定位荧光信号的分数。具体来说,在整个论文中,我们提到细胞横截面区域标准化的总氟化物强度为平均强度。同样,平均边缘强度表示从按细胞周界正常化的边界像素捕获的氟化物强度。沿细胞边缘捕获的总细胞荧光信号的分数计算为总边缘强度/总细胞强度* 100。

总体而言,每个描述其形态和背景的细胞(S2文本中的表 B)计算了 150 个测量值。此外,根据染色组,还获得了140个测量结果,描述了细胞素和葡萄干发出荧光信号的强度和分布,并进行了69次描述E-cadherin表达的测量结果。

分层聚类

在进一步分析之前,所有功能都进行了标准化,从每个列中减去均值并将其除以标准偏差(z-score 常态化)。这允许将所有功能与同等权重考虑在内,无论变量的规模和性质如何。

使用集群有效性指数来估计数据集中的集数。此过程通过随机对 30% 的数据进行子采样,并重复了 30 次。两个替代指数,即剪影得分[52]和戴维斯-布尔丁指数[53],支持数据集中存在 2 到 3 个集群。考虑到集群的有效性指数并检查分层聚类的结果,我们得出结论,细胞表现出3种一般形态。

利用所有150个形态和上下文特征,对细胞的整个种群进行聚集分层聚类,这些特征会递归合并,但差异最小。输出显示为凹陷图。

功能选择

我们用 Pearson 的相关系数> 0.8 执行迭一功能选择去除功能。因此,50 个功能被排除在外,其余 100 个功能用于评估集群可分离性并培训随机森林模型。

统计分析

在细胞粘附研究中,我们计算了斯皮尔曼的排名相关系数,以确定蛋白质浓度与附着细胞数量之间的关联。为了识别与基板刚度值相关的细胞特性,我们计算并比较了斯皮尔曼和肯德尔的排名相关系数以及距离相关性(54)的结果,这些结果可以同时捕获单调和非单调关系。对于功能选择,我们只考虑了皮尔逊相关性。使用相互信息标准识别与集群编号和单元块相关的特征。条图显示均值和错误条表示标准偏差,除非另有说明。值的分布使用盒绘图显示,其中一个框表示中值,第一和第三夸脱,胡须表示中位数 +/-1.5 * IQR。平均值和比例的置信区间均按 95% 的水平计算。

使用未修复的双尾学生 t 测试来评估统计可辨识性,并使用 Welch 对不平等方差的更正进行评估。统计学意义报告如下:*p值< 0.05,**p值<0.01和**p值<0.001。

所有实验都复制了三次,每个样本中,有九到十二个部分被共焦显微镜随机选择和捕获。

随机森林分类模型

随机森林分类器用于根据选定的 100 个形态和上下文特征预测细胞变形。数据集被分成培训和测试组,其中 10% 的数据用于模型评估。使用 K 折交叉验证的随机搜索进行超参数调优,以优化模型参数并实现最佳结果。使用 F 评估模型的性能1分数(精度和召回的加权平均值),由于类的大小不平等。

在西里科分析中

更新的临床数据和样品基因组信息TCGA-BRCA样本是从基因组数据共享(https://portal.gdc.cancer.gov/)获得。所有数据分析,包括基因表达、突变、拷贝数变异 (CNV) 和 Pearson 的相关系数,均在 R 程序(版本 3.4.0) 下使用 TCGAbiolinks 和生物导体包进行。本分析中使用的 ECM 签名(18 个基因)和经典 EMT 签名(14 个基因)根据先前的研究[385556]进行分析和选择。医学论文发表-

支持信息

Experimental details.

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S1 文本。实验细节。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.s001

(文档)

S2 文本。基于多参数的基于图像的细胞分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.s002

(文档)

S3 文本。单细胞配置文件的探索性数据分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.s003

(文档)

S4 文本。分层聚类。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.s004

(文档)

S5 文本。生物标志物的表达。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.s005

(文档)

S6 文本。64 kPa的多细胞集群分析。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.s006

(文档)

S7 文本。ECM 刚度和 EMT 签名之间的相关性。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.s007

(文档)

S8 文本。荧光量子产量与微环境刚度。

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009193.s008

(文档)

确认

我们感谢胡海伦博士为对协聚焦显微镜的接触提供了便利。我们感谢约翰·洛克博士在数据分析方面进行讨论和协助。

引用

00001. 1.布雷 F, 费莱 J, 索约马塔拉姆 I, 西格尔 RL, 托雷拉, 杰马尔 A. 全球癌症统计数据 2018: GLOBOCAN 估计全球 36 癌症的发病率和死亡率在 185 个国家.卡癌症 J 克林。2018;68(6):394–424.下午:30207593

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· 谷歌学者

00002. 2.Nguyen DX, 博斯 Pd, 马萨古 J. 转移: 从传播到器官特定的殖民化。纳特 · 雷夫癌症2009;9(4):274–84.下午:19308067

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00003. 3.登克特 C, 利德特克 C, 图特 A, 冯明克维茨 G. 分子变化在三阴性乳腺癌 - 通往新的治疗策略的道路。柳叶刀2017;389(10087):2430–42.下午:27939063医学论文发表-

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00004. 4.福尔克斯 Wd. 三阴性乳腺癌。N 恩格尔 J Med. 2010;363 (20): 1938–48.下午:21067385

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00005. 5.利德特克 C, 马祖尼 C, 赫斯 Kr, 安德烈 F, 托代 A, 梅佳贾, 等等。对新辅助疗法的反应和三阴性乳腺癌患者的长期生存。J 克林 · 奥科尔2008;26(8):1275–81.下午:18250347

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· 谷歌学者

00006. 6.页 S.乳腺癌中二次生长的分布。柳叶刀1889;133(3421):571–3.

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· 谷歌学者

00007. 7.菲德勒·伊杰癌症转移的发病机能:重新审视"种子和土壤"假说。纳特 · 雷夫癌症2003;3.

· 查看文章

· 谷歌学者

00008. 8.高 Y ,巴多一,王 H ,张 W ,罗森 JM ,张 XHF 。转移组织主义:重新定义和谐土壤。第49卷,发育细胞。2019. p. 375-91.下午:31063756

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00009. 9.康 Y, 西格尔 Pm, 舒 W, 德罗布尼亚克 M, 卡科宁 Sm, 科尔登 - 卡多 C 等。一个多基因程序,调解乳腺癌转移到骨骼。癌细胞。2003;3(6):537–49.下午:12842083

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00010. 10.黄瑞杰, 吉尔福德 P, 蒂里 Jp 。上皮-间质过渡期间细胞粘附和极性的早期事件。J 细胞科学 2012;125 (19):4417–22.下午:23165231

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00011. 11.叶X,温伯格上皮-美森奇尔可塑性:癌症进展的中央调节器。趋势细胞生物 2015;25 (11): 675–86.下午:26437589

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00012. 12.尼托 · 马、 黄瑞杰、杰克逊 · 拉亚、蒂埃里 · 杰普。埃姆特: 2016.细胞。2016;166(1):21–45.下午:27368099

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· 酒吧/国家比医学论文发表-

· 谷歌学者

00013. 13.马萨古 J, 奥贝瑙夫 AC. 通过循环肿瘤细胞转移殖民化。自然界。2016;529(7586):298–306.下午:26791720

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· 谷歌学者

00014. 14.波尔塔韦茨五世,科奇特科娃M,皮特森SM,塞缪尔女士。细胞外基质及其分子和细胞调节器在癌细胞可塑性中的作用。正面肿瘤。2018;8:1–19.下午:29404275

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00015. 15.袁 S ,诺加德 RJ ,斯坦格 BZ 。癌症中的细胞可塑性。癌症迪斯科夫2019;9(7):837–51.下午:30992279

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00016. 16.耶茨CC,谢泼德CR,斯托兹DB,威尔斯A.与肝细胞共同培养人类前列腺癌细胞导致E-卡德林的表达增加。布尔 J 癌症。2007;96(8):1246–52.下午:17406365

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· 谷歌学者

00017. 17.赵 Yl, 谢泼德 Cr, 威尔斯 A. 乳腺癌细胞在中耳到上皮恢复过渡期间重新表达 E - 卡德林。莫尔癌症2010;9:1–18.下午:20051109

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00018. 18.奥凯奇 K, 石井 G, 大崎 Y, 山口 Y, 石田 T, 吉田 J, 等等。在转移性肿瘤形成的早期阶段,与上皮-发痒过渡和随后的中性上皮过渡相关的动态分子变化。癌症2011;128(7):1585–95.下午:20533280

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00019. 19.德鲍格尼斯 M, 桑切斯 - 达尼斯 A, 罗里夫 S, 拉斐尔 M, 利亚格雷 M, 父 M, 等人 Yap 和 Taz 是基础和鳞状细胞癌启动的必不可少的。EMBO 代表 2018;19 (7):1–12。下午:29875149

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00020. 20.帕斯图申科一,布兰帕因C.EMT过渡状态期间肿瘤进展和转移。趋势细胞生物 2019;29 (3): 212–26.下午:30594349

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· 谷歌学者

00021. 21.乌尔里希·塔,德胡安·帕尔多·埃姆,库马尔·斯。细胞外基质的机械刚性调节胶质瘤细胞的结构、移动性和增殖。癌症 Res. 2009;69 (10): 4167–74.下午:19435897

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00022. 22.魏SC ,胖 L ,蔡 JH 。矩阵僵硬通过 TWIST1– G3BP2 机械转移通路驱动上皮-机械过渡和肿瘤转移。纳特细胞生物 2015;17 (5): 678–88.下午:25893917

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· 谷歌学者

00023. 23.赖斯 · 阿杰、科尔特斯 E 、拉霍夫斯基 D 、张 Bch 、卡里姆 · 萨、莫顿 · Jp 等人。矩阵僵硬诱导上皮-发痒过渡,促进胰腺癌细胞的化学耐受性。发生。2017;6(7):1–9.下午:28671675

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00024. 24.马特· Bf、 库马尔 A、 普拉科内 Jk 、 扎内拉 Vg 、 马丁斯 Md 、 恩格勒 Aj 等。矩阵僵硬机械条件 EMT 和口腔鳞状细胞癌的迁移行为。J 细胞科学 2019;132 (1).下午:30559248

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00025. 25.埃斯波西托 M, 蒙达尔 N, 格雷科 Tm, 魏 Y, 斯帕达齐 C, 林 Sc, 等等。骨血管利基E-选择素诱导癌细胞的脑上皮过渡和Wnt激活,以促进骨转移。纳特细胞生物 2019;21 (5): 627–39.下午:30988423医学论文发表-

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00026. 26.古勒 A、 罗佐娃五世、库施内鲁斯一世、哈比尔 Z 、纳多特 A 、加西亚 - 本内特 A 等人。组织工程模型的肝癌微转移显示宿主依赖殖民模式和药物反应。比奥里希夫2020;

· 查看文章

· 谷歌学者

00027. 17M吴P-H、吉尔克斯·马克、菲利普·JM、纳卡尔·阿、程TW-T、马尔坎德·J等人。单细胞形态编码转移潜力。科学广告 [互联网] 。2020年1月 [引用2021年3月23日]:6(4)。提供自: https://advances.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/sciadv.aaw6938下午:32010778

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00028. 28.凯塞多 Jc, 库珀 S, 海格沃 F, 沃查尔 S, 邱 P, 莫尔纳 C, 等等。基于图像的细胞分析数据分析策略。纳特方法。2017;14(9):849–63.下午:28858338

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00029. 29.罗班 Mh, 阿巴斯 Hs, 辛格 S, 木匠 Ae 。通过数据融合捕获单细胞异质性可改善基于图像的分析。纳特公社2019;10(1):1–6.下午:30602773

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· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00030. 30.布莱斯 Ns, 失败 Tw, 斯特恩 Jr, 贝克 K, 扎勒 S, 阿尔扎耶娃 Y, 等人。 无偏见化学扰动的高含量成像显示, 表型可塑性的行为细胞细胞克尔顿是受约束的。细胞 Syst. 2019 11月;9 (5): 496–507.e5.下午:31606369

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00031. 31.格里斯 Bt, 洛 Ds, 萨欣 N, 克劳斯奥兹, 莫里斯 Q, 布恩 C, 等等。用于表型分析的机器学习和计算机视觉方法。J 细胞生物 2017;216 (1):65–71。下午:27940887

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00032. 32.屠夫 Dt, 阿利斯顿 T, 韦弗 Vm 。紧张局势:迫使肿瘤进展。纳特 · 雷夫癌症2009;9(2):108–22.下午:19165226

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00033. 33.塔图洛 M, 马雷利 M, 法利西 G, 拉斯泰利 C, 帕尔米耶里 F, 加加里 M, 等等。组织培养板和细胞外基质对间质干细胞行为的机械影响:局部回顾。INT J 免疫帕托药物。2016年3月;29日(1):3–8。下午:26612837

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00034. 34.麦地那SH,布什B,凸轮M,塞夫奇克E,德尔里奥FW,南迪K等。乳腺癌基板刚度与化疗反应之间的机械遗传联系。生物材料。2019:202(2018年11月):1–11。下午:30818087

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00035. 35.莱菲尔德 Lj, 埃塞布阿 M, 弗雷泽 Sr, 锤子 Rd, 比文 Ww, Nguyen V, 等等。泌尿细胞学标本中核/细胞质比率评估的准确性和可重复性。诊断细胞病。2017;45(2):107–12.下午:28110502

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00036. 36.库尔蒂迪斯 A, 卢 R, 彭斯 Lj, 阿纳斯塔西亚迪斯 Pz 。卡德林在癌症中信号的核心作用。Exp 细胞 Res. 2017:358 (1):78–85.下午:28412244

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00037. 37.杨 J , 安提恩 P , 百思 G , 布兰潘 C , 布拉布莱茨 T , 布朗纳 M 等。上皮-中度过渡研究的指南和定义。纳特牧师莫尔细胞生物 2020;下午:32300252

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00038. 38.谭TZ,米奥QH,三木Y,野田T,森S,黄瑞等。上皮-脑质过渡光谱定量及其在破译癌症患者生存和药物反应方面的有效性。2014年EMBO莫尔·梅德:6(10):1279-93。下午:25214461医学论文发表-

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00039. 39.德瓦拉伊五世,Bose B. EGF 诱导的上皮到梅森奇马尔过渡中的形态状态过渡动力学。J 克林 Med. 2019 六月 26:8 (7):911.下午:31247884

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00040. 40.萨杜 · 克, 佩尼奇, 伊格利什 A, Ns 州长。在弯曲膜蛋白和活性细胞细胞细胞力的存在下模拟细胞扩散和运动性出现。欧洲物理 J 加。2021年5月;136(5):495。

· 查看文章

· 谷歌学者

00041. 41.张 SS , 强奸广告 , 黄 SA , 郭 W - H , 王 Y - L 。迁移调节细胞机械状态。莫尔生物细胞。2019年12月 15:30 (26):3104–11.下午:31693433

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00042. 42.加西亚 S, 汉内佐 E, 埃尔盖蒂 J, 乔安妮 J - f, 西尔伯赞 P, 州长 Ns 。单层中集体细胞运动期间主动干扰的物理原理。2015年12月15日;112(50):15314-9。下午:26627719

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00043. 43.拉瓦西奥 A, 勒阿普, 锯 Tb, 塔勒 V, 翁 Ht, 贝尔托奇 C, 等等。通过调整细胞基材粘附来调节上皮细胞组织。Integr Biol. 2015;7 (10): 1228–41.下午:26402903

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00044. 44.萨里·D、帕拉西奥斯·J、赫格塔-雷东多·M、戈麦斯-洛佩斯·G、卡诺·阿、莫雷诺-布埃诺G.侵入性乳腺癌细胞中E-和P-卡德林的功能特征。BMC 癌症。2009;9:1–14.下午:19118499

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00045. 45.莫雷诺-布埃诺G、佩纳多H、莫利纳P、奥尔梅达D、库比略E、桑托斯五世等人。上皮到发音过渡的形态和分子特征。纳特普罗托克2009;4(11):1591–613.下午:19834475

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00046. 46.Aceto N、 Bardia A、 宫本 Dt、 唐纳森麦克、维特纳 Bs 、斯宾塞 Ja 等循环肿瘤细胞簇是乳腺癌转移的寡头细胞前体。细胞。2014年8月;158(5):1110–22。下午:25171411

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00047. 47.乔利 · Mk、 博阿雷托 M 、 德贝布 · Bg 、阿塞托 N 、法拉赫 - 卡森 · 麦克、伍德沃德 · 瓦等人。炎症性乳腺癌:研究基于群集传播的模型。恩普杰乳腺癌2017年12月:3(1):21。

· 查看文章

· 谷歌学者

00048. 48.库克DP,范德海登BC。EMT转录响应的上下文特异性。纳特公社2020年5月1日:11(1):2142。下午:32358524

· 查看文章

· 酒吧/国家比

· 谷歌学者

00049. 49.Karacosta LG, Anchang B, Ignatiadis N, Kimmey SC, Benson JA, Shrager JB, et al. Mapping lung cancer epithelial-mesenchymal transition states and trajectories with single-cell resolution. Nat Commun. 2019 Dec 6;10(1):5587. pmid:31811131

· View Article

· PubMed/NCBI

· Google Scholar

00050. 50.Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Vol. 9, Nature Methods. 2012. p. 676–82. pmid:22743772

· View Article

· PubMed/NCBI

· Google Scholar

00051. 51.McQuin C, Goodman A, Chernyshev V, Kamentsky L, Cimini BA, Karhohs KW, et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLOS Biol. 2018;16(7):1–17. pmid:29969450

· View Article

· PubMed/NCBI

· Google Scholar

00052. 52.Rousseeuw PJ. Silhouettes: A graphical aid to the interpretation and validation of cluster analysis. J Comput Appl Math. 1987;20:53–65.

· View Article

· Google Scholar

00053. 53.Davies DL, Bouldin DW. A Cluster Separation Measure. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 1979;PAMI-1(2):224–7. pmid:21868852

· View Article

· PubMed/NCBI

· Google Scholar

00054. 54.什凯利 · 吉, 里佐 · 姆勒, 巴基罗夫 · 恩克通过距离相关性测量和测试依赖性。安统计 2007 年 12 月 1:35 (6)。

· 查看文章

· 谷歌学者

00055. 55.温斯洛 S, 利安德森 K, 埃德斯杰 A, 拉尔森 C. 乳腺癌的预后频闪基因特征。乳腺癌 Res. 2015;17 (1): 1–13.下午:25848820

· 查看文章

· 酒吧/国家比医学论文发表-

· 谷歌学者

00056. 56.温斯洛 S, 林德奎斯特 Ke, 埃德斯杰 A, 拉尔森 C.产生基质的肿瘤频闪的表达模式在乳腺癌中具有预后意义。BMC 癌症。2016;16(1):1–13.下午:27809802

· 查看文章

· 酒吧/国家比

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